nell’analisi del liquido seminale
3.4 Test relativi all’immunologia e ai metodi immunologiciimmunologici
3.4.2 Colorazione immunocitochimica dei panleucociti (CD45)
I leucociti polimorfonucleati che hanno rilasciato i loro granuli e altre specie di leu-cociti, come linfociti, macrofagi o monociti, che non contengono perossidasi non possono essere rilevati dal test dell’o-toluidina per la perossidasi cellulare (Sezione 3.4.1.1, p. 108), ma possono essere rilevati con mezzi immunocitochimici. La colo-razione immunocitochimica è più costosa e richiede più tempo della valutazione dell’attività della perossidasi dei granulociti, ma è utile per distinguere leucociti e cellule germinali.
3.4.2.1 Principio
Tutte le classi di leucociti umani esprimono un antigene specifico (CD45), che può essere rilevato con un appropriato anticorpo monoclonale. Cambiando la natura dell’anticorpo primario, questa procedura generale può essere adattata per con-sentire la rilevazione di diversi tipi di leucociti, come macrofagi, monociti, neutrofili, cellule B o cellule T, se questi dovessero essere il centro dell’interesse.
3.4.2.2 Reagenti
•
DPBS, p. 228.•
Soluzione salina tamponata con Tris (TBS; vedere Sezione 8.4, p. 226), pH 8,2.•
Tetramisolo-HCl (levamisolo) 1,0 mol/l: sciogliere 2,4 g di levamisolo in 10 ml di acqua purificata.•
Substrato: a 9,7 ml di TBS (pH 8,2) aggiungere 2 mg di naftolo AS-MX fosfato, 0,2 ml di dimetilformammide e 0,1 ml di levamisolo 1,0 mol/l. Poco prima dell’uso, aggiungere 10 mg di Fast Red TR salino e filtrare (dimensione dei pori 0,45 µm).•
Fissativo: solo acetone o acetone/metanolo/formaldeide; a 95 ml di acetoneag-giungere 95 ml di metanolo assoluto e 10 ml di formaldeide al 37% (v/v).
•
Anticorpo primario: un anticorpo monoclonale di topo contro l’antigene leucocita-rio comune, codificato CD45.•
Anticorpo secondario: immunoglobuline di coniglio anti-topo. La diluizione utiliz-zata dipenderà dal titolo anticorpale e dalla fonte.•
Complesso fosfatasi alcalina – fosfatasi-antialcalina (APAAP).•
Ematossilina di Harris, p. 232: miscela di colorazione di Harris (come controcolore).3.4.2.3 Procedura
Preparazione del campione di eiaculato
1. Miscelare bene il campione di liquido seminale senza creare bolle d’aria.
2. Miscelare un’aliquota di circa 0,5 ml con cinque volumi di DPBS.
3. Centrifugare a 500 g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e sospendere il pellet di spermatozoi in cinque volte il suo volume di DPBS.
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
4. Centrifugare a 500 g per 5 minuti.
5. Ripetere questa procedura ancora una volta e risospendere il pellet in DPBS di-luendo fino a ottenere una concentrazione di circa 50×106 spermatozoi per ml.
Preparazione degli strisci di liquido seminale
1. Fare strisci di replicati su vetrini puliti (Sezione 2.4.7.1, p. 26) da aliquote di 5 µl della sospensione e lasciare asciugare all’aria.
2. Fissare le cellule asciugate all’aria in acetone assoluto per 10 minuti o in acetone/
etanolo/formaldeide per 90 secondi.
3. Lavare due volte con TBS e lasciare defluire il liquido in eccesso.
4. I vetrini possono poi essere colorati immediatamente o avvolti in un foglio di allu-minio e conservati a -70°C per analisi successive.
Incubazione con anticorpi
1. Su ogni vetrino, segnare con una matita a mina morbida (penna di delimitazione) un’area di cellule fissate (un cerchio di circa 1 cm di diametro) e coprirla con 10 µl di anticorpo monoclonale primario.
2. Tenere il vetrino in posizione orizzontale per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umida (per esempio, una capsula di Petri chiusa rivestita di carta da filtro imbibita di acqua) per evitare l’essiccamento.
3. Lavare i vetrini due volte con TBS, p. 230, e lasciare defluire il liquido in eccesso.
4. Coprire la stessa area dello striscio con 10 µl di anticorpo secondario e incubare per 30 minuti in una camera umida a temperatura ambiente.
