nell’analisi del liquido seminale
Nota 2: I campioni con una bassa percentuale di spermatozoi dotati di motilità progressiva (per esempio, il 10% o meno) possono non fornire
3.8 Test biochimici per la funzione delle ghiandole accessorieaccessorie
3.8.2 Dosaggio del fruttosio nel plasma seminale
3.8.2.1 Premessa
Il metodo descritto di seguito è basato su quello di Karvonen e Malm [247], modifi-cato per l’uso di un lettore di piastre a 96 pozzetti con sensibilità 74 µmol/l [240]. I volumi di liquido seminale e dei reagenti possono essere regolati proporzionalmente per gli spettrofotometri utilizzando cuvette da 3 ml o 1 ml. Le correzioni appropriate devono essere fatte nel calcolo dei risultati. Il basso contenuto di fruttosio nel liquido seminale è caratteristico dell’ostruzione dei dotti eiaculatori, dell’assenza congenita bilaterale dei vasi deferenti [130, 131, 133], dell’eiaculazione retrograda parziale o della carenza di androgeni.
3.8.2.2 Principio
Sotto l’influenza del calore e di un pH basso, il fruttosio forma un complesso colorato con l’indolo, che assorbe la luce di lunghezza d’onda 470 nm.
3.8.2.3 Reagenti
Esistono in commercio kit per il dosaggio del fruttosio nel plasma seminale. In alter-nativa, preparare i seguenti reagenti.
•
Agente deproteinizzante 1 (63 µmol/l ZnSO4): sciogliere 1,8 g di ZnSO4•7H2O in 100 ml di acqua purificata.•
Agente deproteinizzante 2 (1 mol/l NaOH): sciogliere 0,4 g di NaOH in 100 ml di acqua purificata.3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
•
Colorante (indolo 2 µmol/l in conservante benzoato 16 µmol/l):•
sciogliere 200 mg di acido benzoico in 90 ml di acqua purificata agitando in un bagno d’acqua a 60°C;•
sciogliere 25 mg di indolo in questo e portare a 100 ml con acqua purificata;•
se ci sono segni di particolato nella soluzione, filtrare (dimensione dei pori 0,45 µm);•
conservare a +4°C.•
Soluzione stock standard di fruttosio (22,4 mmol/l):•
sciogliere 403 mg di D-fruttosio in 100 ml di acqua purificata;•
conservare a 4°C o congelare (-20°C) in aliquote.•
Curva standard: diluire lo standard di 2,24 mmol/l con acqua purificata per otte-nere quattro standard aggiuntivi di 1,12, 0,56, 0,28 e 0,14 mmol/l.•
Pool di controllo di qualità interno congelato di plasma seminale: vedere Sezione 3.8.4, p. 135.3.8.2.4 Procedura
Per i passaggi 1-3, la procedura può essere fatta in comune con le valutazioni dello zinco (Sezione 3.8.1, p. 126) e dell’α-glucosidasi (Sezione 3.8.3, p. 132), e preferibil-mente il passo 4 è fatto in comune con le valutazioni dello zinco.
1. Centrifugare il campione residuo dopo l’analisi del liquido seminale per 10-15 mi-nuti a 3.000 g, decantare e conservare il plasma seminale privo di spermatozoi a -20°C fino al momento dell’analisi.
2. Scongelare il plasma seminale privo di spermatozoi. Scongelare anche un’aliquo-ta di plasma seminale per il controllo di qualità interno (Sezione 3.8.4, p. 135).
9 Fattore di diluizione ×40 come descritto nella Sezione 3.8.2.4.
Standard (mmol/l) Corrispondente9 al fruttosio
seminale (mmol/l) Standard di fruttosio
22.4 mmol/l (µl) Acqua purificata (µl)
2,24 89,6 100 900
1,12 44,8 50 950
0,56 22,4 25 975
0,28 11,2 12,5 988
0,14 5,6 6,3 994
0,0 0,0 0 1.000
Tabella 3.6 Standard raccomandati per il dosaggio del fruttosio
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
3. Mescolare bene i campioni di plasma seminale in un mixer vortex.
4. Diluizione: la diluizione raccomandata è 1 : 40. Se combinato con valutazioni dello zinco, ulteriori diluizioni per le misurazioni di zinco possono essere fatte dalla diluizione iniziale di 1 : 40 necessaria per il dosaggio del fruttosio:
•
diluizione A 1: diluire 40 (1+39) di ogni campione di plasma seminale: a 975 µl di H2O purificata in ciascuna delle due vials da 1,5 ml, aggiungere 25 µl di plasma seminale (con una pipetta a spostamento positivo) e mescolare agitando per 5 secondi.5. Deproteinizzare: a 200 µl di campione diluito a 1 : 40, aggiungere 50 µl di 63 µmol/l ZnSO4 e 50 µl di 0,1 mol/l NaOH e mescolare. Lasciare riposare per 15 minuti a temperatura ambiente, poi centrifugare a circa 8.000 g per 5 minuti.
6. Trasferire 100 µl di surnatante da ogni campione in una vial. Includere aliquote da 100 µl di ogni standard (inclusi i bianchi).
7. Aggiungere 100 µl di reagente di indolo in ogni vial e mescolare.
8. Aggiungere 1 ml di acido cloridrico (HCl) concentrato (37% v/v) a ciascun cam-pione, coprire con una pellicola da laboratorio modellabile e autosigillante e me-scolare accuratamente in una cappa aspirante.
9. Riscaldare per 20 minuti a 50°C in un bagno d’acqua. Mescolare e raffreddare in acqua ghiacciata per 15 minuti.
10. Trasferire con cura 250 µl in replicato a una piastra a 96 pozzetti in una cappa aspirante.
11. Sigillare la piastra a 96 pozzetti con una pellicola da laboratorio adesiva per proteggere lo spettrofotometro dall’acido.
12. Leggere la piastra alla lunghezza d’onda di 470 nm, utilizzando l’acqua come bianco per impostare lo zero.
3.8.2.5 Calcolo
1. Sottrarre i valori di assorbanza di base (standard 0 µmol/l) dagli standard, dai plasma seminali testati e dai controlli.
2. Leggere la concentrazione di fruttosio nel campione dalla curva standard (mmol/l) confrontando i valori di assorbanza.
3. I risultati al di sopra dello standard superiore non indicano un possibile disturbo clinico. I valori possono non essere esatti e possono essere riportati come > 90 mmol/l e un nuovo test non è solitamente necessario.
4. Moltiplicare i risultati di ogni campione per il fattore di diluizione di 40 per ottene-re la concentrazione di fruttosio (mmol/l) nel plasma seminale non diluito.
5. Per ogni plasma seminale si calcola la media dei due replicati:
•
per i risultati > 10 mmol/l, i replicati non dovrebbero discostarsi oltre il 10%, cioè (differenza tra stime/media delle stime) ≤ 10%;3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
•
in caso contrario, ripetere il test su due nuove aliquote di liquido seminale;•
per i risultati ≤10 mmol/l, qualsiasi differenza superiore a 0,5 mmol/l dovreb-be essere valutata per determinare se un errore in uno dei replicati indica una possibilità di errore diagnostico o se la differenza è clinicamente irrilevante. Se pertinente, ripetere il test su due nuove aliquote di eiaculato.6. Moltiplicare la concentrazione per il volume del liquido seminale (ml) per ottenere il contenuto totale di fruttosio (µmol) dell’eiaculato.
3.8.2.6 Limite di riferimento inferiore
Il limite di riferimento inferiore per il fruttosio è di 13 µmol per eiaculato [245 e dati non pubblicati da TG Cooper].