Tutti gli aspetti della raccolta e dell’esame dell’eiaculato, se i risultati devono fornire
E. Groviglio (teste e code intrecciate; le teste non sono
2.4.9 Morfologia nemaspermica
2.4.9.6 Esaminare il preparato colorato
Classificazione della morfologia nemaspermica
Per una valutazione utile della morfologia degli spermatozoi, è essenziale che que-sta sia eseguita da personale di laboratorio addestrato che esegua regolarmente
6 Lo xilene è pericoloso per la salute e non dovrebbe essere usato. Ci sono ora dei sostituti, come NeoClear.
2. Esame di base
ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
l’IQC. Per fare confronti interlaboratorio e implementare tecniche e limiti decisiona-li sviluppati in altri centri, è essenziale partecipare anche ad adeguate valutazioni esterne della qualità (EQA). La classificazione qui raccomandata è quella di sperma-tozoi sia ideali (“spermasperma-tozoi tipici in grado di raggiungere il sito di fecondazione”) sia anormali, in base al riconoscimento di anomalie in tutte le sedi dello spermatozoo.
Per eseguire una corretta valutazione morfologica, il clinico deve conoscere tutti i criteri, il che significa che anche se il laboratorio sceglie di riportare solo la percen-tuale di spermatozoi tipici o anormali, IQC ed EQA devono valutare la capacità di ri-conoscere correttamente le anomalie in tutte le sedi. Nel valutare la normalità mor-fologica dello spermatozoo si devono applicare i criteri che seguono [95, 99, 115].
Gli spermatozoi sono composti da una testa e una coda. La parte della coda che è collegata alla testa e alla parte più spessa che contiene i mitocondri è chiamata tratto o segmento intermedio. Il resto della coda consiste nel tratto o segmento principale (un assonema, o struttura ciliare, circondato da fibre esterne dense), in una guaina fibrosa con colonne longitudinali [116] e nel tratto terminale. Dato che la parte terminale è difficile da vedere con un microscopio ottico, la cellula può essere considerata come composta da una testa (e collo) e da una coda (tratto intermedio e tratto principale). Affinché uno spermatozoo sia considerato senza anomalie, la testa, il tratto intermedio, la coda e il residuo citoplasmatico devono essere consi-derati normali. Tutte le forme borderline dovrebbero essere considerate anormali.
In generale, la forma della testa sembra essere più importante della dimensione esatta (Sezione 2.5.16, p. 80). Va notato che le teste grandi in maniera anorma-le non sono normali: esistono spermatozoi diploidi con un’area della testa lateraanorma-le piatta ~1,6 volte la dimensione di una testa di spermatozoo ideale. Si può valutare al meglio la morfologia normale degli spermatozoi imparando a riconoscerne le sottili variazioni di forma (teste e code di spermatozoi normali/borderline; Figure 2.13, p.
57, 2.14, p. 59 e 2.15, p. 62).
La spermatogenesi difettosa e alcune patologie epididimali sono comunemente associate a un’aumentata percentuale di spermatozoi con forme anomale. I difetti morfologici sono di solito misti. Gli spermatozoi anormali hanno generalmente un potenziale di fecondazione inferiore, a seconda del tipo di anomalia, e possono an-che avere un DNA anormale. I difetti morfologici sono stati associati a una maggiore frammentazione del DNA [117], a un’aumentata incidenza di aberrazioni cromoso-miche strutturali [118], a cromatina immatura [119] e aneuploidia [120, 121]. L’enfasi è quindi data alla forma della testa, ma per la comprensione della salute del tratto riproduttivo maschile è importante considerare anche la coda dello spermatozoo (tratto intermedio e principale).
I residui citoplasmatici [122] sono componenti normali degli spermatozoi umani fi-siologicamente funzionali. Sono osmoticamente sensibili e non si conservano bene con le procedure di routine di asciugatura all’aria [109, 123]. Non sono evidenti nei preparati colorati, dove possono apparire come piccole distensioni del tratto inter-medio. Se ingrossati, possono estendersi per tutta la lunghezza del tratto interme-dio, come osservato al contrasto di fase, al contrasto di interferenza differenziale e alla microscopia a raggi X di cellule nemaspermiche vive nel muco cervicale e nel terreno di coltura [108, 124]. L’eccesso di residuo citoplasmatico è associato a spermatozoi anormali prodotti da un processo di spermiazione difettoso. Quest’ec-cesso anormale di citoplasma non dev’essere confuso con i residui citoplasmatici più fisiologici, che possono essere osservati nella microscopia diretta dell’eiaculato ma non negli strisci morfologici essiccati, fissati e colorati [16].
