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5.1

INTRODUZIONE

Le Carbonil reduttasi (CBR) sono una serie di enzimi appartenenti alla famiglia delle “short chain dehydrogenases/reductases” (SDR) [160,161], ad oggi una delle più grandi superfamiglie di enzimi conosciuta, con circa 46,000 membri al suo interno [162,163]. Le carbonil reduttasi catalizzano la riduzione NADPH-dipendente del gruppo carbonilico di un vasto numero di substrati endogeni e xenobiotici [164,165].

Tra gli effetti biologici più importanti legati all’elevata reattività del gruppo carbonilico (quale parte di gruppi funzionali chetonici o aldeidici di una molecola) c’è la capacità di provocare stress ossidativo o di reagire con macromolecole cellulari [166].

La capacità delle carbonil reduttasi di ridurre ad ossidrile (meno reattivo e più facilmente eliminabile) il gruppo carbonilico può quindi conferire a questi enzimi un importante ruolo nel limitare la tossicità e regolare gli effetti biologici di questi composti reattivi [167]. Un’ulteriore conferma dell’importanza di questi enzimi è il fatto di essere stati isolati in organismi molto diversi fra loro e lontani sulla scala evolutiva. La presenza di carbonil reduttasi è stata infatti riportata in piante [168], batteri [169,170], lieviti [171,172], insetti [173], pesci [174] e mammiferi, tra i quali l’uomo [175,176], il ratto [177,178], il topo [177,179,180], la scimmia [179,181], il pollo [182,183]. Nell’uomo inoltre l’enzima è stato individuato in tutti i tessuti anche se questi possono mostrare un’ampia escursione dei livelli di espressione [184,185]. In particolare sono state individuate tre diverse carbonil reduttasi: la carbonil reduttasi 1 (CBR1), la carbonil reduttasi 3 (CBR3) e la carbonil reduttasi 4 (CBR4) [166]. Delle tre la CBR1 risulta essere la più studiata e la più importante per quanto riguarda il ruolo attribuito alle carbonil reduttasi. Le tre CBR sono infatti differenti sotto diversi aspetti che vanno dalla struttura quaternaria, alla localizzazione intracellulare e tissutale, fino allo spettro di substrati e alle costanti cinetiche. Nonostante la CBR1 e la CBR3 siano entrambe proteine monomeriche e citosoliche, e gli mRNa di entrambe siano espressi ubiquitariamente, i pattern di espressione dei due geni relativi sono molto diversi: elevati livelli di mRNA

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per CBR1 sono stati rilevati nel fegato e nel rene, mentre elevati livelli del secondo (CBR3) nel pancreas e nell’ovario [166,186]. La CBR4 è invece una proteina tetramerica con localizzazione intracellulare a livello della matrice mitocondriale e un pattern di espressione che sebbene sia simile a quello della CBR1, presenta livelli molto più bassi [187]. Ma ciò in cui CBR4 si discosta maggiormente da CBR1 e CBR3 è lo spettro di substrati verso cui mostra attività catalitica. A dispetto del nome infatti la CBR4 non mostra attività reduttasica verso composti carbonilici diversi dai chinoni [187,188]. Sebbene inferiore, differenze nello spettro dei substrati sono visibili anche tra CBR1 e CBR3, molto più ridotto in quest’ultima che presenta spesso anche un’attività catalitica inferiore se paragonata a quella della CBR1 [186,189]. Non sono stati infatti individuati substrati endogeni per la CBR3 ad eccezione dell’isatina [189]. Queste differenze tra CBR1 e CBR3 sono in contrasto con l’elevatissimo grado di identità riscontrato a livello amminoacidico, che oscilla tra il 72% e il 79%. Miura et al. hanno proposto l’esistenza di due regioni a bassa omologia per spiegare queste differenze, una in prossimità del sito catalitico ed una nella regione di legame del substrato [190].

5.2

CARBONIL REDUTTASI 1 (CBR1)

La CBR1 è stata la prima delle carbonil reduttasi ad essere stata individuata. È stata isolata nel 1973 da un estratto di cervello umano ed è stata inizialmente descritta come una aldeide reduttasi [191]. Solo nel 1981 si arrivò a caratterizzarlo in modo più completo e si individuò l’ampio spettro di substrati carbonilici, ciò comportò un ricollocamento dell’enzima come carbonil reduttasi. L’enzima è citosolico ed è costituito da un unico monomero di 277 amino acidi con un peso molecolare di 30,375 Da [192]. Presenta principalmente attività reduttasica NADPH-dipendente su un’ampia gamma di substrati carbonilici endogeni ed esogeni [193,194]. Tra questi vi sono prostaglandine, steroidi, pterine, aldeidi biogene, chinoni, cheto-aldeidi e aldeidi aromatiche, ma anche farmaci chemioterapici quali le antracicline [193,194].

