Analisi computerizzata del liquido seminale (CASA)(CASA)

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 168-172)

essenziali al concepimento

4.5 Analisi computerizzata del liquido seminale (CASA)(CASA)

4.5.1 Utilizzo del CASA per valutare la motilità degli spermatozoi

4.5.1.1 Premessa

I sistemi CASA sono i più utilizzati per l’analisi della cinetica degli spermatozoi, poi-ché possono rilevare e analizzare le cellule mobili. Le stime della percentuale di motilità possono essere però inaffidabili, poiché dipendono dalla determinazione del numero di spermatozoi immobili e dal fatto che i detriti possono essere confusi con questi ultimi.

Molti fattori influenzano le prestazioni degli strumenti CASA, per esempio, la pre-parazione del campione, la frequenza dei fotogrammi, la concentrazione degli sper-matozoi e la profondità della camera di conteggio [45, 46, 136, 309, 310]. Tuttavia, è possibile ottenere risultati affidabili e riproducibili se si seguono procedure ap-propriate [309]. Le linee guida sull’uso del CASA [311, 312] dovrebbero essere con-sultate e tutto il personale dovrebbe essere adeguatamente formato all’uso delle apparecchiature CASA per conoscerne i punti di forza e di debolezza.

Quando si usa CASA per ottenere i parametri di movimento, si devono analizza-re le tracce di almeno 200 spermatozoi mobili per campione. Questo implica che dovranno essere rilevati molti più spermatozoi. Se gli spermatozoi devono essere classificati per tipo di movimento, o se sono previste altre analisi di variabilità all’in-terno di un campione, saranno necessarie le tracce di almeno 200, e se possibile 400, spermatozoi mobili.

Lo strumento CASA dovrebbe essere collegato a un software che permetta l’or-ganizzazione dei dati e l’analisi statistica. Le distribuzioni di molti dei parametri di movimento non sono gaussiane; la mediana, piuttosto che la media, è quindi più ap-propriata come sintesi della tendenza centrale di ogni variabile. Le misurazioni sui singoli spermatozoi possono aver bisogno di essere trasformate matematicamente prima di effettuare analisi statistiche.

4.5.1.2 Procedura

Ogni unità CASA deve essere installata correttamente per garantire un funziona-mento ottimale. I produttori indicano impostazioni specifiche, ma gli utenti dovreb-bero verificare che lo strumento funzioni entro il grado richiesto di affidabilità e riproducibilità. L’uso di materiali QC adeguati, come le registrazioni video, è essen-ziale (Sezione 8.6.2, p. 235). Alcuni autori hanno esaminato i sistemi CASA nei loro lavori [46, 309, 312-314].

4.5.1.3 Preparazione del campione di spermatozoi

I campioni di liquido seminale per CASA devono essere raccolti e preparati come de-scritto nel Capitolo 2. Il sistema CASA deve mantenere il campione a una tempera-tura stabile di 37°C, poiché il movimento degli spermatozoi è particolarmente sensi-bile ai cambiamenti di temperatura. Le caratteristiche di motilità e la concentrazione di spermatozoi possono essere valutate nell’eiaculato non diluito, a condizione che

4. Esamiavanzati

ne2. Esame di base 3. Esame esteso 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

non ci sia un eccesso di detriti o di altri contaminanti. La motilità degli spermatozoi può essere calcolata su campioni con concentrazione di spermatozoi da 2×106/ml a 50×106/ml [102], a seconda del sistema CASA. Gli errori possono spesso verificarsi in campioni con un’elevata concentrazione di spermatozoi (per esempio, superiore a 50×106/ml). Tali campioni devono essere diluiti, preferibilmente con liquido seminale dello stesso paziente. Se si tratta di un’analisi di liquido seminale grezzo:

1. centrifugare una parte del campione di eiaculato ad alta velocità (fino a 16.000 g o al massimo disponibile) per 6 minuti per ottenere il plasma seminale privo di spermatozoi;

2. diluire il campione di eiaculato nativo con plasma seminale puro per raggiungere una concentrazione inferiore a 50×106/ml.

Va notato che questo può ancora modificare le proprietà degli spermatozoi; quindi, i parametri di motilità che sono governati da effetti fluidodinamici (viscosità, viscoe-lasticità) o altri fattori ambientali potrebbero essere soggetti ad alterazioni.

