La sopravvivenza delle cellule dopo il congelamento e lo scongelamento
Nota 3: La conservazione del liquido seminale raccolto prima di una procedura che possa potenzialmente indurre sterilità ha spesso un
im-portante valore psicologico, perché dà la speranza di una futura pater-nità. Per i pazienti che stanno per sottoporsi a una terapia con agenti alchilanti o a radioterapia, il liquido seminale deve essere raccolto prima dell’inizio della terapia, a causa del rischio di mutagenesi negli sperma-tozoi. A tutti i pazienti che necessitano di chemioterapia o radioterapia, compresi gli adolescenti [394], dovrebbe essere offerta la possibilità di conservare gli spermatozoi.
ne2. Esame di base 3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
6.2.3 Trattamento dell’infertilità
Gli spermatozoi possono essere conservati per i trattamenti, usando così i propri spermatozoi nelle IUI, IVF o ICSI, per esempio nei casi di:
•
grave oligozoospermia o presenza a intermittenza nel liquido seminale di sperma-tozoi mobili (come supporto per la ICSI) [395], o nei soggetti Klinefelter (durante la pubertà) quando è possibile raccogliere un campione di liquido seminale [396];•
trattamento dell’infertilità che può non essere persistente, come nella chirurgia per l’ostruzione del tratto genitale o nel trattamento con gonadotropine per l’ipo-gonadismo ipotalamo-ipofisario;•
necessità di una raccolta speciale, come nell’eiaculazione assistita nei pazienti con lesioni del midollo spinale, spermatozoi nelle urine provenienti da eiaculazione retrograda o prelievo chirurgico dal tratto genitale;•
pazienti che non sono in grado di raccogliere il liquido seminale fresco il giorno della procedura ART, come per esempio:•
uomini che non possono essere presenti nel laboratorio ART il giorno dell’in-seminazione o che hanno difficoltà a raccogliere il liquido seminale per motivi psicologici;•
uomini con azoospermia non ostruttiva che richiedono l’estrazione testicolare degli spermatozoi*;•
uomini con lesioni del midollo spinale che richiedono l’estrazione testicolare degli spermatozoi;•
uomini sottoposti a vasovasostomia o a vasoepididimostomia per azoospermia ostruttiva con aspirazione epididimaria microchirurgica o estrazione di sper-matozoi testicolari per la conservazione della fertilità*.* In questi casi, si dovrebbe seguire la procedura descritta nella Sezione 6.4.2, p. 180.
È stata anche sollevata la problematica che nelle coppie con un fattore maschile severo, l’ART con il liquido seminale del partner può avere molto meno successo dell’ART con il liquido seminale di un donatore [397].
6.2.4 Ridurre al minimo la trasmissione delle malattie infettive
Per gli uomini con HIV sottoposti a terapia antiretrovirale, i campioni con una carica virale non rilevabile possono essere conservati per IUI, IVF o ICSI, per tentare il concepimento riducendo così il rischio di trasmissione dell’HIV alla partner femmi-nile. Allo stesso modo, per gli uomini che vogliono crioconservare il liquido seminale mentre sono sieropositivi per l’epatite B o C, per esempio, la carica virale dovrebbe essere controllata.
6.3 Valutazione dei rischi della crioconservazione e dello stoccaggio degli spermatozoi umani
La crioconservazione e il successivo stoccaggio di spermatozoi umani è un processo altamente complesso, che pone una speciale e potenziale responsabilità sul
perso-6. Crioconservazione degli spermatozoi
ne2. Esame di base 3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
nale di laboratorio. Nel valutare i rischi associati alla crioconservazione e allo stoc-caggio del liquido seminale, si dovrebbero considerare gli aspetti riportati di seguito.
6.3.1 Risorse
•
Sicurezza fisica dei recipienti, dei campioni e della stanza dello stoccaggio, per ridurre il rischio di perdita per furto o incendio, difetti nelle paillettes, nelle vials e nei devices di crioconservazione, nella fornitura di azoto liquido.•
Idoneità dell’attrezzatura preposta all’uso.•
Sistema di contenimento e rimozione dell’azoto.•
I contenitori criogenici dovrebbero avere un dispositivo di allarme per la rileva-zione del livello di azoto al di sotto di una certa soglia o per la temperatura al di sopra di una certa soglia. Il livello di allarme dovrebbe essere impostato in modo tale da fornire un avvertimento prima che si verifichi una situazione critica e l’allarme dovrebbe essere collegato a un call center che avvisi il personale della banca del seme.6.3.2 Sicurezza e protezione del personale
•
I dispositivi di protezione individuale dovrebbero essere sempre disponibili nella banca. Se possibile, due persone dovrebbero essere presenti contemporanea-mente nella banca, in caso contrario, prima di entrare il personale esterno do-vrebbe essere avvisato.•
Si consigliano sistemi di allarme per il rilevamento di bassi livelli di ossigeno at-mosferico e azioni correttive a essi associate.6.3.3 Rischio di contaminazione incrociata
Per ridurre il rischio di contaminazione incrociata con agenti infettivi tra i campioni conservati (per esempio, la trasmissione dell’HIV o del virus dell’epatite B (HBV) o C (HCV) attraverso un contenitore per crioconservazione), occorre considerare:
•
