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Analisi grafica dei cristalli

Come già accennato, la FPPS catalizza la sintesi di FPP e ciò avviene mediante una reazione di allungamento della catena, che procede attraverso 2 step distinti:

IPP e DMAPP si condensano per formare GPP, il quale funge da substrato allilico per lo step successivo Seconda condensazione tra GPP e IPP per produrre FPP.

Studi di legame indicano che il sito attivo contiene legati domini sia allilici che omoallilici distinti e suggerisce che il complesso E-GPP-PPi formato dalla condensazione di IPP e DMAPP si deve riarrangiare per espellere PPi e riposizionare GPP per la seconda reazione. Dalle strutture cristallizzate si evince che ai vari step sono associate conformazioni differenti dell’enzima, e in particolare una conformazione aperta, parzialmente chiusa

e totalmente chiusa.

Figura 4.1: Sito attivo: mostra conformazione aperta (verde) e conformazione completamente chiusa (blu).

La FPPS è un dimero con 13 α-eliche unite tra di loro da loop, in particolare nella parte superiore della proteina si trovano le connessioni tra α4 e α5 (residui 107-127) e α8- α9 (residuo 249-268). Possiede, inoltre, 3 catene corte (α-1, α-2, α-3) inserite tra l'elica H e I.

67 Nella zona dove l'elica è impacchettata è situata una larga cavità centrale, che costituisce la parte allungata idrofobica del sito di legame del ligando. Il fondo di questa cavità viene delimitato dalla porzione della catena del residuo di Phe-113.

Figura 4.2: Cavità del sito attivo.

Nella superficie della cavità centrale sono situati i motivi ricchi di aspartato delle eliche α4, α8 ed in maniera particolare della α7 che hanno il compito di dirigere il carbonile della Lys-200 verso la cavità.

FPPS umana cristallizzata in forma libera adotta una conformazione aperta, mentre il complesso cristallizzato con inibitori N-BP o con il complesso ternario (ZOL e IPP), mostra una conformazione chiusa. Questa osservazione suggerisce che il legame N-BP causa un riarrangiamento della struttura del sito, accompagnata da una diminuzione dello spazio interno della cavità.

In questo cambio di conformazione nell'enzima umano pare che svolgano un ruolo importante gli ultimi 130 residui della porzione C-terminale, e coinvolge un meccanismo a 2 step.

Il primo step riguarda l'occupazione del sito di legame allilico che porta i 2 motivi DDXXD ad avvicinarsi tra di loro, e i due loop ( H-I e D-E) a formare nel sito di legame del substrato un “gate” che determina la chiusura dell'entrata al sito di legame allilico, provocando il passaggio alla conformazione parzialmente chiusa dell’enzima.

In questa struttura di transizione è richiesto un netto cambio di orientamento nella catena laterale della Tyr349. Il secondo step riguarda invece il legame dell'IPP, ed in particolare la coda altamente basica C-terminale dell'enzima (quindi i residui Lys 350, Arg 351, Arg 352 e Lys 353), nota per svolgere un ruolo nel legame e nelle catalisi dell’IPP , la quale si ripiega verso il basso per chiudere il sito di legame dell'IPP determinando il passaggio alla conformazione totalmente chiusa.

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Figura 4.3: Conformazione parzialmente chiusa (sopra) e completamente chiusa (sotto). In evidenza si può notare la coda C-terminale.

La conformazione aperta dell’enzima facilita il rilascio del prodotto e supporta l'allungamento della catena tramite la traslocazione di GPP al sito allilico. Questo favorisce il legame con una seconda molecola di IPP per l'inizio della sintesi di una nuova molecola di FPP.

La conformazione parzialmente chiusa è innescata dall'occupazione del sito di legame allilico e viene regolata dalle molecole di DMAPP e IPP legate. Questa conformazione è principalmente stabilizzata mediante interazioni elettrostatiche tra Lys-266 e Asp-107/Asp-174, tra i 2 motivi DDXXD con i 3 ioni metalli e il gruppo pirofosfato del substrato allilico.

La conformazione completamente chiusa è determinata dall'occupazione del sito di legame dell'IPP ed è stabilizzata dalle interazioni elettrostatiche tra Lys-57 e il gruppo carbossilato C-terminale. Questa conformazione è catalicamente attivata dall'orientamento corretto di IPP e DMAPP per la reazione e contribuisce alla protezione, mediante molecole d’acqua, del carbocatione intermedio, che si forma durante la catalisi.

L'interfaccia dimerica non è influenzata dal cambio di conformazione ed è perciò considerata il nucleo rigido della struttura dell'enzima.

