Citometria a flusso con arancio di acridina

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 115-118)

nell’analisi del liquido seminale

3.2 Frammentazione del DNA nemaspermico

3.2.5 Citometria a flusso con arancio di acridina

3.2.5.1 Premessa

Questo metodo si basa sulla proprietà unica dell’arancio di acridina (AO) di emettere una fluorescenza verde quando è intercalato tra il DNA a doppio filamento e una fluorescenza rossa quando è associato al DNA a filamento singolo. La versione

at-Figura 3.4 Comet test su spermatozoi di un campione patologico con frammentazione estesa del DNA e di un campione normale senza danni visibili al DNA, colorati con bromuro di etidio

Microfotografia di Dolores Lamb e Alexander Bolyakov.

Figura 3.5 Cometa vista al microscopio, dopo conteggio con il software CASP (coda DNA = 88%)

Microfotografia e analisi di Petr Houska.

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

tuale, descritta da Evenson, 2013 [199], può essere usata per valutare campioni fre-schi e/o congelati e comprende solo due fasi metodologiche principali. Nella prima fase, gli spermatozoi sono trattati con una soluzione detergente a basso pH (1,2) per denaturare la cromatina e permetterne la successiva colorazione. Nella seconda fase, la sospensione di spermatozoi viene neutralizzata e le cellule vengono colora-te con una seconda soluzione concolora-tenencolora-te AO.

I dati per la fluorescenza rossa e verde vengono raccolti dalla citometria a flusso e trasformati per determinare il grado di fluorescenza rossa nella popolazione di spermatozoi, noto come indice di frammentazione del DNA (DFI). L’analisi dei dati raccolti può essere fatta con qualsiasi software di citometria a flusso. È disponibile anche un software di analisi commerciale.

3.2.5.2 Procedure

Reagenti

Una soluzione detergente a basso pH (1,2): 0,08 M HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, regolata al pH 1,2 con HCl e/o NaOH.

Una soluzione di colorazione AO contenente 6 mg/l di AO purificato, 0,1 M di acido citrico, 0,2 M di Na2HPO4, 1 mM di EDTA disodico e 150 mM di NaCl, regolata a pH 6,0 con NaOH. Proteggere la soluzione dalla luce usando un foglio di alluminio o un bicchiere ambrato.

TNE (10 Tris Cl, 150 NaCl e 10 EDTA, pH 7,4).

Preparare una ghiacciaia (preferibilmente con un coperchio per mantenere i cam-pioni al buio) e mettere la soluzione di colorazione AO, TNE e la soluzione di de-tergente acido all’interno (se si valutano i campioni congelati, i campioni devono essere diluiti con TNE prima del congelamento).

Metodologia

Adattato da Evenson, 2013 [199] ed Evenson e Jost, 2000, 2001 [200, 201].

1. Scongelare un campione di riferimento e metterlo nella ghiacciaia (per prepara-re un campione di riferimento, vedeprepara-re Evenson e Jost, 2001 [201]).

2. Avviare il citometro a flusso ed eseguire il tampone di equilibrio AO per 15 mi-nuti, quindi misurare un campione di riferimento (per come misurare i campioni, vedere sotto) e regolare la sensibilità dei tubi fotomoltiplicatori verde e rosso a 475 e 125, rispettivamente.

3. Diluire i campioni a 1-2×106/ml con TNE e metterli nella ghiacciaia (se si misurano campioni congelati, devono essere diluiti con TNE prima del congelamento in LN2).

4. Pipettare 200 µl di campione diluito in una vial per citometria a flusso, aggiun-gere 400 µl di detergente acido (avviare il cronometro al momento esatto in cui si aggiunge il detergente), agitare delicatamente e rimettere immediatamente la vial nella ghiacciaia.

5. Dopo esattamente 30 secondi aggiungere 1,2 ml di soluzione colorante, mescola-re con la punta della pipetta e rimettemescola-re immediatamente la vial nella ghiacciaia.

6. Mettere la vial nel citometro a flusso e dopo 3 minuti, misurati con il cronometro, iniziare a raccogliere dati.

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

7. Ripetere la procedura con un replicato.

8. Lasciare scorrere il tampone di equilibratura nel citometro a flusso e iniziare a preparare il campione successivo (possono essere raggruppati fino a sei cam-pioni, come per la misurazione del campione di riferimento).

9. Utilizzare il campione di riferimento per regolare la sensibilità delle vials di foto-moltiplicazione verdi e rosse a 475 e 125, rispettivamente.

10. Analizzare 5.000 spermatozoi per campione a un tasso di eventi di 100-200 cel-lule/secondo.

11. Quando tutti i campioni saranno stati valutati, sciacquare il citometro a flusso con acqua bidistillata per 10 minuti per rimuovere la maggior parte dell’AO.

12. Pulire il citometro a flusso secondo il protocollo suggerito dal produttore dello strumento.

Risultati

Per l’analisi dei dati, la popolazione di spermatozoi viene selezionata applicando una soglia nella regione di diffusione della luce frontale/laterale. In una fase successi-va, un citogramma di fluorescenza del DNA a doppio filamento verde vs il DNA a filamento singolo rosso viene utilizzato per includere all’interno della soglia solo le cellule AO-positive e sottrarre dall’analisi i detriti cellulari e i corpi apoptotici privi di materiale genetico. Consecutivamente, lo spostamento della fluorescenza dal verde al rosso – o DFI – è calcolato per ogni spermatozoo AO-positivo usando la formula:

Indice di frammentazione del DNA (DFI) = (fluorescenza rossa)/(fluorescenza rossa + fluorescenza verde)

In un ulteriore passaggio, i valori di DFI sono rappresentati in un istogramma, in cui, con l’uso di un campione di riferimento, i valori di DFI da moderato ad alto posso-no essere trovati alla destra della popolazione cellulare principale. La percentuale delle cellule a destra, che rappresenta il totale degli eventi AO-positivi, è nota come

%DFI, che è il parametro utilizzato per l’interpretazione clinica del test. L’istogram-ma DFI fornisce anche i valori di media e deviazione standard per DFI.

Conteggio e interpretazione clinica

Diversi studi hanno riportato soglie diagnostiche per il DFI misurato tramite citometria a flusso con arancio acridina [202, 203]. Come per altri test del DNA, ogni laboratorio dovrebbe stabilire il proprio intervallo di riferimento utilizzando controlli appropriati, basati su valori predittivi positivi e negativi, e dovrebbe essere chiaro a cosa si riferisce il valore predittivo (per esempio, concepimento, aborto spontaneo o altri fenomeni).

Controllo di qualità

Il citometro a flusso deve essere impostato secondo un campione di spermatozoi di riferimento ogni giorno, e dopo ripetute analisi di campioni di pazienti (6-10 campioni) deve essere nuovamente eseguita la ricalibrazione con il campione di riferimento.

Per garantire che l’AO sia equilibrato con le vials del campione, il tampone di equi-libratura dell’AO deve essere fatto scorrere attraverso le linee di flusso dello stru-mento per ~15 minuti prima della misurazione del campione e dei campioni diversi.

Durante la valutazione del campione, se il tasso di eventi è superiore a 250 eventi/

secondo, deve essere preparato un nuovo campione, per garantire un equilibrio preciso tra il colorante AO e il campione di spermatozoi.

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 115-118)