tipo di contenitore: vials o paillettes e metodo di sigillatura delle paillettes (calore o polimero) e l’uso di un contenitore secondario (straw-in-straw);•
natura del recipiente di conservazione: azoto liquido o vapore;•
protocollo e metodo di conservazione dei campioni ad alto rischio (campioni con-tenenti o che si sospetta possano contenere virus); in questi casi, si raccomanda l’uso di aree e contenitori separati per ogni positività al virus;•
la crioconservazione di ogni paziente separatamente, disinfettando tutta la super-ficie alla fine di ogni procedura.Altre precauzioni che possono essere attuate per evitare o limitare la contamina-zione se le precauzioni sopra indicate non possono essere garantite:
•
sterilizzazione dell’azoto liquido per evitare la contaminazione, utile in caso di vi-trificazione dove il campione è direttamente immerso nell’azoto liquido [398];6. Crioconservazione degli spermatozoi
ne2. Esame di base 3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
•
riempimento periodico dei contenitori o serbatoi di conservazione Dewar con azo-to liquido sterile e decontaminazione annuale dei conteniazo-tori di congelamenazo-to;•
decontaminazione dei campioni congelati prima dello scongelamento;•
esecuzione di test per i virus e le infezioni sessualmente trasmissibili su tutti i maschi al momento del prelievo come segue (o secondo i regolamenti nazionali):•
HIV 1 e 2 (utilizzando il test dell’acido nucleico (NAT), che testa anche gli anticor-pi del gruppo O);•
Test HBV per l’antigene di superficie dell’epatite B (HBsAg), anticorpi totali con-tro l’antigene del core dell’epatite B (anti-HBc) (IgG e IgM) e un test NAT per l’HBV o una combinazione che include l’HBV;•
HCV utilizzando anti-HCV e un test NAT per HCV;•
Treponema pallidum (sifilide);•
Chlamydia trachomatis (utilizzando i test preposti per il rilevamento in popola-zioni asintomatiche e a bassa prevalenza);•
Neisseria gonorrhea (utilizzando i test preposti per il rilevamento in popolazioni asintomatiche e a bassa prevalenza);•
virus T-linfotropo umano (HTLV), tipi I e II utilizzando anti-HTLV I/II;•
citomegalovirus (CMV) utilizzando anti-CMV (totale e IgG e IgM).6.3.4 Sicurezza dei campioni crioconservati
•
Dividere i campioni e conservarli in criocontenitori separati e/o in luoghi diversi per ridurre il rischio di perdita totale.•
Doppio controllo dell’identità dei campioni a ogni passaggio.•
Usare marcature evidenti e codici di identificazione.•
Seguire procedure per l’audit regolare dell’uso del materiale e dei campioni in deposito.•
Dopo un uso prolungato, i contenitori criogenici possono essere contaminati. Do-vrebbero quindi essere decontaminati periodicamente con soluzioni che non re-agiscono con l’alluminio o l’acciaio. Si suggerisce una decontaminazione almeno una volta all’anno.•
Tutti i contenitori dovrebbero avere sistemi di allarme con sensori per monitorare la temperatura e il livello di azoto liquido. I sensori dovrebbero essere collegati a un allarme per avvisare il personale del laboratorio di eventuali problemi.Fonti: [364, 377, 399, 400].
Nota: Ai donatori di liquido seminale possono essere richiesti altri test secondo la legislazione nazionale.
6. Crioconservazione degli spermatozoi
ne2. Esame di base 3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
6.4 Protocolli di crioconservazione degli spermatozoi
Sono disponibili diversi protocolli di congelamento e di gestione del seme [377].
Diversi crioprotettori sono disponibili in commercio. I crioprotettori sono classificati come permeanti (il glicerolo è il più usato) e penetranti o non permeanti (come le molecole di zucchero e il tuorlo d’uovo). Possono essere usati sia crioprotettori che contengono tuorlo d’uovo (come estensori di liquido seminale) sia crioprotettori che non lo contengono [377]. I dettagli di un crioprotettore comunemente usato – glice-rolo-tuorlo d’uovo-citrato (GEYC) – e le procedure di congelamento automatico o in vapori di azoto sono indicati di seguito.
Considerando che gli spermatozoi crioconservati possono essere utilizzati per ge-nerare embrioni, tutte le procedure dovrebbero, se possibile, essere eseguite sotto una cappa di classe A in un ambiente classificato (almeno D) secondo le linee guida internazionali sulle buone pratiche. I metodi e l’ambiente di congelamento, se al di sotto dello standard previsto, dovrebbero essere documentati, ma se consentito dalla legge, non sono una ragione per rifiutare di eseguire la crioconservazione.
6.4.1 Procedura standard
6.4.1.1 Preparazione del crioprotettore GEYC
Preparazione del GEYC:
1. A 65 ml di acqua sterile purificata aggiungere 1,5 g di glucosio e 1,3 g di citrato di sodio tribasico diidrato.
2. Aggiungere 15 ml di glicerolo e miscelare accuratamente.
Nota 1: La conservazione stessa in fase di vapore piuttosto che in azo-to liquido può ridurre il rischio di contaminazione incrociata. Tuttavia, possono essere presenti elevati gradienti di temperatura nei recipienti di stoccaggio a vapore, a seconda della forma, del carico del campione e del tipo di contenitori. Se viene utilizzata per lo stoccaggio la fase di vapore, assicurarsi che sia in un contenitore progettato per tale scopo e certificato secondo gli standard internazionali dei dispositivi medici.
Nota 2: Le paillettes di sicurezza in resina ionomerica termosaldabile