Il rilascio di pirofosfato dal substrato allilico durante la catalisi induce la perdita delle interazione con il motivo DDXXD, portando alla destabilizzazione della conformazione chiusa e determinando così il passaggio alla conformazione aperta, dando vita ad un nuovo ciclo catalitico.

Complesso binario con N-BP

I N-BP quali Aledronato, Ibandronato, Pamidronato e Zoledronato si legano con il sito del substrato allilico ed interagiscono con entrambi i motivi DDXXD attraverso un centro metallico costituito da tre ioni metallici, generalmente Zn+2 o Mg+2.

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Figura 4.4: Raggi x della 2F94 (sopra) e della 1ZW5 (in basso).

Ogni sito metallico mostra una coordinazione ottaedrica che coinvolge l'atomo di ossigeno del bifosfato e la catena laterale del gruppo carbossilato dei residui di:

Asp-103, Asp-107 per quanto riguarda il primo motivo DDXXD Asp-243 per il secondo motivo DDXXD.

I residui conservati Lys-200, Arg-112 e Lys-257 formano un ponte salino con la porzione BP.

La regione di connessione tra α8 e α9 (residui 249-268) crea un “coperchio” sul N-BP ed è mantenuto da diverse interazioni polari, in particolare da:

loop del residuo Lys-257 che è in contatto sia con Asp-243 che con l'ossigeno del gruppo fosfato; Asp-247 situato nella parte finale della elica α8 che forma un legame a H bidentato con ammide di Thr-

260 e del Asp-261 della catena principale;

gli anelli eterociclici delle strutture di Risedronato e Zoledronato vengono circondati principalmente dalle porzioni idrofobiche delle catene dei residui Phe-99, Leu-100, Thr-167, Lys-200 e Tyr-204 e dall'ossigeno del carbonile della Lys-200.

Il legame del BP è stabilizzato dalla conformazione chiusa di FPPS e dalle interazioni sia con entrambi i motivi DDXXD che con la Lys-257 del loop H-I.

Guardando da più vicino i diversi BP sono state osservate delle differenze strutturali che modificano le interazioni specifiche di ogni composto;in particolare:

Il gruppo ammino alifatico del Pamidronato non ha una ben definita densità elettronica; ciò suggerisce che questo gruppo non genera un’interazione forte con il sito enzimatico attivo e/o determina più orientazioni del BP nel complesso.

70 Il sostituente imidazolico del Zoledronato crea interazioni forti con FPPS; l'atomo di azoto protonato dell'eterociclo crea un legame a H sia con Lys-200 che con Thr-201. Questi due residui sono posizionati nel nodo dell'elica G, sulla linea del legame del carbocatione nella tasca enzimatica.

Da studi precedenti è stato confermato che queste interazioni hanno maggior probabilità di interagire con l'atomo di azoto in posizione 4 dal carbonio geminale della porzione BP.

Si è osservato che l'interazione del legame a H con Thr-201 è presente anche nel complesso con l'Oledronato, mentre il legame a H con la Lys 200 viene perso.

Il Pamidronato è un N-BP, che presenta un atomo di azoto amminico in posizione 3 che impedisce la formazione dei legami ad H; la stessa situazione è presente nell'Ibandronato che ha un gruppo amminico terziario in posizione 3, dove il primo sostituente è un gruppo metilico che tramite forze di Van Der Waals crea un contatto con Thr-201 e Lys-200, mentre il secondo sostituente è il n-pentil che è diretto verso l'interfaccia dimerica di FPPS, riempiendo così il sito di legame che è normalmente occupato dalla crescita della catena isoprenoide.

Il legame della lunga catena laterale dell'Ibandronato è accompagnato dal cambio di conformazione della catena laterale di Phe-99, Thr-167 e Gln-171.

L'alta potenzialità e la superiore efficienza di Zoledronato rispetto agli altri ligandi, possono probabilmente essere dovuti all'interazione del legame ad H biforcato, descritto precedentemente, ed all'incremento della rigidità e alla voluminosità della struttura dovuta all'anello imidazolico, in confronto con la catena alcalina flessibile degli altri N-BPs.

Nelle proteine co-cristallizzate con IPP, come la 1ZW5 utilizzata per i calcoli di docking, si ha un grande cambiamento conformazionale che riguarda i residui basici della zona C-terminale, 350-353 (KRRK), che diventano ordinati quando l'IPP è legato. Inoltre, è presente una rete di collegamenti salini che coinvolge la Lys- 57, il carbossilato terminale della Lys-353, e l'Arg-351. Questa conformazione, che si genera nel C-terminale rende inaccessibile sito attivo alla maggior parte solvente, andando così a bloccare la catena laterale della Lys- 57 in una posizione che è in grado di effettuare due interazioni polari con il pirofosfato dell'IPP, dirigendo la coda idrofoba dell'IPP verso l'inibitore.

