nell’analisi del liquido seminale
Nota 2: I campioni con una bassa percentuale di spermatozoi dotati di motilità progressiva (per esempio, il 10% o meno) possono non fornire
3.8 Test biochimici per la funzione delle ghiandole accessorieaccessorie
3.8.1 Dosaggio dello zinco nel plasma seminale
3.8.1.1 Premessa
Esistono kit disponibili in commercio. Un metodo dettagliato e utile per la valutazio-ne della presenza di zinco in differenti fluidi è descritto qui di seguito [243]. Questo metodo può essere adattato per il liquido seminale come un precedente test com-merciale [244], modificato per l’uso di un lettore di piastre a 96 pozzetti con sensi-bilità 4 µmol/l [245]. I volumi del liquido seminale e dei reagenti possono essere regolati proporzionalmente per gli spettrofotometri utilizzando cuvette da 3 ml o 1 ml. Le correzioni appropriate devono essere fatte nel calcolo dei risultati.
3.8.1.2 Principio
Il composto 2-(5-bromo-2-piridilazo)-5-(N-propil-N-solfopropilammino)-fenolo (5-Br-PAPS) si lega allo zinco, producendo un cambiamento di colore.
5-Br-PAPS + Zn2+ → complesso 5-Br-PAPS-Zn, che assorbe la luce a una lunghezza d’onda massima di 552 nm.
3.8.1.3 Reagenti
•
Soluzioni di stock:•
H2O bidistillata – per ogni preparazione sottostante: in totale 400 ml necessari.•
Tampone bicarbonato carbonato, pH 9,8, 200 mmol/l Per esempio, Sigma-Aldrich C3041: sciogliere 13 capsule in 325 ml di acqua purificata.
Controllare che il pH sia 9,8.
Conservare a +4°C; durata di conservazione di almeno 3 mesi.
•
5-Br-PAPS, 0,7 mmol/l Per esempio, Sigma-Aldrich 180017 (Mw 537,3): 19 mg in 50 ml di tampone di bicarbonato.
Conservare a +4°C; durata di conservazione di almeno 3 mesi.
•
Sodio citrato, 850 mmol/l Per esempio, Sigma-Aldrich C3674 (Mw 258,1): 11,0 g in 50 ml di tampone di bicarbonato.
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Conservare a +4°C; durata di conservazione di almeno 3 mesi.
•
Mesilato di deferoxamina, 205 mmol/l Per esempio, Sigma-Aldrich D9533 (Mw 656,8): 96 mg in 60 ml di tampone bicarbonato carbonato.
Conservare a +4°C; durata di conservazione almeno 3 mesi.
•
Salicilaldoxima, 29 mmol/l Per esempio, Sigma-Aldrich 84172 (Mw 137,1): 239 mg in 60 ml di acqua purificata.
Conservare a +4°C; durata di conservazione almeno 3 mesi.
•
Zinco standard (50 µmol/l)•
Preparazione: sciogliere 0,288 g di ZnSO4•7H2O in 100 ml di acqua purificata (concentrazione di zinco 10 mmol/l);
diluire questo 200× (aggiungere 0,5 ml a 99,5 ml di acqua purificata) per otte-nere 50 µmol/l di stock;
mescolare bene e conservare congelato a -20°C per un massimo di 1 anno in aliquote da 2 ml in vials ermetiche.
•
Curva standard: diluire lo zinco standard da 50 µmol/l con acqua purificata per ottenere quattro standard aggiuntivi da 40, 20, 10 e 5 µmol/l.•
Soluzioni di lavoro (preparate durante il giorno per il test)•
Soluzione A: preparare mescolando: tampone di bicarbonato di carbonio, 7,0 ml;
soluzione stock di 5-Br-PAPS, 4,0 ml;
soluzione stock di citrato di sodio, 4,0 ml;
soluzione stock di deferoxamina mesilato, 5,0 ml.
•
Soluzione di lavoro finale: prepararla mescolando: soluzione A, 20 ml;
salicilaldoxima, 5 ml;
durata di conservazione di 1 settimana a +4-8°C.
•
Pool di controllo di qualità interno congelato di plasma seminale: vedere Sezione 3.8.4, p. 135.Standard Corrispondente8 allo zinco
seminale (mM) Zinco standard 50 µmol/l (ml) Acqua purificata
40 µmol/l 8 0,8 0,2
20 µmol/l 4 0,4 0,6
10 µmol/l 2 0,2 0,8
5 µmol/l 1 0,1 0,9
0 µmol/l 0 0 1,0
Tabella 3.5 Standard raccomandati per le valutazioni dello zinco
8 Fattore di diluizione ×200 come descritto nella Sezione 3.9.1. In un materiale di circa 45.000 eiaculati, più del 99,5% aveva meno di 8 mM in concentrazione di zinco [246].