Le code arrotolate (più di 360°, Figura 2.10, p. 50) possono indicare una disfunzione epididimaria [125].
2. Esame di base
ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Figura 2.10 Rappresentazione schematica di alcune forme anomale di spermatozoi umani A. Difetti della testa
B. Difetti del collo e del tratto intermedio C. Difetti della coda D. Residuo citoplasmatico in eccesso A punta(a) (b)
Piriforme (c)
Rotonda Piccola Senza
acrosoma
Amorfa(d) (e)
Vacuolata (f)
Area acrosomiale
piccola
Collo (g) angolato
Inserzione (h) asimmetrica
Inserzione (i) ispessita
Sottile(j) (k)
Corta (l)
Angolata (m)
Arrotolata (n)
> di un terzo della testa
Adattato da Kruger et al., 1993, e riprodotto con il permesso di MQ Medical.
2. Esame di base
ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Categorie di anomalie nemaspermiche Le categorie, o regioni, di interesse sono:
•
testa (%H);•
collo e tratto intermedio (%NM);•
coda (%T);•
eccesso di citoplasma residuo (%C).Si può usare un contacellule a più tasti, con un tasto per l’aspetto normale (ideale/
tipico), uno per le anomalie e uno per ciascuna delle quattro categorie anomale (H, NM, T, C). Per l’inserimento di più anomalie può essere utilizzato un contatore meccanico, di cui va tenuto premuto il primo tasto mentre si inseriscono le altre anomalie osservate sul singolo spermatozoo.
Con questa operazione, ogni spermatozoo viene contato solo una volta e ogni sua anomalia viene valutata separatamente.
Posizione Aspetto normale (ideale/tipico) Anomalie
Testa
La testa dovrebbe essere liscia, dai contorni regolari e generalmente di forma ovale. Ci dovrebbe essere una regione acrosomiale ben definita che comprende il 40-70% dell’area della testa [96]. La regione acrosomiale non dovrebbe contenere grandi vacuoli e non più di due piccoli vacuoli, i quali non dovrebbero occupare più di un quinto della testa dello spermatozoo. La regione post-acrosomiale non dovrebbe contenere vacuoli.
•
acrosoma inferiore al 40% o superiore al 70% dell’area di una testa normale•
rapporto lunghezza/larghezza inferiore a 1,5 (rotondo) o superiore a 2 (allungato)•
forma piriforme (a forma di pera), amorfa, asimmetrica o non ovale della parte apicale•
i vacuoli costituiscono più di un quinto dell’area della testa o si trovano nella zona post-acrosomiale•
teste doppie•
qualsiasi combinazione tra le caratteristiche precedentiTratto intermedio
Il tratto intermedio dovrebbe essere snello, regolare e più o meno della stessa lunghezza della testa dello spermatozoo.
L’asse maggiore del tratto intermedio dovrebbe essere allineato con l’asse maggiore della testa dello spermatozoo.
•
forma irregolare•
sottile o spesso•
inserimento asimmetrico o angolato alla testa•
piegato bruscamente•
qualsiasi combinazione tra le caratteristiche precedentiTratto principale
Il tratto principale dovrebbe avere
un calibro uniforme per tutta la lunghezza, essere più sottile del corpo centrale e lungo circa 45 µm (circa 10 volte la lunghezza della testa). Può essere riavvolto su sé stesso a condizione che non ci sia un’angolazione netta, indicativa di un flagello rotto.
•
qualsiasi combinazione tra le caratteristiche precedenti Residuocitoplasmatico
Le goccioline citoplasmatiche (meno di un terzo delle dimensioni della testa di uno spermatozoo normale) sono normali.