Analisi del docking

Le orientazioni fornite dal docking per i composti noti sono state analizzate graficamente, ponendo una particolare attenzione alle interazioni probabilmente fondamentali per l’attività evinte dagli studi cristallografici. Ad esempio, oltre alla ovvia coordinazione degli atomi di magnesio, sono stati considerati i legami a idrogeno con la Thr-201 e la Tyr-204, comuni a molti inibitori cristallizzati.

I ligandi sono stati classificati in base allo scaffold comune in 5 differenti tabelle, in cui l’inibizione non è sempre misurata con metodi confrontabili. A volte è riportata come IC50, a volte come Ki e, per le molecole

71 meno attive, come percentuale di inibizione a concentrazioni comprese fra 1 e 100 μM. In molti articoli, ma non in tutti, la misurazione dell’attività enzimatica dopo incubazione con l’inibitore è stata effettuata con una pre- incubazione preventiva che migliora l’attività inibitoria. E’ stato scelto, quindi, di considerare come attivi i composti con IC50 minori di 1 μM, evitando di effettuare procedure basate su dati precisi di attività biologica, come QSAR o 3D-QSAR, e limitandoci a studi di relazione struttura-attività qualitativi o semiquantitativi. La tendenza comune a tutti gli inibitori noti è il posizionamento nel sito dei N-BP con coordinazione più o meno stringente degli atomi di Mg. Il posizionamento è univoco per i ligandi più piccoli, come i classici Pamidronato, Risedronato o Zoledronato, ma diventa critico già con la semplice aggiunta di un fenile o eterociclo.

In tal senso è stato determinante il lavoro svolto dal gruppo canadese di De Schutter. Il primo lavoro del 2010 era volto a esplorare la cavità di legame dell’IPP, supponendo che la sintesi di composti più lunghi dei tradizionali N-BP potesse migliorare l’inibizione, portando all’occupazione simultanea dei siti dei N-BP unitamente a quella dell’IPP. In quest’ottica sono stati sintetizzati i composti A2-A17, con risultati ancora non ottimali: il composto più attivo restava il progenitore A1, cioè il Risedronato, che con la metodica canadese mostrava un IC50 circa 300 nM (con pre-incubazioni più lunghe la sua attività diventa minore di 10 nM). L’aggiunta di vari sostituenti eterociclici ha portato a due composti con IC50 650-770 nM, quindi con risposta dimezzata rispetto al Risedronato ma sempre molto attivi, che secondo gli autori, e anche secondo il nostro docking effettuato nel complesso 1ZW5 senza IPP, si posizionavano a cavallo fra il sito del Risedronato e quello dell’IPP.

Figura 4.5: Superficie del sito attivo della FPPS umana. A) si può osservare la posizione dell’IPP e del RIS nella struttura cristallizzata 1YV5; in B) invece si può osservare l’analogo A9 (verde).

72 Tale ipotesi però non era avvalorata dal docking effettuato nel complesso con l’IPP, o utilizzando la proteina 2F94 complessata in forma binaria, cioè senza IPP. In tal caso, Gold prevedeva un posizionamento della porzione eterociclica in una cavità piuttosto ristretta delimitata da Phe99 e Gln171 (vedi figura 4.9). Un esempio della orientazione predetta per i composti di De Schutter A5 e A13 è riportato in figura 1a e 1b: A5 si dispone nel sito ma la presenza del gruppo amminico in alfa rispetto ai fosfonati preclude una buona coordinazione con il Mg e non si evince alcuna interazione fra il nucleo piridinico e la Thr201. Al contrario, A13 posiziona il proprio nucleo piridinico, analogamente ai N-BP tradizionali, in modo da consentire una buona coordinazione con gli atomi di magnesio e da interagire a meno di 3Å con la Thr201 e Tyr204. A fronte di una inibizione del 10% misurata con una concentrazione di A5 100 μM, A13 mostra un IC50 pari a 650-700 nM.

