METODI ANALITICI

La prima analisi dei campioni è stata effettuata impiegando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata ad un rivelatore a serie di diodi (DAD) allo scopo di monitorare l’andamento dei profili degli antociani durante l’ossidazione. L’identificazione dei composti derivati dagli antociani è stata condotta utilizzando la cromatografia liquida a prestazioni ultra elevate (UHPLC) accoppiata alla spettrometria di massa a tempo di volo QTOF.

Nelle analisi HPLC/DAD sono stati analizzati i prelievi del 28/05/2021, del 01/06/2021, del 09/06/2021, del 21/06/2021 e del 07/07/2021 delle tesi “Chips” e “No chips”.

Nell’analisi UHPLC/QTOF sono stati analizzati i prelievi del 28/05/2021, 09/06/2021, 21/06/2021 e 26/07/2021 delle tesi “Chips” e “No chips” eseguendo due ripetizioni analitiche per ogni campione.

Contestualmente alla preparazione dei campioni per l’analisi UHPLC/QTOF è stato misurato il potenziale REDOX degli otto campioni per avere la misura del loro stato di ossidazione.

2.3.1 DETERMINAZIONE DEL PROFILO ANTOCIANICO MEDIANTE HPLC/DAD 2.3.1.1 Preparazione del campione

Il profilo antocianico è stato determinato sui campioni prelevati il 28/05/2021, 01/06/2021, 09/06/2021, 21/06/2021 ed il 07/07/2021 di entrambe le tesi, per un totale di 10 campioni.

L’estrazione e la purificazione degli antociani dai campioni è stata eseguita mediante tecnica SPE (solid-phase-extraction) utilizzando cartucce con fase stazionaria a catene alifatiche apolari a diciotto atomi di carbonio (C18).

Da ogni provetta è stato prelevato un volume di 0.5 mL di vino, diluito in una seconda provetta con 1.5 mL di soluzione di H2SO4 0.1 N. La soluzione ottenuta è stata sottoposta ad estrazione sulla cartuccia C18 Sep-Pak® da 360 mg precedentemente attivata con 3 mL di metanolo HPLC grade (Romil, Cambridge, GB) e 5 mL di Acqua deionizzata e poi lavata con 2 mL di soluzione di H2SO4 0.01 N. Gli antociani sono stati recuperati mediante eluizione con 2 mL di soluzione di CH3OH/H2O/HCOOH (95/5/5 v/v/v). L’eluito è stato poi filtrato con un filtro siringa Clarify® PTFE 0.22 µm (Agela Technology, Cina) e raccolto in una vial per l’analisi HPLC.

2.3.1.2 Determinazione della retta di calibrazione

Le concentrazioni degli antociani determinati con l’analisi HPLC/DAD sono state espresse in mg/L di malvidina-3,5-O-diglucoside.

Prima dell’analisi dei campioni sono state eseguite in serie tre iniezioni di altrettante soluzioni di malvidina-3,5-O-diglucoside (Sigma-Aldrich) alle concentrazioni rispettivamente di 1.43 mg/L, 14.29 mg/L e 107.14 mg/L in CH3OH/H2O/HCOOH (95/5/5 v/v/v). Le analisi sono avvenute nelle stesse condizioni

72

operative seguite per l’analisi dei campioni. L’intensità del segnale è stata espressa come area del picco del cromatogramma registrato alla lunghezza d’onda di 520 nm. L’area del picco è stata misurata attraverso l’apposita funzione del programma di gestione del sistema cromatografico. Conoscendo le aree corrispondenti alle soluzioni a concentrazione nota dello standard è stata costruita la retta di calibrazione e ricavato il fattore di risposta (RF=186517) come coefficiente angolare della retta (figura 2.1).

Figura 2.1 – Retta di calibrazione

2.3.1.2 Condizioni HPLC/DAD

L’analisi HPLC/DAD è stata condotta seguendo la metodica riportata da Favretto e Flamini (2000) modificata per i nostri fini. È stata utilizzata una colonna cromatografica Thermo Hypersil_Keystone ODS Hypersil RP C-18 (5 µm; 200×2.1 mm) condizionata per 28 minuti prima delle analisi e termostatata a 30 °C ed eluizione a gradiente con un flusso di eluente 0.25 mL/min composto da A) H2O/HCOOH 90:10 (v/v) e B) H2O/HCOOH/CH3OH 40:10:50 (v/v/v) (Tabella 2.2). Il volume di campione iniettato era 10 µL.

Tempo (minuti) Fase A H2O/HCOOH

(90:10 v/v)

Fase B

H2O/HCOOH/CH3OH (40:10:50 v/v/v)

0-15 90-74% 10-26%

15-25 74-65% 26-35%

25-35 65-55% 35-45%

35-60 55-30% 45-70%

60-70 30-10% 70-90%

70-72 10-1% 90-99%

72-73 isocratica 1% isocratica 99%

73-77 1-90% 99-10%

Tabella 2.2 – Programma di eluizione a gradiente utilizzato per l’analisi HPLC/DAD.

