Preparazione di strisci di eiaculato

La rapida aggiunta di fissativo all’eiaculato non permette un’adeguata visualizzazio-ne degli spermatozoi, in quanto questi ultimi sono oscurati dalle proteivisualizzazio-ne seminali denaturate. Per l’analisi morfologica, è consuetudine preparare strisci di eiaculato che vengono asciugati all’aria prima della fissazione e della colorazione. Tuttavia, tale processo porta ad artefatti morfologici, poiché l’asciugatura all’aria degli strisci di spermatozoi è associata a:

•

cambiamenti nelle dimensioni degli spermatozoi: gli spermatozoi essiccati, fissati e colorati sono più piccoli di quelli vivi visualizzati nel liquido seminale [107];

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espansione delle teste degli spermatozoi immaturi (Soler et al., 2000);

•

perdita di goccioline citoplasmatiche osmoticamente sensibili [108, 109], anche se vengono mantenute grandi quantità di citoplasma residuo in eccesso.

Figura 2.8 Spermatozoi morfologicamente “normali”

(a, b) Spermatozoi con colorazione di Shorr recuperati dalla zona pellucida in vitro. (c) Spermatozoi colorati con Papanicolaou recuperati dal muco endocervicale dopo un rapporto sessuale. Si osservano pochissimi difetti sulla testa degli spermatozoi, sul tratto intermedio o sul tratto principale. Le code possono essere curve, ma non fortemente angolate.

(a, b) Microfotografie riprodotte da Liu et al., 2003 [103], con il permesso della European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE); (c) riprodotta da Menkveld et al., 1990 [95], per gentile concessione.

(a) (c)

(b)

2. Esame di base

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

Si dovrebbero eseguire due o più strisci dal campione di eiaculato fresco in caso di problemi con la colorazione o di rottura del vetrino.

1. Mescolare bene il campione di eiaculato.

2. Rimuovere immediatamente un’aliquota, senza lasciare il tempo agli spermatozoi di stabilirsi fuori dalla sospensione.

3. Rimescolare il campione di spermatozoi prima di rimuovere le aliquote replicate (il secondo striscio è da usare come riserva in caso di problemi con la colorazione).

Eiaculati con caratteristiche normali

In questa procedura un’aliquota di liquido seminale viene spalmata su tutta la su-perficie del vetrino con la tecnica dello striscio (Figura 2.9).

1. Pulire entrambe le superfici dei vetrini smerigliati strofinando vigorosamente con carta velina priva di lanugine o pulendo con etanolo.

2. Etichettare la parte smerigliata con informazioni identificative con due identifi-catori unici; assicurarsi che la marcatura non possa essere resa illeggibile dal fissaggio, dalla colorazione o dal montaggio.

3. Applicare un’aliquota di 5-10 µl di liquido seminale, a seconda della concentrazione di spermatozoi, all’estremità del vetrino. Usare un secondo vetrino per distribuire la goccia di eiaculato lungo la superficie (Figura 2.9). Se il vetrino trascinatore non è congelato, i bordi di entrambe le estremità del vetrino possono essere usati per fare quattro strisci diversi.

4. Lasciare asciugare i vetrini all’aria e colorare come descritto nella Sezione 2.4.9.2, p. 46.

La qualità dello striscio (sovrapposizione minima di spermatozoi sul vetrino) dipen-de da:

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il volume del liquido seminale e la concentrazione di spermatozoi: meno sono gli spermatozoi, meno è probabile che si sovrappongano tra loro;

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l’angolazione del vetrino di trascinamento: più piccolo è l’angolo, più sottile è lo striscio;

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la velocità di trascinamento: più rapido è il movimento, più sottile è lo striscio.

Figura 2.9 Preparazione di uno striscio di liquido seminale normale

Per ottenere la sensibilità del movimento, porre il vetrino trascinatore con un’angolazione di 45° e muoverlo fino a farlo entrare in contatto con l’aliquota di liquido seminale (a), che si diffonderà lungo il bordo del vetrino (b). Spingere il vetrino trascinatore lentamente indietro (per circa 1 secondo) per tutta la lunghezza del vetrino al fine di ottenere lo striscio (c).