Le camere di conteggio monouso con una profondità di 20 µm forniscono risultati di motilità affidabili, e di solito dovrebbero essere conteggiate due camere. Inoltre, dovrebbero essere analizzati diversi campi visivi rappresentativi. Come la scelta esatta di questi campi influenzi i risultati non è stato studiato in dettaglio. Tuttavia, i campi dovrebbero attraversare l’area della camera, e i sistemi suggeriscono che un’analisi minima di sei campi visivi per camera (12 campi in totale) possa dare solitamente un risultato affidabile. Se possibile, almeno 200 spermatozoi mobili dovrebbero essere valutati in ogni camera. Principi simili di QC sono usati come valutazione standard della motilità (Sezione 2.4.6, p. 23). I campioni possono es-sere analizzati immediatamente o dopo la registrazione. L’analisi delle registrazio-ni si presta a una migliore standardizzazione e a procedure di QC (Sezione 8.6.2, p. 235).

C’è un certo disaccordo sul tempo di osservazione degli spermatozoi per ottenere risultati accurati, ma almeno 1 secondo è sufficiente per le misurazioni CASA di base [46]. La durata dell’osservazione delle cellule natanti può avere un impatto significativo sui risultati [315]; i confronti tra analisi con tempi diversi devono essere fatti con cura.

4.5.1.4 Terminologia CASA

Alcune variabili standard misurate con i sistemi CASA, come mostrato in Figura 4.4, sono:

VCL, velocità curvilinea (µm/s): velocità media della testa dello spermatozoo lun-go la sua traiettoria curvilinea come osservato in due dimensioni al microscopio.

VSL, velocità rettilinea (µm/s): la velocità calcolata lungo una linea retta tra il primo e l’ultimo punto del percorso.

VAP, velocità media della traiettoria (µm/s): la velocità media calcolata lungo la traiettoria media. Questa traiettoria viene calcolata arrotondando la traiettoria curvilinea secondo gli algoritmi del sistema CASA; questi algoritmi variano a se-conda della strumentazione, quindi i valori potrebbero non essere comparabili tra i sistemi o con diversi parametri di acquisizione come la frequenza dei fotogram-mi (framerate).

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ALH, ampiezza dello spostamento laterale della testa (µm): la grandezza dello

spostamento laterale della testa dello spermatozoo lungo la sua traiettoria me-dia. ALH è spesso espresso come il valore massimo o medio di tali spostamenti.

Diversi sistemi CASA calcolano l’ALH usando differenti algoritmi, quindi i valori potrebbero non essere comparabili.

MAD, spostamento angolare medio (gradi): valori assoluti della media dell’angolo di curvatura della testa dello spermatozoo lungo la sua traiettoria curvilinea. Va notato che questo non misura l’angolo di rotazione della direzione in cui punta la testa dello spermatozoo.

Altre misure, comunemente usate, sono derivate dal calcolo di queste cinque

variabili:

LIN, linearità: linearità di una traiettoria curvilinea (velocità in linea retta/veloci-tà curvilinea);

WOB, oscillazione: misura dell’oscillazione della traiettoria lungo la traiettoria media (velocità media del percorso/velocità curvilinea);

STR, rettilineità: linearità della traiettoria media (velocità in linea retta/velocità media del percorso);

BCF, frequenza di battito (Hz): la frequenza media in cui la traiettoria curvilinea interseca la traiettoria media (tuttavia, va notato che il BCF ha dimostrato di non essere correlato alla frequenza dei battiti flagellari [316]);

D, dimensione frattale: la valutazione quantitativa delle proprietà di “riempi-mento dello spazio” delle curve su un piano [310].

Figura 4.4 Terminologia standard per le variabili misurate dai sistemi CASA

percorso in linea retta

spostamento angolare VSL

VCL ALH

centroidi

della testa tracciati

percorso curvilineo percorso

medio

VAP

Nota: Diversi strumenti CASA utilizzano diversi algoritmi matematici per calcolare molte di queste varia-bili di movimento. La comparavaria-bilità delle misurazioni tra tutti gli strumenti non è ancora nota.

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4.5.2 Utilizzo del CASA per valutare l’iperattivazione dello spermatozoo

L’iperattivazione è un importante fenomeno biologico dello spermatozoo umano che si manifesta attraverso la capacitazione (il processo di acquisizione della capacità di fecondare) e comprende un cambiamento comportamentale nella forma d’onda flagellare. L’iperattivazione è di solito caratterizzata da un aumento dell’ampiezza dei battiti flagellari, una diminuzione della frequenza dei battiti e un battito laterale non progressivo [317].

I complessi parametri del movimento flagellare degli spermatozoi iperattivati sono difficili da identificare in modo affidabile e inequivocabile attraverso l’analisi manua-le. Di conseguenza, gli autori hanno proposto diversi algoritmi e sistemi informati-ci per l’analisi quantitativa del movimento dei singoli spermatozoi per valutare gli stereotipi di motilità. Queste analisi si sono basate su quantità ottenute tracciando il movimento della testa [318, 319]. Le moderne capacità di calcolo permettono la valutazione simultanea dei parametri cinetici di migliaia di spermatozoi e la loro classificazione [320]. La misurazione diretta della forma d’onda flagellare può anche essere utilizzata per comprendere più accuratamente il cambiamento dei parametri cinematici durante l’iperattivazione [321].