Attraverso tecniche di colorazione immunoistochimica è stata individuata la presenza di CBR1 in tutti i tessuti con ampie differenze nei livelli di concentrazione. L’elevata

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concentrazione nei tessuti esposti all’azione di sostanze xenobiotiche (fegato, epitelio del tratto gastrointestinale, epidermide [195]) insieme alla riportata attività reduttasica nei confronti di queste ultime, suggerisce che CBR1 giochi un ruolo importante nella detossificazione di composti xenobiotici partecipando alla fase 1 (fase di funzionalizzazione) del loro metabolismo.

5.2.1 SUBSTRATI DELLA CBR1

5.2.1.1 CHINONI

Tra i substrati della CBR1 i chinoni risultano essere i migliori, il 9,10-fenantrene chinone e il menadione ne sono esempi [193,196,197]. I chinoni sono degli “accettori di Michael” e alcuni sono potenti agenti redox, in grado perciò di alchilare proteine e acidi nucleici e di causare stress ossidativo [198]. Questo rende i chinoni delle molecole potenzialmente pericolose e tossiche per le cellule, che possono quindi difendersi attraverso sistemi enzimatici. I chinoni possono infatti essere ridotti attraverso un sistema ad uno o a due elettroni, portando rispettivamente alla formazione di semichinoni radicalici e di composti diidrossi-aromatici (fig.17).

Fig.17 Riduzione del fenantrene chinone

Via ad un elettrone Via enzimatica a 2 elettroni Semiquinone radicalico CBR1 O2- ● O2 2O2- ● 2O2

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I due prodotti hanno un valore molto diverso, poiché mentre la prima via ad un elettrone porta alla formazione di un composto di per sé tossico e potenzialmente in grado di tornare indietro a chinone, la seconda via enzimatica a due elettroni porta alla formazione di un idrochinone, una molecola non tossica che può essere facilmente coniugata ed eliminata [199,200]. Questa via enzimatica di cui fa parte CBR1 rappresenta cosi una valida via di detossificazione e riduce i rischi legati alla produzione di specie radicaliche entrando in competizione con la prima via ad un elettrone [196]. La CBR1 non è comunque l’unico enzima in grado di ridurre i chinoni ad idrochinoni, altri enzimi come NQO1 e 11β-HSD1 partecipano alla via di riduzione a due elettroni [201]. Tuttavia alcuni studi suggeriscono che la CBR1 giochi un ruolo maggiore nella detossificazione di questi composti [196,197,199].

5.2.1.2 NNK

Tra i prodotti della combustione del tabacco un particolare gruppo di nitrosamine (specifiche del tabacco) è tra i maggiori responsabili dell’insorgenza del cancro nei fumatori. Tra queste la più importante è il 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1- butanone (NNK) [202,203,204]. La NNK può andare incontro a due destini diversi sulla base della via metabolica che imbocca. Ci sono infatti due vie che agiscono competitivamente sulla NNK, una via di attivazione del composto mediata dal citocromo P450, che porta alla formazione di un prodotto potenzialmente carcinogenico [205], e una via di detossificazione attraverso la riduzione (fig.18) della NNK a NNAL (4- (methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol) operata da una serie di enzimi tra i quali la CBR1, la 11β-HSD1 , la AKR1C1, la AKR1C2, la AKR1C4 [202,203]. Tra questi la CBR1 ha mostrato il più alto grado di efficienza enzimatica (Vmax /KM) per la NNK [202].

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Fig.18 Riduzione del gruppo carbonilico della NNK con formazione di NNLA.

5.2.1.3 ANTRACICLINE

Tra le varie molecole farmacologiche che rientrano nel largo spettro di substrati della CBR1 le antracicline, come la daunorubicina (DNR) e la doxorubicina (DOX), utilizzate per il trattamento delle neoplasie, sono le più largamente studiate [206,207,208,209]. Le due molecole presentano un gruppo chetonico in posizione 13 (fig.19) che può essere ridotto ad ossidrile, formando rispettivamente daunorubicinolo (DNRol) e doxorubicinolo (DOXol) [210].