Fotografie per gentile concessione di C. Brazil.

(a) (b) (c)

2. Esame di base

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

Iniziare con un volume di 10 µl, un angolo di 45° e un trascinamento di circa 1 se-condo; questi parametri possono poi essere cambiati, se necessario, per ridurre la sovrapposizione degli spermatozoi sul vetrino [95]. Lo striscio risulta buono quando la viscosità del liquido seminale è bassa, ma spesso non è una tecnica adatta a un eiaculato estremamente viscoso (Figura 2.9).

Eiaculati con caratteristiche anormali

Con basse concentrazioni di spermatozoi (meno di 2×10⁶/ml), campioni viscosi o carichi di detriti potrebbero essere necessari approcci diversi.

Eiaculati con bassa concentrazione di spermatozoi

Se la concentrazione di spermatozoi è bassa (per esempio, meno di 2×10⁶/ml), con-centrare il campione come segue.

1. Centrifugare il campione a 600 g per 10 minuti.

2. Rimuovere la maggior parte del surnatante.

3. Risospendere il pellet nel resto del surnatante pipettando delicatamente.

4. Ottenere la più alta concentrazione di spermatozoi possibile, non superiore a cir-ca 50×10⁶/ml.

5. Trattare come un campione normale (Sezione 2.4.9.2, p. 46).

Eiaculati viscosi

A volte è difficile preparare buoni strisci perché il plasma seminale è altamente viscoso e ne risultano strisci di spessore non uniforme. I campioni viscosi possono essere trattati allo stesso modo dei campioni poco liquefatti (Sezione 2.5.2, p. 64) oppure lavati.

Eiaculati carichi di detriti o viscosi

I detriti e una grande quantità di materiale particolato (come nei campioni viscosi) possono far sì che gli spermatozoi giacciano con la testa sul bordo e siano dunque difficili da classificare. Questi campioni possono essere lavati come segue.

1. Diluire un’aliquota di eiaculato ben miscelato (0,2-0,5 ml, a seconda della concen-trazione di spermatozoi) utilizzando una soluzione salina a 170 mM per ridurre i cambiamenti osmotici agli spermatozoi. A seconda del tempo che passa tra l’e-iaculazione e il preparato, l’osmolalità della prima può essere aumentata a 350-400 mOsm/kg. Un mezzo che è isotonico all’osmolalità generale del corpo (290 mOsm/kg) indurrà uno shock ipotonico agli spermatozoi adattati alla maggiore osmolalità nell’eiaculato liquefatto [17, 18].

2. Centrifugare a 800 g per 10 minuti.

3. Rimuovere la maggior parte del surnatante.

4. Risospendere il pellet nel surnatante rimanente (tipicamente 20-40 µl) pipettando delicatamente.

Nota: questa procedura può influenzare la morfologia nemaspermica e il suo utilizzo dev’essere registrato nel referto finale.

Nota: queste procedure possono influenzare la morfologia nemaspermi-ca e il loro utilizzo dev’essere registrato.

2. Esame di base

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

5. Fare uno striscio della sospensione spargendo 5-10 µl di sospensione spermatica su un vetrino portaoggetti con una pipetta Pasteur (Figura 2.9b).

6. Scansionare il vetrino con un’ottica a contrasto di fase a un ingrandimento di 400x per assicurarsi che lo striscio sia distribuito in modo uniforme.

7. Controllare che ci siano almeno 40 spermatozoi per campo visivo a ingrandimen-to 400x senza raggruppamenti o sovrapposizioni.

8. Lasciare asciugare i vetrini all’aria e colorare come descritto nella Sezione 2.4.9.2.

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Se troppi spermatozoi si sovrappongono sul vetrino, fare un altro striscio usando un’aliquota più piccola di eiaculato.

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Se gli spermatozoi sono troppo scarsi sul vetrino, fare un altro striscio usando un’aliquota più grande di eiaculato.

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Queste procedure possono influenzare la morfologia nemaspermica e il loro

uti-lizzo dev’essere registrato.

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 56-59)