•
il citoplasma residuo è considerato un’anomalia solo quando supera un terzo della dimensione normale della testa dello spermatozooTabella 2.6 Classificazione della morfologia nemaspermica
2. Esame di base
ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
•
Dalla valutazione di 200 spermatozoi è possibile ottenere la percentuale di sper-matozoi ideali e anomali (le due cifre dovrebbero sommarsi al 100%), così come la percentuale di ogni tipo di anomalia, ovvero %H, %NM, %T e %C (se la valutazione è stata fatta correttamente, la somma di queste percentuali dovrebbe essere su-periore a 100%).•
La percentuale di spermatozoi in queste classi di anomalie si ottiene dividendo il numero totale di spermatozoi con un difetto nella categoria per il numero totale conteggiato. Questi numeri sono usati per calcolare l’indice di teratozoospermia, o TZI (Sezione 3.2, p. 86).Descrizioni di altri difetti specifici dello spermatozoo e di altri tipi di cellule
Occasionalmente, s’incontreranno spermatozoi con un difetto strutturale specifi-co. Per esempio, l’acrosoma può non svilupparsi, dando origine al “difetto della testa rotonda” o “globozoospermia”. Se la placca basale non riesce ad attaccarsi al nucleo al polo opposto all’acrosoma durante la spermiazione, le teste vengono assorbite e nello spermatozoo si trovano solo le code (il cosiddetto “difetto della testa di spillo”). Le teste di spillo (code libere) non sono contate come difetti della testa, poiché non possiedono cromatina o struttura della testa anteriormente alla piastra basale. I pazienti i cui spermatozoi mostrano tutti uno di questi difetti sono solitamente sterili; si tratta di casi rari, ma è fondamentale che siano identificati e correttamente segnalati. Se ci sono molte teste di spillo o teste libere, può essere determinata la loro prevalenza rispetto agli spermatozoi (Sezione 2.5.16 e 2.5.17, p. 80).
Riportare la presenza e la prevalenza relativa agli spermatozoi di:
•
difetti specifici degli spermatozoi, per esempio teste di spermatozoi libere, teste di spillo (code libere), teste prive di acrosomi;•
cellule germinali immature (Figure 2.15, p. 62 e 2.16, p. 63);•
cellule non spermatiche (Figure 2.15, p. 62 e 2.16, p. 63).Se ci sono molti di questi difetti o cellule non spermatiche, si può determinare la loro prevalenza rispetto agli spermatozoi.
Un ordine strutturato per la valutazione della morfologia nemaspermica
La valutazione sequenziale didattica di ogni spermatozoo è utile sia per la formazio-ne che per l’analisi di routiformazio-ne [126].
2. Esame di base
ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Figura 2.11 Ordine strutturato per la valutazione della morfologia nemaspermica
* Completo di testa e coda, chiaramente visibile e non sovrapposto ad altre cellule o componenti. (se non sopra) e alterazioni
della testa
ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Valutazione microscopica e calcolo dei risultati
Con il paradigma di valutazione morfologica qui raccomandato, tutte le regioni fun-zionali dello spermatozoo dovrebbero essere considerate. Non è necessario distin-guere tutte le variazioni di dimensione e forma della testa, né i vari difetti del tratto intermedio e di quello principale. Anche se il laboratorio riporta solo la percentuale di spermatozoi ideali, l’esaminatore del laboratorio dev’essere in grado di identifica-re tutte le anomalie. Per evitaidentifica-re una selezione distorta di particolari spermatozoi, la valutazione morfologica dovrebbe essere eseguita su ogni spermatozoo valutabile in diverse aree del vetrino selezionate sistematicamente.
Si raccomanda di iniziare a controllare lo striscio, per esempio, con un ingrandimen-to ingrandimen-totale 400x (ottica in campo chiaro) per ottenere un’impressione generale della distribuzione e dell’aspetto degli spermatozoi, delle altre cellule, dei detriti ecc.
La valutazione dettagliata viene fatta usando un obiettivo in campo chiaro a immer-sione in olio 100x e almeno un oculare 10x. L’olio d’immerimmer-sione è essenziale per una migliore visualizzazione al microscopio (indice di rifrazione, RI ~1,5).
