Dosaggio della α-glucosidasi neutra nel plasma seminale

3.8.3.1 Premessa

Il plasma seminale contiene sia un isoenzima α-glucosidasi neutro, che ha origi-ne origi-nell’epididimo, sia un isoenzima acido prodotto dalla prostata. Quest’ultimo può essere inibito selettivamente dal sodio dodecil solfato (SDS) [248] per permettere la misurazione dell’α-glucosidasi neutra, che riflette la funzione epididimaria. Cal-colare l’esaurimento del substrato, non glucosidasi correlato, utilizzando l’inibitore castanospermina, che rende il test più sensibile. Il metodo descritto di seguito è da utilizzare con un lettore di piastre a 96 pozzetti con sensibilità 1,9 mU/ml [249]. I vo-lumi del liquido seminale e dei reagenti possono essere regolati proporzionalmente per gli spettrofotometri con cuvette da 3 ml o da 1 ml. Le correzioni appropriate devono essere fatte nel calcolo dei risultati.

3.8.3.2 Principio

La glucosidasi converte il substrato sintetico glucopiranoside in p-nitrofenolo, che diventa giallo (lunghezza d’onda 405 nm) con l’aggiunta di carbonato di sodio.

3.8.3.3 Reagenti

È disponibile in commercio un kit per il dosaggio, nel liquido seminale, dell’α-gluco- sidasi neutra epididimaria. Solo i kit che includono SDS e castanospermina sono raccomandati per la misurazione di questo enzima nel liquido seminale. In alterna-tiva, preparare i seguenti reagenti.

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Tampone 1 (fosfato 0,2 mol/l, pH 6,8):

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sciogliere 4,56 g di K₂HPO₄•3H₂O in 100 ml di acqua purificata;

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sciogliere 2,72 g di K₂HPO₄ in 100 ml di acqua purificata;

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miscelare approssimativamente uguali volumi di ciascuna soluzione fino a un pH di 6,8.

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

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Tampone 2: sciogliere 1 g di SDS in 100 ml di tampone 1. L’SDS precipita durante la conservazione a +4°C ma si ridissolve con un leggero riscaldamento.

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Reagente colorato 1 (per fermare la reazione, carbonato di sodio 0,1 mol/l): scio-gliere 6,20 g di N₂CO₃•H₂O in 500 ml di H₂O.

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Reagente colorato 2: sciogliere 0,1 g di SDS in 100 ml di reagente colorato 1.

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Substrato p-nitrofenolo glucopiranoside (PNPG) (5 mg/ml): sciogliere 0,1 g di

PNPG in 20 ml di tampone 2 e scaldare la soluzione su una piastra a circa 50°C, agitando per circa 10 minuti. Alcuni cristalli possono rimanere insoluti. La solu-zione dev’essere mantenuta a 37°C durante l’uso. Preparare una nuova solusolu-zione per ogni test.

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Inibitore della glucosidasi per il bianco (castanospermina, 10 mmol/l):

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sciogliere 18,9 mg di castanospermina in 10 ml di acqua purificata;

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diluire 10 volte in acqua purificata per dare una soluzione di lavoro di 1 mmol/l;

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congelare aliquote di circa 1 ml a -20°C.

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Curva standard.

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Soluzione stock di prodotto p-nitrofenolo (stock-PNP) (5 mmol/l):

 sciogliere 69,5 mg di PNP in 100 ml di acqua purificata, riscaldando la soluzio-ne se soluzio-necessario;

 conservare a +4°C al buio in un flacone ricoperto di foglio di alluminio o di ve-tro marrone;

 preparare una nuova soluzione standard ogni 3 mesi.

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Preparare la soluzione di lavoro (200 µmol/l standard di lavoro) per la curva standard (entro l’ultima ora di incubazione): mettere 400 µl di 5 mmol/l stock-PNP in un matraccio graduato da 10 ml e portare a 10 ml con il reagente colo-rato 2.

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Diluire lo standard di lavoro di 200 µmol/l con il reagente colorato 2 per ottene-re quattro standard aggiuntivi di 160, 120, 80 e 40 µmol/l PNP.

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Pool di controllo di qualità interno congelato di plasma seminale: vedere Sezione 3.8.4, p. 135.

