Tutti gli aspetti della raccolta e dell’esame dell’eiaculato, se i risultati devono fornire

E. Groviglio (teste e code intrecciate; le teste non sono

2.4.6 Motilità degli spermatozoi

Il grado di motilità progressiva degli spermatozoi è correlato ai tassi di gravidanza [58-60]. Il numero totale di spermatozoi progressivamente mobili nell’eiaculato ha una significatività biologica e si ottiene moltiplicando il numero totale di spermato-zoi nell’eiaculato per la percentuale di cellule progressivamente mobili. I metodi di valutazione della motilità utilizzati nell’analisi computerizzata del liquido seminale (CASA) sono descritti nella Sezione 4.5.1, p. 155.

Se la liquefazione dell’eiaculato è completa entro 30 minuti, le indagini devono inizia-re da quel momento. In caso di liquefazione incompleta dopo 30 minuti, l’eiaculato può essere lasciato nell’incubatore a 37°C per altri 30 minuti e poi si dovrebbero iniziare le indagini. Le informazioni sul ritardo o sull’assenza della liquefazione do-vrebbero essere annotate nel referto.

La velocità degli spermatozoi mobili è temperatura dipendente. È quindi essenzia-le standardizzare la temperatura durante la valutazione della motilità. Spesso è più facile controllare una temperatura simile a quella del corpo, ma ciò richiede che il microscopio sia dotato di un tavolino portaoggetti a temperatura controlla-ta, che i vetrini portaoggetto e coprioggetto siano preriscaldati e che il campione sia riscaldato a 37°C anche prima della valutazione. Questi aspetti possono essere facilmente eseguiti quando il campione si liquefà in un incubatore a 37°C. Usare la temperatura ambiente è più problematico, anche perché non è un valore definito e quindi può variare in modo sostanziale.

L’uso di un reticolo oculare con griglia (Figura 2.3, p. 25) è raccomandato per fa-cilitare la limitazione dell’area valutata, il che è molto utile in campioni con un alto numero di spermatozoi in ogni campo.

Iniziare sempre visualizzando diversi campi senza contare, per avere un’idea di quanto siano distribuiti gli spermatozoi. Questo può essere fatto a un basso in-grandimento (100-200× inin-grandimento totale).

Evitare di valutare aree vicine (< 5 mm) al bordo del vetrino coprioggetto per evi-tare artefatti legati all’essiccazione, che influenzano la valutazione della motilità.

La scelta del campo dovrebbe essere casuale; evitare di scegliere i campi in base al numero di spermatozoi visti.

Eseguire la valutazione del vetrino in modo sistematico per evitare di visualizzare più volte la stessa area. Si devono valutare almeno 5 campi diversi, anche se sono stati contati più di 200 spermatozoi in meno di 5 campi.

2. Esame di base

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

Iniziare il conteggio di un dato campo in un istante casuale (non aspettare che gli spermatozoi nuotino nel campo o nella griglia).

Valutare la motilità di tutti gli spermatozoi in un’area definita del campo. Selezio-nare la porzione di campo o di griglia da conteggiare in base alla concentrazione di spermatozoi: conteggiare solo la riga superiore della griglia se la concentrazio-ne concentrazio-nemaspermica è alta; conteggiare l’intera griglia se invece è bassa.

Contare sistematicamente, iniziando dagli spermatozoi progressivi rapidi e lenti per evitare di sovrastimarne il numero. L’obiettivo è quello di contare subito tutti gli spermatozoi progressivamente mobili nella sezione della griglia, senza conta-re quelli che entrano nella sezione della griglia a conteggio iniziato. In un secondo conteggio si contano gli spermatozoi non progressivi e immobili che rimangono all’interno della sezione della griglia.

Valutare circa 200 spermatozoi per replicato; ogni replicato è una preparazione a fresco separata.

Se si raggiunge un conteggio di 200 spermatozoi prima che tutte le categorie di motilità di un’area siano state segnate, il conteggio deve continuare oltre i 200 spermatozoi fino a che tutte le categorie siano state contate, per evitare distor-sioni verso la categoria di motilità conteggiata per prima.