1. Valutare tutti gli spermatozoi in ogni campo, passando da un campo microscopico all’altro.
•
Valutare solo gli spermatozoi intatti (quelli con una testa e una coda). Non include-re nella conta le cellule immatuinclude-re. Le teste senza coda devono esseinclude-re conteggiate separatamente e annotate nel referto se sono più di 20 su 100 spermatozoi.•
Non valutare i campi con spermatozoi sovrapposti o con uno spermatozoopo-sizionato di lato. Gli spermatozoi in questi campi vengono valutati solo se tutti i campi hanno tale problema, e in tal caso si annota un commento aggiuntivo nel referto.
2. Valutare almeno 200 spermatozoi per avere un errore di campionamento accet-tabilmente basso.
3. Contare il numero di spermatozoi tipici/normali e le anomalie nelle quattro regio-ni con l’aiuto di un contacellule da laboratorio.
4. Calcolare:
•
le percentuali delle forme tipiche e le percentuali delle anomalie nelle diverse regioni;•
il TZI (la somma di tutte le anomalie divisa per la somma degli spermatozoi anor-mali; il risultato è sempre tra 1,00 e 4,00). Il TZI ha un massimo di quattro difetti per spermatozoo anormale: uno ciascuno per la testa, il tratto intermedio e il tratto principale e uno per l’eccesso di citoplasma residuo.5. Riportare le percentuali delle forme tipiche al numero intero più vicino e il TZI con due cifre decimali.
2. Esame di base
ione3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
55
Fig. 2.12 Papanicolaou plate 1
1
2
4 3
6
5
7
8 9
10 11 12 13
14
24
25 23
26 27
29 28 30
31
32 15
16
18 17
20 19
21
22
Plate 1
n2. Basicexamination 3. Extendedexamination 4. Advanced examinations 5. Sperm preparation techniques 6. Cryopreservation of spermatozoa 7. Quality assuranceand quality control 8. Appendices9. References
Figura 2.12 Tavola di Papanicolaou 1
2. Esame di base
ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Forma
della testa Altri commenti
sulla testa Commenti sul tratto
intermedio Commenti sul tratto
principale Classificazione complessiva dello spermatozoo
1 normale normale normale tipico
2 atipica amorfa normale normale atipico
3 atipica amorfa ispessito normale atipico
4 atipica normale normale atipico
5 atipica amorfa ispessito normale atipico
6 atipica amorfa normale normale atipico
7 atipica PA vac ispessito normale atipico
8 normale normale normale atipico
9 atipica vac normale normale atipico
10 atipica amorfa ispessito normale atipico
11 atipica amorfa ispessito normale
12 normale normale normale tipico
13 atipica ispessito/angolato normale atipico
14 atipica piccola normale normale atipico
15 atipica ispessito normale atipico
16 atipica normale ND atipico
17 normale normale normale tipico
18 normale normale normale tipico
19 normale ispessito normale atipico
20 atipica ispessito normale atipico
21 atipica ispessito normale atipico
22 atipica ispessito normale atipico
23 atipica ispessito ND atipico
24 atipica ispessito normale atipico
25 normale ispessito normale atipico
26 atipica a punta ispessito ND atipico
27 atipica amorfa ispessito normale atipico
28 normale ispessito normale tipico
29 atipica ispessito normale atipico
30 atipica amorfa ispessito doppio
31 atipica asimmetrico normale atipico
32 atipica amorfa/PA vac normale normale atipico
Tabella 2.7 Tavola di Papanicolaou 1
2. Esame di base
ione3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
57
Fig. 2.13 Papanicolaou plate 2
1
2
4 3
6
5
7 8
9 10
11 13
12
14
15
17 16 18
19
20 21
23
24
22
25
26
27
29 28
30 31
32
33 Plate 2
n2. Basicexamination 3. Extendedexamination 4. Advanced examinations 5. Sperm preparation techniques 6. Cryopreservation of spermatozoa 7. Quality assuranceand quality control 8. Appendices9. References
Figura 2.13 Tavola di Papanicolaou 2
2. Esame di base
ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Forma
della testa Altri commenti
sulla testa Commenti sul tratto
intermedio Commenti sul tratto
principale Classificazione complessiva dello spermatozoo
1 normale ispessito normale atipico
2 atipica normale normale tipico
3 atipica ispessito normale atipico