Concentrazione finale

di PNP Corrispondente all’attività

del liquido seminale(mIU/ml) Soluzione di lavoro

200 µmol/l (µl) Reagente colorato 2 (µl)

200 µmol/l PNP 124 1.000 0

160 µmol/l PNP 99 800 200

120 µmol/l PNP 74 600 400

80 µmol/l PNP 50 400 600

40 µmol/l PNP 25 200 800

0 µmol/l PNP 0 0 1.000

Tabella 3.7 Standard raccomandati per la valutazione dell’attività dell’α-glucosidasi

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

3.8.3.4 Procedura

I passaggi 1-3 possono essere fatti in comune con le valutazioni dello zinco (Sezione 3.8.1, p. 126) e del fruttosio (Sezione 3.8.2, p. 129).

1. Centrifugare il campione di liquido seminale residuo dopo l’analisi per 10-15 mi-nuti a 3.000 g. Decantare e conservare il plasma seminale senza spermatozoi a -20°C fino al momento dell’analisi. Il plasma seminale privo di spermatozoi può essere unito ad altri campioni per fornire un pool di controllo di qualità come standard interno per i test futuri.

2. Scongelare il plasma seminale privo di spermatozoi e mescolare bene in un mixer vortex. Scongelare anche un’aliquota di plasma seminale per il controllo di qualità interno.

3. Mescolare bene i campioni di plasma seminale in un mixer vortex.

4. Mettere aliquote di 15 µl di plasma seminale in ciascuna delle due vials da 1,5 ml usando una pipetta a spostamento positivo. Includere i bianchi di replicato (15 µl di acqua) e i campioni quadruplicati di controllo di qualità interno da 15 µl dai pool di plasma seminale.

5. A due dei campioni interni di controllo qualità aggiungere 8 µl di castanospermi-na 1 mmol/l per fornire il valore del bianco del plasma semicastanospermi-nale.

6. Aggiungere 100 µl di soluzione di substrato PNPG, a circa 37°C, in ogni vial.

7. Miscelare con vortex ogni vial e incubare a 37°C per 2 ore (il controllo esatto della temperatura e del tempo sono fondamentali).

8. Fermare l’incubazione dopo 2 ore aggiungendo 1 ml di reagente di colorato 1 e miscelare.

9. Trasferire 250 µl di campioni e standard in una piastra a 96 pozzetti.

10. Leggere la piastra in un lettore di piastre a 96 pozzetti alla lunghezza d’onda di 405 nm entro 60 minuti, utilizzando l’acqua come bianco per impostare lo zero.

3.8.3.5 Calcolo

1. Leggere la concentrazione di PNP prodotta dal campione dalla curva standard (µmol/l) confrontando i valori di assorbanza.

2. I risultati al di sopra dello standard superiore non indicano un possibile disturbo clinico. I valori possono non essere esatti e possono essere riportati come > 124 mIU/ml, e un nuovo test non è solitamente necessario.

3. Moltiplicare per il fattore di correzione (0,6194) per ottenere l’attività della gluco-sidasi neutra nel plasma seminale non diluito (IU/l).

4. Sottrarre l’attività (IU/l) della castanospermina del bianco del plasma seminale da ogni campione per ottenere l’attività corretta (legata alla glucosidasi).

5. La differenza tra i replicati non dovrebbe essere superiore al 10% (cioè la diffe-renza tra valori/media dei valori deve essere ≤10%). Se non concordano, ripetere

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

il dosaggio su due nuove aliquote se i due risultati divergenti indicano esiti diagno-stici diversi.

6. Moltiplicare l’attività corretta per il volume totale del liquido seminale (ml) per ottenere l’attività della glucosidasi (mU) dell’eiaculato.

3.8.3.6 Limiti di riferimento

Un limite di riferimento inferiore per l’α-glucosidasi neutra è di 20 mU/eiaculato [245 e dati non pubblicati da TG Cooper]. In un confronto tra 1.262 eiaculati post-vasec-tomia senza spermatozoi e 1.106 eiaculati con > 40 milioni di spermatozoi, il cut-off migliore è stato 23,1 mU/eiaculato [250]. Ci sono anche indicazioni che gli eiaculati post-vasectomia raccolti dopo un lungo periodo di astinenza eiaculatoria possono avere valori elevati di α-glucosidasi neutra, soprattutto quelli con un alto contenuto di zinco, indicando una possibile interazione dell’α-glucosidasi prostatica con il test [250].

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 145-148)