L’attività antimicrobica ad ampio spettro delle KT ne aveva suggerito la potenzialità quali nuovi farmaci antibiotici, in alternativa a quelli tradizionali, caratterizzati da una progressiva perdita di efficacia a causa dell’insorgenza di fenomeni di resistenza. Si ritiene, infatti, che i bersagli molecolari di queste tossine siano componenti costitutivi fondamentali, estremamente conservati, delle cellule microbiche. Tuttavia la somministrazione parenterale delle KT quali agenti terapeutici comporta alcuni decisivi svantaggi, in quanto esse sono glicoproteine fortemente antigeniche, tossiche e molto labili in condizioni di temperatura e pH fisiologici.
E’ stato osservato ad esempio uno scompenso nell’omeostasi e nel bilancio elettrolitico dei fluidi intestinali in ratto dopo perfusione con una KT di P. anomala ATCC 96603 (PaKT) (341).
Per questi motivi, sarebbe stato utile produrre composti dotati della stessa efficacia e spettro d’azione, ma nello stesso tempo privi di effetti indesiderati. Secondo la teoria del network idiotipico formulata da Jerne nel 1974 (342), nel corso di una risposta immunitaria nei confronti di un Ag vengono prodotti Ab specifici, che a loro volta stimolano la produzione di Ab anti-idiotipici (anti-Id), che possono rappresentare l’immagine interna dell’Ag. Anche se l’Ab anti-Id deve essere considerato non tanto l’esatta riproduzione topologica della struttura antigenica, bensì una sua riproduzione funzionale, vi sono dati cristallografici che evidenziano come un certo Ab possa interagire con il proprio Ag e con il corrispondente Ab anti-Id mediante gli stessi residui amminoacidici (342). Per questo Ab anti-Id possono essere considerati immagine interna dell’Ag stesso ed essere direttamente utilizzati come vaccini o a volte essere in grado anche di mimare l’attività biologica dell’Ag. Vaccini anti-Id possono
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anche rappresentare un approccio alternativo alle tradizionali terapie anti-cancro, in quanto possono essere prodotti come immagine interna di Ag superficiali presenti nei tumori e stimolare risposte anti-tumorali specifiche (343, 344).
Attraverso l’approccio del network idiotipico è stato possibile riprodurre l’attività antimicrobica di PaKT, come schematizzato in Figura 12.
Figura 12. Schema della teoria del network idiotipico applicato al sistema della tossina killer di Pichia anomala ATCC 96603.
Estratti crudi di PaKT sono stati utilizzati per immunizzare topi, per produrre mAb che reagissero in maniera specifica con la tossina. Tra questi, è stata isolata una IgG1, mAb KT4, in grado di neutralizzare l’attività antimicrobica di PaKT, mimando in qualche modo il legame della tossina stessa al PaKTR parietale dei microrganismi sensibili. Si poteva perciò considerare mAb KT4 come l’immagine interna del recettore, essenzialmente costituito da β-1,3-D-glucano, e quindi potenzialmente utilizzabile come vaccino Id.
Analogamente Ab anti-Id avrebbero potuto mimare PaKT, comportandosi da Ab killer caratterizzati da attività antibiotica (antibiocorpi). Studi di immunizzazione con mAb KT4 in conigli e topi hanno dimostrato l’effettiva capacità di stimolare la produzione di Ab anti-Id PaKT-simili (PaKTAb) in grado di conferire una protezione ad ampio spettro nei confronti di diversi microrganismi (345-347). Tali Ab policlonali, quando usati come sonda immunologica, mostrano una differenziale reattività in immunofluorescenza con cellule di C. albicans e di mammifero. Gli specifici KTR si trovano esclusivamente sulla superficie
55 delle cellule microbiche e sono preferenzialmente localizzati sui tubuli germinativi e sulle cicatrici di budding, dove i β-1,3-D-glucani sono ancora esposti sulla superficie prima di essere rivestiti dallo strato più esterno di mannoproteine (Figura 13). Inoltre, i PaKTAb esibiscono attività fungicida nei confronti di cellule di C. albicans, costituendo la prima dimostrazione che gli Ab possono uccidere direttamente un microrganismo in assenza di complemento o cellule effettrici.