4 atipica ispessito normale atipico
5 atipica ispessito normale atipico
6 normale ispessito normale atipico
7 normale normale normale tipico
8 atipica normale asimmetrico atipico
9 atipica ispessito normale atipico
10 atipica normale ND atipico
11 atipica ispessito normale atipico
12 atipica ispessito asimmetrico atipico
13 normale normale ND atipico
14 atipica normale normale atipico
15 atipica piccola ispessito/asimmetrico normale atipico
16 atipica ispessito normale atipico
17 atipica ispessito normale atipico
18 normale normale normale tipico
19 atipica ispessito normale atipico
20 atipica normale normale atipico
21 normale normale normale atipico
22 atipica normale normale atipico
23 atipica ispessito atipico atipico
24 atipica troppo larga ispessito atipico atipico
25 atipica ispessito normale atipico
26 atipica normale normale atipico
27 normale normale normale tipico
28 atipica ispessito normale atipico
29 normale normale normale tipico
30 atipica piccola normale normale atipico
31 atipica normale normale atipico
32 atipica ispessito asimmetrico atipico
33 atipica a punta ispessito normale atipico
Tabella 2.8 Tavola di Papanicolaou 2
2. Esame di base
ione3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Figura 2.14 Tavola di Papanicolaou 3
2. Esame di base
ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Forma
della testa Altri commenti
sulla testa Commenti sul tratto
intermedio Commenti sul tratto
principale Classificazione complessiva dello spermatozoo
1 atipica ispessito normale atipico
2 atipica ispessito angolato atipico
3 atipica ispessito/asimmetrico ND atipico
4 atipica ispessito ND atipico
5 atipica ispessito normale atipico
6 normale normale normale tipico
7 normale normale normale tipico
8 atipica piccola normale normale atipico
9 atipica PA vac ispessito normale atipico
10 atipica ispessito normale atipico
11 atipica ispessito normale atipico
12 normale normale normale tipico
13 atipica ispessito normale atipico
14 normale ispessito normale atipico
15 atipica ispessito normale atipico
16 atipica ispessito normale atipico
17 atipica normale normale atipico
18 atipica normale ND atipico
19 atipica ispessito ND atipico
20 normale normale normale tipico
21 atipica normale normale atipico
22 atipica a punta normale normale atipico
23 atipica ispessito doppio atipico
24 atipica piccola ispessito normale atipico
25 atipica ispessito normale atipico
26 normale normale normale tipico
27 normale ispessito normale atipico
28 atipica ispessito angolato atipico
29 atipica piccola ispessito normale atipico
30 normale normale normale tipico
31 atipica normale normale atipico
32 normale normale normale tipico
33 atipica a punta normale normale atipico
34 atipica normale normale atipico
Tabella 2.9 Tavola di Papanicolaou 3
2. Esame di base
ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
Forma
della testa Altri commenti
sulla testa Commenti sul tratto
intermedio Commenti sul tratto
principale Classificazione complessiva dello spermatozoo
35 atipica piccola ispessito normale atipico
36 atipica piccola normale normale atipico
37 atipica piccola normale normale atipico
38 atipica normale normale atipico
39 atipica a punta normale normale atipico
40 normale normale normale tipico
Tabella 2.10 Tavola di Papanicolaou 4 Cellula Tipo di cellula
Tabella 2.11 Tavola di Papanicolaou 5 Cellula Tipo di cellula
ne3. Esameesteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi a
Fig. 2.15 Papanicolaou plate 4
tion2. Basicexamination 3. Extendedexamination 4. Advanced examinations 5. Sperm preparation techniques 6. Cryopreservation of spermatozoa 7. Quality assuranceand quality control 8. Appendices9. Refer
Figura 2.15 Tavola di Papanicolaou 4
2. Esamedi base
ne3. Esameesteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi a
Figura 2.16 Tavola di Papanicolaou 5 Fig. 2.16 Papanicolaou plate 5
tion2. Basicexamination 3. Extendedexamination 4. Advanced examinations 5. Sperm preparation techniques 6. Cryopreservation of spermatozoa 7. Quality assuranceand quality control 8. Appendices9. Refer 2. Esamedi base