Simili agli A, ma di minori dimensioni, i composti D mostrano una buona attività, in range variabile fra il picomolare e medio nanomolare, e solo qualche composto che sfiora il micromolare. Sorprendente l’andamento dell’attività in questa serie, che evidenzia la necessità di un nucleo azotato (piridinico o anilinico), ma non discrimina in modo determinante la posizione 2, 3 o 4 rispetto al sostituente BP. Ogni cambiamento rispetto al Risedronato provoca un peggioramento dell’attività, che viene però mantenuta. Il nucleo ottimale è quello piridinico β-sostituito, ma la sostituzione in α provoca una variazione di IC50 da 5,7 nM a 9,2 nM. E conserva l’attività anche il composto quaternario, D6, anche se 19 nM. L’ipotesi è che l’azoto positivo sia critico per l’attività e sia generalmente orientato verso la Thr201. Tale residuo sembra implicato nella stabilizzazione del carbocatione intermedio durante la condensazione dei due substrati, e di conseguenza la porzione cationica dei N-BP potrebbe agire come analogo dello stato di transizione. Dall’analisi dei docking della serie D si nota come la porzione positiva dell’anello non si collochi sempre nella stessa zona, ma a seconda della posizione dell’azoto rispetto al gruppo fosfonico possa interagire in un’area comunque ristretta fra Thr201, Tyr204 e Gln240. Questo confermerebbe un meccanismo d’azione basato su una stabilizzazione di carica, non dovuta a un residuo in particolare, bensì a un effetto di superficie dovuto a vari residui amminoacidici.

Il docking riportato in figura 1m, 1n e 1o, mostra una collocazione simile per D3, D9 e D11, nonostante il loro diverso nucleo azotato. Il D9 è l’analogo α-sostituito del Risedronato, e il D11 differisce per la presenza del nucleo anilinico al posto del piridinico. Nonostante la posizione dell’azoto in D9 e D11 subisca un lieve spostamento, permane nella zona di interazione di Thr201 e Gln240, e i composti si collocano nel sito in modo da garantire una buona coordinazione degli atomi di Mg. Al contrario, l’allungamento dello spacer in D3 porta l’azoto in posizione diametralmente opposta e produce un peggioramento della coordinazione.

I composti D21, D22, e D23 (figure 1p-1r) interagiscono efficacemente con gli atomi di Mg e con i residui Thr201 e Tyr204; D23, con un ciclo flessibile rispetto agli altri due, permette un direzionamento ottimale verso

73 la Thr201 e un miglioramento della coordinazione, che provoca un aumento di attività di tre ordini di grandezza.

Molto sorprendenti i composti E privi del classico azoto protonato, che mostrano una attività pari ai migliori N- BP. La presenza di un atomo di zolfo trisostituito mima l’effetto del gruppo amminico, portando a ottime orientazioni nel sito (Figure 1s e 1t, E14 e E25). Sembra che la carica dislocata sullo zolfo, in maniera più diffusa e meno direzionata rispetto allo zolfo, permetta una inibizione ancora migliore rispetto a certi composti azotati.

Il docking dei N-BP E30 e E37, con valori di IC50 pari a 2,5 e 893 nM, mostra come piccole sostituzioni nella struttura, in particolare l’aggiunta di un ossidrile, possano portare a un peggioramento della coordinazione con gli atomi di magnesio e dell’interazione con Thr201 e Tyr204 (Figure 1u e 1v).

In generale, dall’analisi dei risultati del docking si può dedurre che per le strutture analoghe ai N-BP già presenti in commercio, le interazioni chiave siano le interazioni polari con Thr201, Tyr204 o Gln240 che spesso orientano il ligando in maniera ottimale per la coordinazione con gli atomi di Mg.

Ma quando si passa ad analizzare i composti C, dalla struttura altamente articolata, tutte le supposizioni sulle interazioni fondamentali vengono minate. I composti sintetizzati da Gao et al. hanno una struttura completamente diversa dai tradizionali bifosfonati, molto più somigliante ai terpeni. Per questi composti sarebbe prevedibile una occupazione totale del canale descritto in figura 4.9, con coordinazione degli atomi di Mg promossa dalla presenza del gruppo fosfonico o carbossilico legato alla catena terpenica. Analizzando i risultati del docking in figura 1f, 1h, e 1l, nel sito analogo a quello in cui sono stati condotti tutti i docking già descritti, le molecole tendono a ripiegarsi su se stesse, rivolgendo un solo fosfato nella zona dei magnesi. Nessuna delle interazioni presenti potrebbe giustificare una attività, per quanto non paragonabile ai classici N- BP: C1 e C5 hanno comunque un IC50 pari a 7,8 e 41 nM. Perseguendo l’idea che la struttura simil-terpenica potesse consentire l’ingresso nel sito in una diversa fase della catalisi, è stato studiato il docking di questi composti nell’enzima privato dell’IPP (figure 1e, 1g e 1i). L’orientazione derivante è molto più plausibile e rispecchia i canoni dell’interazione già visti per i composti precedenti. La coda terpenica di C1 si introduce nel sito dell’IPP, mentre il gruppo amminico interagisce con Thr201 e Gln240, consentendo la coordinazione dei metalli. Nel composto C5, la mancanza del nucleo piridinico e l’inserimento di un carbossile interferisce apportando un peggioramento all’interazione con questi residui, ma consentendo sempre l’interazione con gli atomi di magnesio. L’introduzione del secondo carbossile invece, in C15, cambia completamente l’assetto del gruppo negativo, spiazzando un fosfonato dal sito metallico e tentando una coordinazione fra il carbossile e l’atomo di magnesio, che provoca solo un peggioramento della disposizione del ligando. I composti C, pur nella