Figura 13. Studi di immunofluorescenza con antibiocorpi su cellule di C. albicans. La figura mostra il legame di mAb K10 biotinilato ai recettori presenti lungo i filamenti delle cellule di C. albicans in fase di germinazione. Lo stesso risultato è stato ottenuto utilizzando un Ab ricombinante (scFv H6). Il segnale è stato rilevato mediante una sonda di streptavidina complessata alla fluoresceina (348).
Attraverso il network idiotipico poteva essere ipotizzato un duplice approccio antinfettivo, basato sulla possibilità di mimare PaKT o PaKTR, rispettivamente: una terapia anti-Id, somministrando PaKTAb direttamente in animali infettati, ed una vaccinazione Id, immunizzando con mAb KT4 per ottenere la produzione in vivo di PaKTAb in grado di proteggere l’animale da infezioni sperimentali (232). È stato dimostrato che l’immunizzazione parenterale con mAb KT4 protegge ratti da candidosi sistemica sperimentale rispetto ad animali di controllo infettati e non immunizzati. Analogamente, Ab anti-Id prodotti in seguito ad immunizzazione intravaginale con mAb KT4, sono in grado di proteggere ratte da candidosi vaginale sperimentale. Significativamente, i fluidi vaginali di tali ratte, contenenti IgA secretorie PaKTAb, sono in grado di conferire protezione passiva nei confronti di contro candidosi vaginale, quando somministrati ad animali naïve.
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La somministrazione intravaginale e intragastrica di ceppi sensibili a PaKT in ratti immunizzati per via intravaginale con mAb KT4, produce in modo significativo un effetto booster nella produzione di PaKTAb. Così, il sistema immunitario riconosce l’Id di mAb KT4 come PaKTR (233). Coerentemente, l’immunizzazione di topi con cellule di C. albicans trattate con ditiotreitolo (DTT) e proteinasi K prolunga la sopravvivenza e previene l’invasione renale rispetto a immunizzazioni con cellule di lievito non trattate. Solo cellule di C. albicans prive di mannoproteine di superficie e che espongono β-1,3-D-glucano (PaKTR) sono risultate proteggenti (242).
Queste osservazioni hanno portato alla produzione di un vaccino antimicotico ''universale'' basato su β-1,3-D-glucano. La laminarina (Lam), un β-1,3-D-glucano solubile derivato da un’alga, è stata selezionata per dimostrare il potenziale transfiletico di un vaccino in grado di stimolare la produzione di Ab diretti nei confronti di un componente della parete cellulare immutabile e critico per la vitalità, condiviso da tutti gli agenti patogeni fungini. La vaccinazione con Lam coniugata con un tossoide difterico (CRM) ha indotto una significativa protezione anti-Candida mediata da Ab in un modello murino sperimentale di infezione disseminata. Specifici Ab anti-β-glucano conferiscono una protezione passiva a topi naïve nei confronti di candidosi disseminata. Ab prodotti in seguito a vaccinazione intravaginale in ratte con il coniugato Lam-CRM hanno notevolmente accelerato la risoluzione di una infezione vaginale con C. albicans. Ab anti β-glucano sono coinvolti nell’immunoprotezione e hanno conferito una protezione passiva quando trasferita in topi naïve nei confronti di candidosi vaginale, paragonabile all’effetto terapeutico esercitato, nelle stesse condizioni sperimentali, da fluconazolo. In vitro, la crescita di C. albicans e A. fumigatus è stata significativamente ridotta dagli Ab anti-β-1,3-D-glucano, e la vaccinazione Lam-CRM ha significativamente prolungato la sopravvivenza di topi sperimentalmente infettati per via sistemica con A. fumigatus (243). Un mAb specifico per β-1,3-D-glucano inibisce la crescita e la formazione della capsula in differenti ceppi di C. neoformans (244).
Un corollario intrigante del fenomeno idiotipico killer di P. anomala era l'esistenza di Ab naturali umani simili a PaKT. PaKTAb specifici per PaKTR dovrebbero essere prodotti, tra gli altri, negli individui infettati da microrganismi sensibili a PaKT. In effetti, nelle secrezioni vaginali di donne con candidosi vaginale o colonizzate da Candida sp. è stata rilevata la presenza di PaKTAb, in grado di proteggere ratte mediante trasferimento passivo da candidosi vaginale sperimentale. Questa è stata la prima dimostrazione che Ab naturali umani anti-KTR possono svolgere un ruolo nella difesa immunitaria antinfettiva (233).