Confrontare i valori dei replicati per verificare se sono sovrapponibili in modo accettabile. In caso affermativo, procedere con i calcoli; in caso contrario, pre-parare nuovi preparati. Se tre serie di replicati non sono riuscite a dare risultati vicini in modo accettabile, come risultato viene data una media di tutte e sei le valutazioni, segnalando nel referto che il risultato è la media di valutazioni alta-mente variabili (indicando l’insolita incertezza, che potrebbe essere il risultato di aliquote incongrue).

Per la risoluzione dei problemi di valutazione della motilità, vedere la Sezione 7.10.3, p. 207.

2.4.6.1 Categorie di movimento nemaspermico

Si raccomanda un sistema a quattro categorie per classificare la motilità.

I dati clinici provenienti dalla valutazione manuale della motilità degli spermatozoi e dall’analisi computerizzata di questi ultimi dimostrano che l’identificazione degli spermatozoi in rapida progressione è importante [12, 61-70]. Pertanto, le categorie raccomandate sono (con limiti di velocità approssimativi):

progressiva rapida (≥ 25 µm/s): spermatozoi che si muovono attivamente,

line-armente o in cerchio, coprendo una distanza, dal punto di partenza a quello di arrivo, di almeno 25 µm (o ½ della lunghezza della coda) in un secondo;

progressiva lenta (da 5 a < 25 µm/s): spermatozoi che si muovono attivamente, linearmente o in cerchio, coprendo una distanza, dal punto di partenza a quello di arrivo, da 5 a < 25 µm (o almeno dalla lunghezza della testa a meno di ½ della lunghezza della coda) in un secondo;

non progressiva (< 5 µm/s): tutti gli altri modelli di movimenti attivi della coda con assenza di progressione, ovvero nuotare in piccoli cerchi, con la forza flagellare

2. Esame di base

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

che sposta la testa meno di 5 µm (una lunghezza della testa), dal punto di parten-za a quello di arrivo;

immobile: nessun movimento attivo della coda.

2.4.6.2 Confronto dei replicati e calcolo dei risultati

Calcolare separatamente le percentuali (%) delle quattro categorie di motilità per i due replicati e le percentuali di progressiva e mobile.

Calcolare la media dei due replicati per il gruppo dominante (immobile o mobile).

Calcolare la differenza tra i replicati per il gruppo dominante.

Determinare l’accettabilità della differenza sulla base della Tabella 2.2, p. 26, che indica la differenza massima attesa tra due percentuali nel 95% dei campioni do-vuta a cause casuali. Se la differenza è maggiore del valore indicato nella tabella, vi è meno del 5% di probabilità che sia dovuta a cause casuali.

Se la differenza tra le percentuali è accettabile, riportare la percentuale media per ogni categoria di motilità: (a) progressiva rapida; (b) progressiva lenta; (c) non progressiva; (d) immobile. Se la differenza è invece troppo alta, prendere due nuove aliquote dal campione di liquido seminale, fare due nuove preparazioni e ripetere la valutazione. Se i replicati differiscono più della differenza accettabile, la valutazione non dovrebbe essere ripetuta più di due volte. In tal caso, può essere data come risultato finale una media delle sei valutazioni, insieme con un commento che il risultato è incerto a causa dell’alta variabilità tra le valutazioni replicate.

Riportare la percentuale media per ogni grado di motilità al numero intero più

vicino.

La somma dei quattro gradi dovrebbe essere 100. Se è 99 o 101, viene corretto il valore del gruppo dominante per dare la somma di 100. Se la somma è < 99 o > 101, bisogna eliminare un errore di conteggio o di calcolo.

2. Esame di base

Figura 2.3 Supporti per valutare la motilità degli spermatozoi

(a) Un reticolo oculare facilita il conteggio degli spermatozoi mobili e immobili. (b) Selezionare sistematicamente i campi visivi per la valutazione della motilità degli spermatozoi, ad almeno 5 mm dai bordi del vetrino coprioggetto.

(a) (b)

>5 mm

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 36-39)