• Non ci sono risultati.

PREPARAZIONE DELLE PROTEINE E DEI LIGAND

PARTE SPERIMENTALE

PREPARAZIONE DELLE PROTEINE E DEI LIGAND

Questo studio computazionale si basa sull’utilizzo delle strutture cristallografiche della FPPS complessata con molecole di piccole dimensioni, presenti nel Protein Data Bank (www.rcsb.org). Le strutture disponibili sono 26, illustrate nella Tabella sottostante, fra le quali alcune in cui il ligando occupa il sito tradizionale dei n-BP (17) e altre 9 in cui composti carbossilici legano un sito allosterico.

Non essendoci evidenze sperimentali sul legame fra IPA e FPPS, non è possibile stabilire a priori quale sia il sito di legame implicato nell’eventuale interazione enzima-inibitore. I complessi cristallografici contenenti inibitori allosterici presentano una conformazione aperta, e il sito di legame è posto in prossimità dell’estremità carbossilica dell’enzima, adiacente al sito dell’IPP. Da una analisi preliminare della possibile interazione dell’IPA con i siti tradizionale e allosterico si è evinta una scarsa possibilità di introduzione efficace di questo composto nel sito allosterico, per limitata compatibilità sterica e per una scarsa componente polare nel sito di legame in grado di stabilizzare il ribosio.

50

Proteina Ligando Dati ligando Tipologia ligando Conformazione

1yq71 MSE Non Allosterico Parzialmente chiusa 1yv51 RIS IC50: 5.7-860 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 1zw51 IPE

ZOL

Non Allosterico Chiusa

2f892 210 IC50: 200-1932 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 2f8c2 ZOL IC50: 3-475.3 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 2f8z2 IPE

ZOL

IC50: 3-475.3 nM Non Allosterico Chiusa

2f922 AHD IC50: 50-2249 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 2f942 BFQ IC50: 20-1052 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 2f9k2 ZOL IC50: 3-475 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 2opm3 NI9 Non Allosterico Parzialmente chiusa 2opn3 SUF IC50: 1000 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 2qis4 RIS IC50: 5.7-860 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 2rah5 11P Non Allosterico Parzialmente chiusa 2vf65 MON IC50: 3 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 3b7l1 MON IC50: 3 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 3rye5 UNR IC50: 19.6-1709 nM Non Allosterico Parzialmente chiusa 3s4j5 UNV Non Allosterico Parzialmente chiusa 3n1v6 3N1 IC50: 500000 nM Allosterico Aperta

3n1w6 3N2 IC50: >500000 nM Allosterico Aperta 3n3l6 MSO IC50: 500000 nM Allosterico Aperta 3n456 3N3

ZOL

3N3 IC50: >500000 nM ZOL IC50: 3-475.3 nM

Allosterico Parzialmente chiusa

3n466 3N5 ZOL

3N5 IC50: 50000 nM ZOL IC50: 3-475.3 nM

Allosterico Parzialmente chiusa

3n496 3N4 IC50: 7000 nM Allosterico Aperta 3n5h6 GO0 IC50: 2000 nM Allosterico Aperta 3n5j6 GO1 IC50: 6000 nM Allosterico Aperta 3n6k6 BFH IC50: 200 nM Allosterico Aperta Tabella 3.1: Strutture cristallografiche utilizzate per il docking

Pertanto, lo studio è stato condotto utilizzando solo le strutture cristallografiche dei N-BP tradizionali complessati con la forma chiusa dell’enzima.

Il primo passaggio della preparazione dei files da utilizzare per il docking è stato la sovrapposizione delle proteine, prendendo come riferimento la 1YQ7.

51 Questo è stato effettuato utilizzando il protocollo Match Maker della utility Structure Comparison. Questo protocollo consente un iniziale allineamento delle sequenze amminoacidiche seguito dalla sovrapposizione delle coppie di residui allineati. Attraverso l’opzione Chain pairing è possibile scegliere quale sequenza della catena deve essere utilizzata come riferimento e quale deve essere sovrapposta. In questo caso è stata scelta l’opzione fornita di default, che permette di effettuare la sovrapposizione di coppie di residui o catene che sono allineate nel miglior modo nella struttura di riferimento e in quella da sovrapporre.

Tramite Maestro sono stati aggiunti alle proteine gli atomi di idrogeno, e le strutture sono state ottimizzate con una breve minimizzazione delle sole catene laterali, eliminate le molecole di acqua e gli eventuali ioni presenti nella struttura cristallografica. Successivamente sono stati estratti i ligandi dai complessi cristallografici ai quali sono stati assegnati gli ordini di legame e le cariche. Sono stati così ricavati il file con la sola proteina (proteina.mol2) e quello con il solo ligando (lig.mol2).

I ligandi sono stati poi traslati e minimizzati per sottoporli al docking senza l’influenza della conformazione iniziale.

DOCKING

I calcoli di docking sono stati lanciati in automatico tramite l’uso di script opportuni. Anche l’analisi quantitativa dei risultati del cross-docking è stata effettuata in automatico, usando script basati su istruzioni per il calcolo del RMSD fra l’orientazione predetta e quella realmente assunta dal ligando nei cristalli risolti tramite RX.

Il docking è stato eseguito in prima battuta sia sulle proteine private dei fosfati sia sul fosfocomplesso, per confrontare i risultati in vista di uno studio aperto a ligandi strutturalmente molto diversi. In particolare, non è prevedibile quale sia l’effetto indotto da ligandi diversi dai classici n-BP al sito di legame, come lo spiazzamento di ioni fosfato o addirittura dell’IPP, né quale sia la sequenza degli eventi enzimatici considerando inibitori con possibili meccanismi alternativi. Considerando però che il docking permette di prevedere le orientazioni dei ligandi nel complesso in un unico istante del meccanismo di catalisi, e cioè nella fase in cui l’enzima è nella conformazione analoga a quella cristallizzata, contenente o IPP o fosfato, è stato scelto di proseguire lo studio mantenendo tali molecole nel sito. Il loro possibile spiazzamento, infatti, non è studiabile solo attraverso il docking ma richiederebbe anche lunghe dinamiche molecolari, che non sono oggetto di questa Tesi.

52 Docking con Gold

Per ogni proteina è stato impostato il docking di tutti ligandi dei raggi X, richiedendo 40 GA runs, ovvero il numero di orientazioni richieste per ogni ligando nella proteina. Il sito attivo è stato definito utilizzando il ligando cristallizzato in quella determinata proteina, con un raggio di 10 Å. Sono state utilizzate tutte le Fitness Function disponibili, ovvero Chemscore, Goldscore, ASP e PLP, lasciando tutte le opzioni selezionate di default dal programma.

Per valutare i risultati forniti da Gold è stata calcolata la RMSD tra l’orientazione dei ligandi co-cristallizzati e la miglior orientazione fornita da Gold utilizzando la routine rms_analysis. I dati così ricavati dell’rmsd sono stati riportati nelle tabelle successive, e ad ogni range di valore è stato assegnato un colore per facilitarne la lettura.

Tabella 3.2: Cross-docking con la funzione Chemscore

53

Tabella 3.4: Cross-docking con la funzione ASP

Tabella 3.5: Cross-docking con la funzione PLP

I risultati ottenuti hanno mostrato un range di RMSD piuttosto variabile, ma frequentemente minore di 2Å . I valori medi di rmsd, calcolati per ogni proteina, sono riportati nella tabella sottostante.

Documenti correlati