74 loro peculiarità di struttura e, probabilmente, di meccanismo, confermano le ipotesi evinte dai docking precedenti.

Scopo della Tesi era anche lo studio della possibile interazione dell’IPA, il cui target non è tuttora certo, con la FPPS. L’analisi del docking dell’IPA mostra come la sostituzione del BP con il ribosio come gruppo legante gli atomi di magnesio, per quanto modifichi radicalmente la struttura e la natura molecolare, può comunque consentire una buona coordinazione con gli ioni metallici e una interazione efficace con il sito di legame. Le figure 1c e 1d mostrano l’IPA e un suo analogo attivo sulle cellule tumorali (B14), che pur non interagendo in maniera ottimale con i residue chiave, si posizionano nel sito ponendo il ribosio in prossimità dei tre atomi di magnesio. In particolare il composto B14 si pone nel sito enzimatico in modo che tutti gli ossidrili possano coordinare i tre atomi di magnesio, mentre il nucleo aromatico va ad occupare il sito comune a tutti gli eterocicli dei classici N-BP. La porzione pro tonabile, cioè l’azoto anilinico, si inserisce nella solita zona compresa fra Tyr204, Thr201 e Gln240. Questo assetto potrebbe confermare, dal punto di vista teorico, l’eventuale interazione fra IPA e i suoi derivati con la FPPS.

La sostituzione del BP con il ribosio come gruppo legante i metalli e del nucleo piridinico protonato con un gruppo adeninico protonato in posizione anilinica stravolge la struttura dei classici N-BP ma di fatto consente ancora la complementarità con il sito enzimatico della FPPS.

Ovviamente, resta urgente la sperimentazione biochimica che verifichi l’inibizione diretta della FPPS da parte dell’IPA, ma la potenzialità del ribosio come gruppo in grado di coordinare gli atomi di magnesio viene confermata dal punto di vista teorico.

Per quanto riguarda la razionalizzazione dei rapporti struttura attività dei composti noti, il docking ha evidenziato che non esistono uno o più residui determinanti per l’interazione con la porzione non bifosfonica degli inibitori. Non vi è una interazione specifica necessaria per stabilizzare la carica positiva generalmente presente della struttura dei N-BP, piuttosto sembra esserci un meccanismo di stabilizzazione di carica diffuso in una ristretta regione del sito. Al fine di analizzare la distribuzione di carica nel sito enzimatico, è stata visualizzata la mappa dei residui carichi e lipofili:

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Figura 4.6: in celeste sono evidenziati i residui amminoacidici negativi, in arancio i residui amminoacidici positivi ed in giallo i residui lipofili.

La distribuzione dei residui nel sito enzimatico è molto peculiare. Si nota una netta separazione in una regione negativa (celeste), immediatamente prossima agli atomi di magnesio, una prima regione positiva (arancio) che forma il guscio esterno intorno alla sfera negativa, ed una seconda in prossimità dell’IPP (circondata dalla linea rossa). La zona gialla, formata da residui lipofili, è strettamente limitata, ed è ricca di residui aromatici e corredata di amminoacidi caratterizzati da estremità polari delocalizzate, come le glutammine. Sembra che la distribuzione degli amminoacidi sia appositamente mirata a collocare in alto nel sito una porzione fortemente carica del rigando, in una rete di interazione coulombiane che stabilizzano i gruppi leganti i metalli, e in basso una porzione con alta variabilità elettronica, che possa essere stabilizzata da gruppi funzionali in grado di delocalizzare in modo diffuso le cariche parziali. Di fatto questa mappatura corrisponde allo schema strutturale degli inibitori noti della FPPS, che può essere così razionalizzato:

Analisi del Virtual Screening

Il virtual screening aveva lo scopo di fornire nuovi scaffold per potenziali inibitori della FPPS, ed è stato condotto con due procedure parallele e due programmi diversi, basati su metodologie di calcolo completamente differenti.

I risultati ottenuti non sono sovrapponibili: la procedura di filtrazione in parallelo utilizzando IPA e A13 come

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