73

Il cromatogramma HPLC/DAD è stato registrato a lunghezza d’onda 520 nm, l’acquisizione degli spettri di assorbimento è stata eseguita mediante scansione nell’intervallo da 230 a 700 nm.

2.3.2 ANALISI UHPLC/QTOF 2.3.2.1 Preparazione del campione

Lo studio degli antociani e dei loro derivati tramite l’analisi UHPLC/QTOF è stato effettuato sui prelievi del 28/05/2021 (t0), 09/06/2021, 21/06/2021 e del 26/07/2021 di entrambe le tesi per un totale di otto campioni. A 1.5 mL di vino trasferiti in una nuova provetta di polipropilene sono stati aggiunti 100 µL di soluzione di 3,7-diidrossi flavone 20.3 mg/L in CH3OH come standard interno (Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Il campione è stato successivamente diluito 1:4 con acqua deionizzata per ridurre la percentuale etanolo della soluzione ed è stato fatto passare attraverso la cartuccia SPE precedentemente attivata con 3 mL di CH3OH e lavata con 5 mL di acqua deionizzata. Il recupero degli analisti dalla cartuccia è stato eseguito mediante eluizione di 2 mL di metanolo HPLC grade ed il campione è stato filtrato tramite il filtro per siringa CLARIFY-PTFE (politetrafluoroetilene) 0.22 µm, Ø 25 mm (Agela Technologies, Cina) e recuperato in una vial per analisi HPLC.

2.3.2.2 Condizioni UHPLC/QTOF

Per la separazione cromatografica dei composti è stato utilizzato il sistema cromatografico Agilent UHPLC 1290 Infinity accoppiato all’autocampionatore Agilent 1290 Infinity Autosampler (G4226A) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Sul sistema cromatografico è stata montata una colonna a fase inversa Zorbax RRHD SB-C18 3 × 150 mm, 1.8 µm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), mantenuta termostatata alla temperatura di 35 °C.

L’analisi cromatografica è avvenuta con un flusso di eluente di 0.40 mL/min impiegando le fasi mobili A) H2O/HCOOH 99:0.1 (v/v) e B) CH3CN/HCOOH 99:0.1 (v/v) secondo il programma di eluizione a 0-8 95% (isocratica) 5% (isocratica)

8-18 95-55% 5-45%

18-23 55-35% 45-65%

23-27 35-10% 65-90%

27-37 10% (isocratica) 90% (isocratica)

37-40 95% 5%

Tabella 2.3 – Programma di eluizione della colonna cromatografica seguito nell’analisi UHPLC/QTOF

74

Tra le ripetizioni analitiche dello stesso campione la colonna cromatografica è stata lasciata condizionare per 5 minuti. Per le analisi di spettrometria di massa è stato usato lo spettrometro Agilent 6540 Accurate-Mass Q-TOF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) con risoluzione nominale 40000. La tensione dell’ago è stata impostata a 0 kV per la modalità di ionizzazione negativa e a 1 kV per la modalità positiva. La calibrazione dello spettrometro è stata effettuata tramite gli ioni con i rapporti m/z indicati: anione trifluoroacetico (m/z 112.9856) e HP-0921+formiato (m/z 966.0007) per le analisi in modalità di ionizzazione negativa; purina (m/z 121.0509) e HP-0921 (m/z 922.0098) per le analisi in modalità positiva. Lo spettrometro è stato impostato in modalità di acquisizione full-scan dei frammenti m/z nell’intervallo 100-1700.

Condizioni alla sorgente di ionizzazione Jet Stream dello spettrometro:

 Flusso di gas di azoto 10 L/min a 400 °C;

 Flusso di gas di azoto per l’evaporazione del solvente (drying gas) 9 L/min a 350 °C;

 Pressione di nebulizzazione 60 psi;

 Tensione dell’ago 1 Kv;

 Tensione del capillare 3.5 Kv;

Tra le analisi di due campioni diversi è stata effettuata l’iniezione di un bianco. È stato iniettato un volume di campione di 5 µL.

2.3.3 MISURA DEL POTENZIALE REDOX

La misura dei potenziali REDOX dei campioni è stata eseguita utilizzando un pHmetro pH 211 Microprocessor pH Meter (Hanna Instruments, Italia) collegato all’elettrodo Pt 4805-DXK-SB/225 Combination Redox (Mettler Toledo, USA) specifico per la misura dello stato di ossidazione delle soluzioni.

L’elettrodo è stato accuratamente lavato con acqua distillata e avvinato prima di ogni misura. La misura è stata eseguita ad una temperatura di 25 °C.

75