4.5.3 Utilizzo del CASA per valutare la morfologia dello spermatozoo

L’analisi delle immagini ha la potenzialità di fornire avanzamenti considerevoli nella quantificazione, nell’obiettività e nella riproducibilità della valutazione morfologica dello spermatozoo. Sono disponibili sistemi commerciali per quantificare la morfo-logia della testa e del tratto intermedio dello spermatozoo, ed eventualmente del tratto principale. Tuttavia, i difetti della coda che influenzano la motilità possono essere valutati più direttamente utilizzando CASA per misurare la motilità e il mo-vimento. L’uso dei sistemi CASA per la valutazione morfologica si basa su un alto li-vello di standardizzazione e sulla qualità della colorazione delle cellule, con risultati facilmente distorti a causa della variazione della colorazione. Per questo motivo, i sistemi di colorazione automatizzati possono spesso essere un abbinamento oppor-tuno per la valutazione della morfologia con i sistemi CASA, che aiuta ad eliminare la variabilità dei risultati.

I sistemi di analisi morfologica automatizzati hanno il potenziale di una maggiore obiettività, precisione e riproducibilità rispetto ai sistemi manuali [95]. La precisione e la riproducibilità possono raggiungere almeno il 92% [322], che è superiore alla valutazione manuale da parte di un operatore esperto. La riproducibilità e l’accura-tezza dei risultati della valutazione morfometrica computerizzata degli spermatozoi (CASMA) può, tuttavia, essere compromessa da variabili metodologiche come la messa a fuoco, l’illuminazione, la preparazione del campione e la colorazione [323, 324] e da difficoltà tecniche nel differenziare correttamente le teste degli sperma-tozoi dai detriti seminali, in particolare quando la concentrazione degli spermasperma-tozoi è bassa [322, 324-326]. La natura della valutazione automatica significa che non c’è modo di compensare difetti artefatti della preparazione. Pertanto, piccole differenze nell’ombreggiatura del fondo rispetto alla colorazione delle cellule possono pro-durre una classificazione errata o l’impossibilità di identificare la cellula come uno spermatozoo, con una conseguente distorsione dei risultati.

Come per la valutazione manuale della morfologia, le procedure e gli strumenti devono essere standardizzati e il QC mantenuto per garantire risultati compara-bili e affidacompara-bili. Il liquido seminale può essere trattato come descritto nella sezione Eiaculati carichi di detriti o viscosi, p. 45 per ridurre il fondo per le registrazioni CASMA. Se la concentrazione di spermatozoi è bassa (< 2×106/ml), i campioni

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vranno essere concentrati mediante centrifugazione, come descritto nella sezione Eiaculati con bassa concentrazione di spermatozoi, p. 45. Tuttavia, va notato che la centrifugazione può influenzare la morfologia dello spermatozoo, e il suo uso deve essere registrato.

Due studi hanno riportato relazioni significative tra i risultati del CASMA e gli end-point di fertilità. Coetzee et al., 1999 [327] hanno dimostrato che i risultati normali dell’analisi automatizzata della morfologia spermatica sono predittori significativi sia dei tassi di fecondazione in vitro che della gravidanza. Garrett et al., 2003 [102]

hanno dimostrato che la percentuale di spermatozoi che mostravano una morfo-logia della testa tipica, di quelli che si legano alla zona pellucida (“zona-preferred”,

%Z), insieme alla velocità rettilinea (VSL) erano significativamente e indipendente-mente correlati ai tassi di gravidanza naturale in un ampio gruppo di coppie subfer-tili. Le relazioni sia della %Z che del VSL con la fertilità sembravano essere conti-nue, e non è stato identificato alcun valore soglia oltre il quale non vi è un ulteriore aumento del tasso di gravidanza. Sono necessari più studi sulla fertilità, così come sulla funzione e i disturbi dell’apparato riproduttivo maschile, in grandi popolazioni per perfezionare l’applicazione del CASA alla misurazione della morfologia degli spermatozoi.

I sistemi automatizzati possono essere utili per ottenere ulteriori dati di ricerca (anche su sottopopolazioni morfologiche di spermatozoi, integrità della membrana plasmatica, indice energetico dello spermatozoo) [328-330] e per i sistemi QC, ma sono necessarie ulteriori ricerche per dimostrare i loro benefici a fini clinici.

La mancanza di IQC può portare a un gran numero di errori CASA tra sistemi e la-boratori. Pertanto, è necessario standardizzare il processo e il QC per CASA [331].

Nonostante i risultati emergenti degli studi comparativi [332-337] non ci sono anco-ra abbastanza evidenze che consentirebbero l’uso di analisi computerizzate CASA nell’ampia pratica clinica.

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