nell’analisi del liquido seminale
3.2 Frammentazione del DNA nemaspermico
3.2.3 Test di dispersione della cromatina spermatica
3.2.3.1 Premessa
Il test di dispersione della cromatina spermatica (SCD) è un metodo di microscopia ottica per valutare la suscettibilità del DNA spermatico alla denaturazione acida.
L’SCD si basa sul principio per cui le anse di DNA intatte si espandono in seguito alla denaturazione e all’estrazione delle proteine nucleari, mentre quando il DNA è frammentato la dispersione non si sviluppa o è minima. Questo metodo si basa sulla capacità della cromatina spermatica intatta di formare aloni di dispersione, dopo essere stata esposta all’acido e a una soluzione lisante; tali aloni corrispondono alle anse di DNA rilassate attaccate alla struttura nucleare residua, che vengono rilasciate dopo la rimozione delle proteine nucleari. Le rotture del DNA, essendo suscettibili alla denaturazione, impediscono questa dispersione. Il metodo consiste in tre passaggi principali: (1) incorporazione degli spermatozoi in una matrice di agarosio, che fornisce un substrato inerte simile a una sospensione per manipolare le cellule; (2) incubazione in una soluzione acida di srotolamento del DNA seguita da una lisi cellulare; la soluzione acida agisce come un denaturante del DNA, che ne dissolve la doppia elica solo in presenza di danni al DNA stesso, e la soluzione lisante è usata per rimuovere le proteine nucleari; (3) lavaggio, disidratazione in soluzioni di etanolo crescenti e colorazione per la visualizzazione al microscopio in campo chiaro [184, 185].
Il test SCD è anche disponibile in kit commerciali che forniscono tutti i reagenti del test per garantire la sua facile applicazione e il funzionamento tecnico e per fornire risultati ripetibili e coerenti in diversi laboratori clinici.
3.2.3.2 Metodo principale
Adattato da Fernández et al., 2011 e 2003 [185, 186]
Reagenti
•
1% di agarosio acquoso a basso punto di fusione.•
0,65% agarosio standard.•
DPBS, p. 228.•
0,08 N HCl.•
Soluzione neutralizzante e lisante (0,4 M Tris, 0,8 M DTT, 1% SDS e 50 mM di acido etilendiamino tetra-acetico, o EDTA, pH 7,5).•
Una seconda soluzione neutralizzante e lisante (0,4 M Tris, 2 M NaCl e 1% SDS,pH 7,5).
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
•
Tampone Tris-borato-EDTA (0,09 M Tris-borato e 0,002 M EDTA, pH 7,5).•
70%, 90% e 100% etanolo.•
Soluzione di Wright con DPBS, p. 228 (1 : 1).Procedura
1. Diluire la concentrazione iniziale dei campioni di spermatozoi con DPBS in modo da ottenere una concentrazione finale di 5-10×106 spermatozoi/ml. I campioni freschi sono preferibili, ma possono essere utilizzati campioni direttamente con-gelati in azoto liquido. Il test deve essere convalidato per liquido seminale fresco e congelato.
2. Mescolare le sospensioni di spermatozoi con 1% di agarosio acquoso a basso punto di fusione (per ottenere una concentrazione finale di agarosio dello 0,7%) a 37°C.
3. Pipettare 50 µl delle miscele su vetrini pre-rivestiti con lo 0,65% di agarosio standard essiccato a 80°C.
4. Coprire i preparati con vetrini coprioggetto (24×60 mm), evitando di intrappolare bolle d’aria.
5. Posizionare il vetrino orizzontalmente su una superficie fredda, per esempio una piastra di metallo o di vetro pre-raffreddata a 4°C.
6. Mettere la piastra fredda con il vetrino nel frigorifero a 4°C per 5 minuti, per permettere all’agarosio di solidificare.
7. Rimuovere il vetrino coprioggetto facendolo scorrere delicatamente.
8. Immergere immediatamente i vetrini in posizione orizzontale in un vassoio con soluzione fresca di denaturazione acida (0,08 N HCl) per 7 minuti a 22°C al buio.
9. Trasferire i vetrini in un vassoio con soluzione neutralizzante e lisante (0,4 M Tris, 0,8 M DTT, 1% SDS e 50 mM EDTA, pH 7,5) per 10 minuti a temperatura ambiente.
10. Incubare i vetrini in una seconda soluzione neutralizzante e lisante (0,4 M Tris, 2 M NaCl e 1% SDS, pH 7,5) per 5 minuti a temperatura ambiente.
11. Lavare accuratamente i vetrini in tampone Tris-borato-EDTA (0,09 M Tris-borato e 0,002 M EDTA, pH 7,5) per 2 minuti.
12. Disidratare le cellule attraverso immersioni sequenziali in etanolo al 70%, 90% e 100% per 2 minuti ciascuna.
13. Lasciare il vetrino ad asciugare orizzontalmente, a temperatura ambiente, o in un forno a 37°C.
14. Coprire il microgel essiccato con uno strato di soluzione colorante a fresco (so-luzione Wright con DPBS (1 : 1)).
15. Tenere il vetrino orizzontale per 10-15 minuti, soffiandoci sopra di tanto in tanto.
16. Decantare la soluzione colorante e lavare brevemente e delicatamente il vetrino in acqua di rubinetto, poi asciugare all’aria.
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
17. Una volta che il livello di colorazione desiderato è raggiunto e il vetrino è perfet-tamente asciutto, può essere montato in una soluzione di montaggio permanen-te, se lo si desidera.