Fig.19 Struttura molecolare della doxorubicina e della daunorubicina. Nella figura è indicato il gruppo chetonico in posizione 13 che può essere ridotto ad ossidrile dalla CBR1.

Questi prodotti presentano caratteristiche differenti dalle molecole di partenza poiché non solo possiedono una ridotta efficacia farmacologica antineoplastica [211], ma acquisiscono anche un certo grado di cardiotossicità con sviluppo di cardiomiopatie acute e croniche, attraverso un meccanismo ad oggi non chiaro [212,213]. L’utilità di queste

CBR1 NADPH

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molecole nel trattamento del cancro è inoltre limitato dall’insorgenza di farmacoresistenza nelle cellule tumorali [214]. Questa sembra essere legata non tanto ad un’alterazione dell’uptake del farmaco quanto alla sovraespressione degli enzimi che lo metabolizzano in risposta al loro utilizzo nella terapia [211]. Nonostante la CBR1 mostri una maggiore efficienza enzimatica (Vmax /KM) e una maggiore costante di specificità

(Kcat /KM) nei confronti della DNR rispetto alla DOX [215], risulta comunque un

elemento chiave nello sviluppo di fenomeni di farmacoresistenza e cardiotossicità da parte di entrambe le molecole [211,216,217].

5.2.1.4 SUBSTRATI ENDOGENI

La presenza ubiquitaria della CBR1 nei vari tessuti umani e il largo spettro di substrati endogeni indicano l’enzima come un potenziale elemento chiave di numerose funzioni biologiche. Tra i substrati endogeni ritroviamo infatti importanti mediatori dei processi infiammatori come le prostaglandine, cofattori enzimatici come le pterine, ma anche molecole chinoniche endogene e prodotti derivati dalla perossidazione lipidica. Recenti studi mostrano inoltre una spiccata tendenza dell’enzima a catalizzare la riduzione di molecole coniugate al glutatione [218,219,220], al punto che spesso rappresentano un substrato migliore della stessa molecola in forma non coniugata [193,221,222].

5.2.1.4.1 PROSTAGLANDINE

Le prostaglandine sono un gruppo di molecole prodotte a livello delle membrane cellulari in numerosi tessuti umani a partire dall’acido arachidonico [223]. Agiscono come messaggeri molecolari sulle cellule situate nelle immediate vicinanze del sito di produzione e sottendono ad un’ampia serie di potenti effetti fisiologici in quasi tutti i distretti corporei, tra i quali il sistema nervoso, il sistema cardiovascolare, il sistema respiratorio e quello digestivo [224].

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La CBR1 è in grado di catalizzare sia la riduzione che l’ossidazione di alcune prostaglandine. La riduzione NADPHdipendente della CBR1 è stata individuata verso la PGE1 e la PGE2, mentre non agisce sulla PGA1 a meno che non sia presente nella forma

di addotto con il glutatione [193]. La riduzione avviene sul cheto-gruppo in posizione 9 e produce la conversione della PGE2 nella forma antagonista PGF2α (fig.20) [193,225].

Questa attività catalitica risulta perciò sovrapponibile a quella della prostaglandina 9- cheto reduttasi [194,225].

L’ossidazione delle prostaglandine catalizzata dalla CBR1 comporta invece la formazione di prodotti biologicamente inattivi, ed è stata osservata per la PGE2, la PGF2α,

la PGD2 e PGB1 [225]. L’ossidazione, che avviene sull’ossidrile in posizione 15, produce

un gruppo chetonico e costituisce lo step più importante dell’inattivazione di questa molecola [226]. Pertanto la CBR1 viene anche chiamata 15-idrossi-prostaglandina deidrogenasi NADP+ dipendente [201].

Fig.20 Struttura molecolare della PGE2 e della forma antagonista PGF2α prodotta in seguito alla

riduzione del cheto-gruppo in posizione 9 ad opera della CBR1. In figura è riportato anche l’ossidrile in posizione 15, che può essere ossidato dalla CBR1 a gruppo chetonico, producendo una molecola biologicamente inattiva.

L’attività reduttasica e deidrogenasica della CBR1 nei confronti delle prostaglandine non sembra però avere un significativa rilevanza fisiologica e ciò è dovuto alle costanti di specificità misurate in vitro molto più basse se confrontate con i migliori substrati chinonici [225,226].