5. Lavare due volte con TBS e lasciare scolare.
6. Aggiungere 10 µl di APAAP nella stessa area.
7. Incubare per 1 ora in una camera umida a temperatura ambiente.
8. Lavare due volte in TBS e lasciare defluire il liquido in eccesso.
9. Incubare con 10 µl di substrato fosfato di naftolo per 20 minuti in una camera umida a temperatura ambiente.
Controcolorazione e montaggio
1. Una volta che i vetrini hanno sviluppato un colore rossastro, lavare con TBS.
2. Controcolorare per alcuni secondi con ematossilina; lavare con acqua corrente e montare in un mezzo di montaggio acquoso (Sezione 2.4.9, p. 41).
Valutazione del numero di cellule CD45-positive
1. Esaminare l’intera area colorata del vetrino con ottica in campo chiaro a un in-grandimento di 200x o 400x. Le cellule CD45-positive (leucociti) sono colorate di rosso (Figura 3.7).
Nota: Per intensificare il prodotto di reazione, la colorazione con l’anti-corpo secondario e APAAP può essere ripetuta, con un periodo di incu-bazione di 15 minuti per ogni reagente.
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
2. Conteggiare separatamente le cellule positive al CD45 e gli spermatozoi fino a quando non sono stati osservati almeno 200 spermatozoi in ogni replicato, per ottenere un errore di campionamento accettabilmente basso (Tabella 2.3, p. 33).
3. Contare il numero di cellule CD45-positive e di spermatozoi con l’aiuto di un con-tacellule da laboratorio.
4. Valutare il secondo striscio allo stesso modo (fino a quando non sono stati contati 200 spermatozoi).
5. Calcolare la somma e la differenza dei due conteggi delle cellule CD45-positive.
6. Determinare l’accettabilità della differenza dalla Tabella 2.3, p. 33, la differenza massima tra due conteggi che ci si aspetta si verifichi nel 95% dei campioni a cau-sa del solo errore di campionamento.
7. Se la differenza è accettabile, calcolare la concentrazione (Tabella 2.4, p. 35). Se la differenza è troppo alta, rivalutare i vetrini in replicato.
8. Riportare la concentrazione media di cellule CD45-positive arrotondando alla se-conda cifra.
9. Moltiplicare la concentrazione di cellule CD45-positive per il volume totale dell’e-iaculato (ml) per ottenere il numero totale di cellule CD45-positive per edell’e-iaculato.
Calcolo della concentrazione
La concentrazione di cellule CD45-positive è calcolata rispetto a quella degli sper-matozoi. Se N è il numero di cellule CD45-positive contate nello stesso numero di campi di 400 spermatozoi e S è la concentrazione di spermatozoi in milioni per ml, allora la concentrazione (C) di cellule CD45-positive in milioni per ml può essere calcolata mediante la formula C = S × (N/400).
Figura 3.7 Leucociti nel liquido seminale
Le cellule portatrici di CD45 (leucociti) sono colorate di rosso.
Micrografia per gentile concessione di R.J. Aitken.
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Esempi pratici Esempio 1
Nel replicato 1 ci sono 20 cellule CD45-positive per 200 spermatozoi, mentre nel re-plicato 2 ci sono 40 cellule CD45-positive per 200 spermatozoi. La somma dei valori (20+40) è 60 e la differenza (40-20) è 20. Dalla Tabella 2.3, p. 33 si vede che questa supera la differenza prevista per il solo effetto della variabilità casuale (15), quindi i risultati vengono scartati e vengono fatte nuove valutazioni.
Esempio 2
Nel replicato 1 ci sono 25 cellule CD45-positive per 200 spermatozoi, mentre nel re-plicato 2 ci sono 35 cellule CD45-positive per 200 spermatozoi. La somma dei valori (25+35) è 60 e la differenza (35-25) è 10. Dalla Tabella 2.3, p. 33 si vede che questa è inferiore a quella prevista per il solo effetto della variabilità casuale (15), quindi i valori sono accettati.
Per 60 cellule CD45-positive per 400 spermatozoi e una concentrazione di sperma-tozoi di 70×106 cellule/ml, la concentrazione di cellule CD45-positive è C = S × (N/400) cellule/ml = 70×106 × (60/400) = 10,5×106 cellule/ml, o 10×106 cellule/ml arrotondando alla seconda cifra. Poiché sono state contate meno di 400 cellule, riportare l’errore di campionamento per 60 cellule come indicato in Tabella 2.3, p. 33 (circa il 13%).
3.4.2.4 Limiti tra risultati normali e patologici
Attualmente, non ci sono valori di riferimento basati sull’evidenza per le cellule CD45-positive nel liquido seminale di uomini fertili. Il valore soglia di consenso di 1,0×106 cellule/ml per le cellule perossidasi-positive implica una concentrazione mag-giore di leucociti totali, poiché non tutti i leucociti sono granulociti perossidasi-positivi.