18. Esaminare il campione al microscopio ottico utilizzando un obiettivo a olio a im-mersione 100×. Si raccomanda l’osservazione di un minimo di 500 spermatozoi per campione.
Risultati
Gli aloni degli spermatozoi nei campioni possono essere classificati secondo i criteri di Fernández et al., 2005 [25]:
•
grande: la larghezza dell’alone è simile o superiore al diametro minore del nucleo;•
medio: la dimensione dell’alone è a metà tra quelli con grande e con piccolo alone;•
piccolo: la larghezza dell’alone è simile o inferiore a un terzo del diametro minore del nucleo;•
senza alone;•
senza aloni degradati: non mostrano alcun alone e presentano un nucleo irre-golarmente o debolmente colorato. Questa categoria è associata a gravi danni a carico sia del DNA che del composto proteico.I risultati dovrebbero essere rappresentati come percentuale di ogni categoria. La percentuale di spermatozoi con DNA frammentato è la somma di quelli con piccolo alone, senza alone e senza alone degradato.
Interpretazione clinica
Una serie di piccoli studi, tra cui Gosalvez et al., 2014 [187], ha cercato di esaminare l’uso clinico del test SCD. Come per altri test del DNA, ogni laboratorio dovrebbe stabilire il proprio intervallo di riferimento utilizzando controlli appropriati, basati su valori predittivi positivi e negativi, e dovrebbe essere chiaro a cosa si riferisce il valore predittivo (per esempio, concepimento, aborto spontaneo o altri fenomeni).
Note tecniche
•
L’uso di sospensioni di spermatozoi con le concentrazioni cellulari raccomandate è essenziale per evitare la sovrapposizione di cellule di spermatozoi all’interno della matrice di agarosio e per facilitare un rapido conteggio.•
Se le condizioni di incubazione non sono attentamente controllate, si possonoperdere gli aloni a causa dell’azione delle soluzioni acide e lisanti, producendo falsi positivi.
•
Dopo l’asciugatura (passaggio 13), i vetrini trattati possono essere conservati in scatole d’archivio a temperatura ambiente e al buio per diversi mesi o colorati immediatamente.•
I nuclei cellulari che non hanno una coda devono essere registrati ma non inclusi nel risultato finale.•
Mescolare la sospensione cellulare con l’agarosio liquido quando si è stabilizzata a 37°C, per evitare danni alle cellule a causa del calore.•
In parallelo ai campioni, come controllo interno, elaborare una sospensione dispermatozoi di controllo con un livello noto di frammentazione del DNA. Questi campioni di controllo possono essere conservati congelati in aliquote.
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
3.2.3.3 Metodo alternativo
Reagenti
•
Preparazione dell’agarosio: sciogliere l’agarosio (dopo la fusione a 95-100°C) e mettere 100 µl di agarosio fuso in provette Eppendorf.•
BWW, p. 228 o HTF.•
Soluzione di denaturazione acida appena preparata (0,08N HCl).•
Soluzione di lisi Tris-Hcl 0,4 M, NaCl 2 M, EDTA 0,05 M e 1% SDS, pH 7,5.•
H2O distillata.•
70% etanolo, 90% etanolo e 100% etanolo.•
Soluzione tampone di Wright.Procedura
1. Ricoprire i vetrini con lo 0,65% di agarosio standard e lasciarlo solidificare.
2. Diluire i campioni di spermatozoi in un terreno appropriato (HTF, BWW) per rag-giungere una concentrazione di 5-20 milioni di spermatozoi/ml.
3. Dispensare 60 µl di campioni di spermatozoi diluiti (contenenti un minimo di 300.000 spermatozoi) nelle provette Eppendorf contenenti agarosio fuso. Me-scolare bene. Questa fase deve essere eseguita a 37°C.
4. Incubare a 37°C per 5 minuti a temperatura ambiente per ridurre la temperatura dell’agarosio.
5. Mettere 8 µl della miscela contenente spermatozoi sui vetrini pre-rivestiti e co-prire delicatamente (senza premere) con un vetrino coprioggetto. Mettere ogni vetrino a 2-8°C per 5 minuti.
6. Rimuovere delicatamente il vetrino coprioggetto, spingendolo verso un lato e poi rimuovendolo orizzontalmente e con attenzione.
7. Immergere i vetrini orizzontalmente in un vassoio con una soluzione di denatu-razione acida appena preparata (0,08N HCl) per 7 minuti a temperatura ambien-te al buio.
8. Rimuovere i vetrini dalla soluzione di denaturazione e immergerli in 25 ml di soluzione lisante (Tris-HCl 0,4 M, NaCl 2 M, EDTA 0,05 M e 1% SDS, pH 7,5) per 25 minuti a temperatura ambiente.
9. Lavare i vetrini in acqua distillata per 5 minuti, cambiando l’acqua una o due volte.
10. Rimuovere i vetrini dall’acqua, pulire la superficie di ciascuno e introdurli in va-schette per vetrini contenenti etanolo al 70% (per 2 minuti), poi etanolo al 90%
(per 2 minuti) e infine etanolo al 100% (per 2 minuti).
11. Lasciare asciugare tutti i vetrini.
12. Colorare con la soluzione tampone di Wright dispensando 10-15 gocce della so-luzione colorante direttamente sui vetrini e attendere 15 minuti prima di sciac-quare i vetrini con acqua distillata.
3. Esame esteso
ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi
13. Asciugare all’aria i vetrini e osservarli al microscopio ottico con lente 40×. Di-stinguere gli spermatozoi con l’alone (DNA intatto) da quelli con alone piccolo o assente, come in Figura 3.3. Contare almeno 500 spermatozoi.