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5.2.1.4.2 ALDEIDI REATTIVE

Sotto condizioni di stress ossidativo diverse molecole, tra le quali aldeidi estremamente reattive, possono essere generate da fenomeni di perossidazione lipidica. Uno dei maggiori prodotti di questo evento [227,228], derivato da acidi grassi polinsaturi ω-6, è il 4-oxononenale (4-ONE), il quale, a causa della sua elevata reattività, è in grado di modificare il DNA e le proteine [229,230].

La CBR1 è in grado di catalizzare la riduzione del 4-ONE con una costante di specificità (Kcat /KM) elevata [219], il che suggerisce un ruolo importante nel metabolismo e nella

detossificazione di questa molecola.

La riduzione del 4-ONE è operata anche da enzimi appartenenti alle aldo-keto reduttasi, in particolare AKR1B1 e AKR1B10, le quali però riducono selettivamente il gruppo aldeidico della molecola [231].

La CBR1 mostra invece la capacità di ridurre non solo il gruppo aldeidico, ma anche il gruppo chetonico e sorprendentemente il doppio legame tra il carbonio 2 e il carbonio 3 [219]. Ciò porta alla formazione di tre differenti composti, rispettivamente: 1-idrossinon- 2-en-4-one (1-HNO); 4-idrossi-2-nonenale (4-HNE); 4-oxononanale (4-ONA) (fig.21).

Fig.21 Riduzione del 4-ONE ad opera della CBR1. La possibile riduzione a livello del gruppo aldeidico, del gruppo chetonico e del doppio legame, porta rispettivamente alla formazione di 1- idrossinon-2-en-4-one (1-HNO), 4-idrossi-2-nonenale (4-HNE) e 4-oxononanale (4-ONA)

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Attraverso l’analisi dei prodotti Doorn et al. hanno calcolato che l’attività predominate della CBR1 nei confronti del 4-ONE è quella di riduzione del gruppo chetonico con conseguente produzione di 4-HNE fino al 70% del prodotto totale. Nello stesso studio è stato verificato che né il 4-HNE né il 1-HNA risultano essere substrati della CBR1 in presenza di NADPH [219]. Comparate con la CBR1, le aldo-cheto reduttasi citate precedentemente mostrano una costante di specificità maggiore, dovuta principalmente ad una kM per il 4-ONE inferiore; inoltre presentano attività anche nei confronti del 4-

HNE [232,233]. E’ stato calcolato che l’attività reduttasica delle aldo-cheto reduttasi nei confronti del 4-ONE può essere competitivamente ridotta in presenza di 4-HNE, che è prodotta in significative concentrazioni durante la perossidazione lipidica [219]. Dato che l’attività catalitica della CBR1 non viene alterata dalla presenza di 4-HNE, è plausibile supporre un ruolo importante della CBR1 nel metabolismo e nella detossificazione di uno dei più reattivi prodotti della perossidazione lipidica [219].

5.2.1.4.3 MOLECOLE CONIUGATE AL GLUTATIONE

La CBR1 presenta un sito di legame per il glutatione (GSH) in prossimità del sito attivo [234] ed è in grado perciò di usare substrati coniugati al glutatione che possono talvolta modularne l’attività [235]. GSH ossidato e altri prodotti dell’ossidazione del GSH sono infatti in grado di inibire l’enzima, mentre altre molecole coniugate al GSH possono essere degli ottimi substrati o addirittura substrati migliori della molecola in condizioni libere [193,221,222]. In alcuni casi però la forma coniugata al GSH può costituire un substrato peggiore della forma libera: il GS-ONE ad esempio mostra una kM simile a

quella del 4-ONE ma una kcat di circa 26 volte inferiore. Al contrario la forma coniugata al GSH delle prostaglandine A1 risulta essere un substrato migliore delle prostaglandine A1 libere [236,237]. Questa variabilità è probabilmente legata ad un diverso orientamento della molecola all’interno della tasca catalitica dell’enzima rispetto a quello che assumerebbe la molecola nella forma coniugata al glutatione [238].

Numerose funzioni biologiche della CBR1 potrebbero essere relazionate ad un importante substrato scoperto nel 2008 da Bateman et al., l’S-nitrosoglutatione (GSNO). Il

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glutatione, la cui concentrazione nelle cellule può variare da 1 a 10mM, ha la capacità di reagire con l’ossido nitrico (NO) portando alla formazione di GSNO, la cui concentrazione è strettamente regolata e mantenuta a livelli micromolari [239]. L’importanza di tale regolazione è legata alle funzioni dell’ossido nitrico quale mediatore intracellulare coinvolto nella regolazione di fattori di trascrizione che possono giocare un ruolo nell’apoptosi cellulare [240], nell’inibizione dell’attivazione piastrinica [241] e nella produzione di potenti effetti a livello della muscolatura liscia e dell’apparato respiratorio [242]. Inoltre la stessa molecola costituisce un elemento di tossicità che può essere regolata per contrastare microrganismi patogeni [243,244].