57 È stato inoltre osservato che questi Ab anti-Id hanno attività microbicida anche su microrganismi diversi e non correlati a C. albicans, come ad esempio Pneumocystis carinii, agente opprotunistico in AIDS (349), e un ceppo multiresistente di M. tuberculosis, superando così lo spettro di attività di farmaci antibatterici convenzionali (237).
Anticorpi monoclonali e ricombinanti microbicidi
Al fine di ottenere una illimitata disponibilità e un’assoluta riproducibilità dei reagenti, i PaKTAb sono stati prodotti in formato monoclonale (PaKTmAb) e ricombinante a singolo filamento (PaKTscFv), utilizzando le metodologie disponibili degli ibridomi e del phage display, rispettivamente.
Sono stati così ottenuti mAb K10 (una IgM, P.M. 960 KDa) e scFv H6 (P.M. 27 KDa), quest’ultimo costituito da VH e VL legate da un peptide linker sintetico di 15 amminoacidi in grado di conferire la flessibilità necessaria per una conformazione biologicamente attiva.
Come mostrato in Figura 14, la libreria anticorpale fagica, ottenuta esprimendo scFv sulla superficie di singole particelle fagiche, è stata sottoposta a ripetute selezioni nei confronti di mAb KT4, verificando la specificità di legame mediante saggi ELISA. Ciò ha consentito l’isolamento di scFv H6 per la sua elevata attività anti-Candida sia in vitro sia in vivo.
Come PaKT, i PaKTAb nei diversi formati hanno mostrato un’attività microbicida ad ampio spettro, anche quando privi della regione Fc. PaKTmAb e PaKTscFv proteggevano ratte nei confronti di candidosi vaginale sperimentale e l’effetto terapeutico era superiore a quello del fluconazolo nelle stesse condizioni sperimentali (234). PaKTmAb inibisce in vitro la germinazione conidiale di A. fumigatus e si è dimostrato terapeutico in un modello murino di aspergillosi invasiva (240). Un aerosol di PaKTmAb protegge ratti da pneumocistosi sperimentale con una attività terapeutica simile, nelle stesse condizioni sperimentali, a quella di pentamidina, un farmaco convenzionale anti-Pneumocystis (349).
PaKTmAb e PaKTscFv hanno mostrato notevole attività in vitro nei confronti di S. mutans e in un modello ex vivo, realizzato per indagare le potenzialità di farmaci di inibire formazione o riproduzione di placca dentale in condizioni controllate (239).
PaKTscFv è stato inoltre impiegato per lo sviluppo di nuove strategie di somministrazione di farmaci a livello delle mucose, mediante espressione come prodotto di fusione sulla superficie del batterio commensale S. gordonii, generalmente riconosciuto come sicuro e colonizzante le mucose. Cellule di S. gordonii ricombinanti che esprimono PaKTscFv sulla superficie hanno mostrato attività in vitro nei confronti di C. albicans. I surnatanti di S. gordonii secernenti PaKTscFv hanno mostrato in vitro una attività candidacida significativamente inibita da mAb KT4. Tutti i ceppi di S. gordonii ricombinanti, in particolare quelli secernenti PaKTscFv,
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sono stati in grado di colonizzare la mucosa vaginale di ratte e di esercitare un’attività proteggente nei confronti di candidosi vaginale sperimentale, anche superiore a quella terapeutica del fluconazolo. Questo tipo di approccio risulta molto promettente, dato che permette di superare l’ostacolo del pH particolarmente acido di questo distretto, aumentando la biodisponibilità del farmaco nelle mucose (327).
Si può, quindi, affermare che mAb e rAb rappresentano l’immagine interna di PaKT, conservandone le caratteristiche funzionali, in quanto riconoscono lo stesso recettore sulla parete cellulare di C. albicans, esercitando un analogo effetto antimicrobico.
Figura 14. Schema dell’ottenimento dell’anticorpo anti-idiotipico ricombinante scFv H6.
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