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
3.8.1.4 Procedura
I passi 1-3 possono preferibilmente essere fatti in comune con la valutazione del fruttosio (Sezione 3.8.2, p. 129) e dell’α-glucosidasi (Sezione 3.8.3, p. 132); anche la diluizione 1 nel passaggio 4 può essere fatta preferibilmente in comune con la valu-tazione del fruttosio.
1. Centrifugare il campione residuo dopo l’analisi del liquido seminale per 10-15 mi-nuti a 3.000 g, decantare e conservare il plasma seminale privo di spermatozoi a -20°C fino al momento dell’analisi.
2. Scongelare il plasma seminale privo di spermatozoi. Scongelare anche un’aliquo-ta di plasma seminale per il controllo di qualità interno (Sezione 3.8.4, p. 135).
3. Mescolare bene i campioni di plasma seminale in un mixer vortex.
4. Procedura di diluizione. La diluizione del plasma seminale non diluito richiede l’uso di una pipetta a spostamento positivo per ottenere un corretto volume di plasma seminale. In genere, si procede con una diluizione di 1 : 200. La procedura in due passaggi qui descritta semplifica l’intera analisi biochimica, poiché le dilu-izioni usate nel primo passaggio possono essere utilizzate anche per la determi-nazione del fruttosio.
•
Diluizione 1: diluizione 1 : 40 (1+39) di ogni campione di plasma seminale: a 975 µl di H2O purificata in ciascuna delle due vials da 1,5 ml, aggiungere 25 µl di plasma seminale (con una pipetta a spostamento positivo) e mescolare agitando per 5 secondi. Le diluizioni preparate possono essere utilizzate anche per le valutazioni del fruttosio (Sezione 3.8.2, p. 129) senza ulteriore diluizione.•
Diluizione 2: diluire la prima diluizione 1 : 5 (1+4): a 400 µl di H2O purificata, ag-giungere 100 µl del plasma seminale diluito 1 : 40 dal passaggio 1 di cui sopra (diluizione finale 1 : 200). La pipetta a spostamento positivo non è necessaria in questa fase.5. Aggiungere aliquote replicate di 40 µl dei campioni di plasma seminale diluiti dal punto 2 in una piastra a 96 pozzetti. Includere come controlli bianchi acqua purifi-ca (40 µl di acqua purifipurifi-cata) e 40 µl di replipurifi-cati di ciascuno degli standard.
6. Aggiungere 200 µl di reagente colorato a ogni pozzetto e mescolare per 5 minuti su un agitatore per piastre a 96 pozzetti.
7. Leggere la piastra alla lunghezza d’onda di 552 nm [243].
3.8.1.5 Calcolo
1. Sottrarre i valori di assorbanza di fondo (standard 0 µmol/l) dagli standard, dai plasma seminali testati e dai controlli.
2. Leggere la concentrazione di zinco nel campione dalla curva standard (µmol/l) confrontando i valori di assorbanza.
3. I risultati al di sopra dello standard superiore sono estremamente insoliti [246]
e non indicano un possibile disturbo clinico. I valori possono non essere esatti e possono essere riportati come > 8 mmol/l, e un nuovo test non è solitamente necessario.
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
4. Moltiplicare i risultati per il fattore di diluizione di 200 per ottenere la concentra-zione di zinco (mmol/l) nel plasma seminale non diluito.
5. Per ogni campione di eiaculato, viene calcolata la media dei due replicati.
•
Per risultati > 1,5 mmol/l, i replicati dovrebbero concordare entro il 10%, cioè (differenza tra stime/media delle stime) ≤ 10%. In caso contrario, ripetere il test su due nuove aliquote di liquido seminale.•
Per i risultati ≤1,5 mmol/l, qualsiasi differenza superiore a 0,1 mmol/l dovreb-be essere valutata per determinare se un errore in uno dei replicati indica una possibilità di errore diagnostico o se la differenza è clinicamente irrilevante. Se pertinente, ripetere il test su due nuove aliquote di liquido seminale.6. Moltiplicare la concentrazione per il volume totale di liquido seminale (ml) per ottenere il contenuto totale di zinco (µmol/l) nell’eiaculato.
3.8.1.6 Limite di riferimento inferiore
Il limite di riferimento inferiore per lo zinco è 2,4 µmol per eiaculato [245 e dati non pubblicati da TG Cooper].