Le costanti cinetiche misurate per la riduzione del GSNO da parte della CBR1 in presenza di NADPH (km 30 µM; kcat 450 min-1) sono tali da considerare la molecola al pari dei

migliori substrati chinonici conosciuti, come il menadione [220]. Questi risultati rafforzano l’ipotesi che la CBR1 rivesta un ruolo importante nel metabolismo dell’ossido nitrico attraverso la regolazione dei livelli tissutali di GSNO.

L’incubazione dell’enzima con GSNO alla concentrazione di circa 100 µM [245] comporta la perdita completa dell’attività enzimatica. Il fatto che tale attività possa essere recuperata aggiungendo un potente agente riducente come il ditiotreitolo (DTT), indicherebbe l’S-glutationilazione come meccanismo responsabile dell’inibizione [246]. La CBR1 contiene 5 cisteine nella sua sequenza di cui solo due, la Cys-226 e la Cys-227, risultano rilevanti per l’attività dell’enzima (per substrati come menadione e daunorubicina) [247]. La Cys-227 in particolare, essendo orientata verso il centro catalitico dell’enzima [248]; risulta potenzialmente la migliore candidata come residuo reattivo soggetto a glutationilazione [245,247].

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SCOPO DEL LAVORO DI TESI

Il presente lavoro di tesi si è svolto all’interno di un progetto di ricerca già avviato che si occupa di studiare gli effetti dello stress ossidativo indotto su cellule di astrocitoma umano. L’analisi di estratti grezzi di celllule ADF ha permesso di evidenziare una nuova attività deidrogenasica NADP+ dipendente in grado di ossidare selettivamente l’addotto GS-HNE ma non l’HNE. Lo scopo del lavoro di tesi è stato quello di purificare e caratterizzare quest’attività enzimatica mediante l’utilizzo di diversi substrati.

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STRUMENTAZIONE E REAGENTI

I materiali usati nelle procedure sperimentali sono elencati di seguito, indicando tra parentesi le ditte produttrici:

Reagenti:

 4-HNE (CAYMAN CHEMICAL)

 GSH (SIGMA ALDRICH CO.)

 GS-HNE (CAYMAN CHEMICAL)

 EDTA (JUORO)  NaCl (J.T. BAKER)  NaOH (J.T. BAKER)  HCL (J.T. BAKER)  Na2HPO4 (J.T. BAKER)  (NH4)2SO2 (J.T. BAKER)

 Nitrato d’Argento (SIGMA ALDRICH CO.)

 Formaldeide (SIGMA ALDRICH CO.)

 Acido acetico (J.T. BAKER)

 Etanolo (J.T. BAKER)

 BSA (SIGMA ALDRICH CO.)

 DTT (SIGMA ALDRICH CO.)

 DTNB (SIGMA ALDRICH CO.)

 NAD (SIGMA ALDRICH CO.)

 NADH (SIGMA ALDRICH CO.)

 NADP (SIGMA ALDRICH CO.)

 NADPH (SIGMA ALDRICH CO.)

 Coomassie Brillant Blue (SIGMA ALDRICH CO.)

 TRIS (BDH)

 Acetaldeide (SIGMA ALDRICH CO.)

50  L-Cisteina (SIGMA ALDRICH CO.)

 Glicina (BDH)

 Indol acetammide (SIGMA ALDRICH CO.)

 Menadione (SIGMA ALDRICH CO.)

 4-ONE (CAYMAN CHEMICAL)

 PGB1 (CAYMAN CHEMICAL)

Strumentazione:

 Cappa biologica (HERAEUS)

 Spettrofotometro DU7 multicella (BECKMAN)

 Centrifuga J2-21 (BECKMAN)

 Bagno termostato Termoblock 780 (THERMO)

 pHMetro (DENVER INSTRUMENT COMPANY)

 Celletta di concentrazione (MILLIPORE)

 Membrane da dialisi 3500Da cut-off (SPECTRUM LABORATORIES INC.)

 Resina DE-52 (WHATMAN)

 Resina Sephacryl S-200 (GE HEALTHCARE AMERSHAM)

 Resina Blu Sepharose (GE HEALTHCARE AMERSHAM)

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