Test genetici e genomici

Negli ultimi 15 anni, è diventato sempre più ovvio che una percentuale significativa di casi di infertilità maschile ha una base genetica o genomica. Clinicamente, c’è una crescente consapevolezza che le anomalie cromosomiche (numeriche, strutturali, [comprese le microdelezioni e le microduplicazioni]) e le mutazioni genetiche siano alla base di uno spettro diversificato di problemi di infertilità maschile, che a loro volta sono alla base di molte delle anomalie viste nell’analisi del liquido seminale.

Alcuni laboratori di andrologia eseguono test genetici e genomici, anche se questi test sono più abitualmente eseguiti nel laboratorio di genetica medica. La metodolo-gia per la maggior parte dei test diagnostici genetici e genomici non è specifica per i difetti legati al liquido seminale, con l’eccezione dei test di aneuploidia dello sperma-tozoo; questa metodologia per testare lo spermatozoo è unica e descritta di seguito.

3.3.1 Test di aneuploidia nemaspermica

3.3.1.1 Premessa

L’aneuploidia è la presenza di uno o pochi cromosomi al di sopra o al di sotto del numero abituale di cromosomi. Normalmente gli spermatozoi hanno un complesso di cromosomi aploide (22 autosomi e 1 cromosoma sessuale (X, Y)); in uno spermatozoo aneuploide c’è perdita o guadagno di uno o più autosomi e/o cromosomi sessuali. Uo-mini infertili non selezionati presentano un’incidenza 10 volte maggiore di aneuploidie cromosomiche nel liquido seminale, anche con un cariotipo fenotipico normale, a cau-sa di problemi con la segregazione cromosomica durante la meiosi, con conseguen-te guadagno (disomia) o perdita (nullisomia) di un cromosoma. Gli ovociti aneuploidi aumentano con l’invecchiamento materno e danno origine a embrioni aneuploidi, con conseguente perdita. Le uniche aneuploidie coerenti con una nascita con patologie sono dovute a modifiche nel numero dei cromosomi 13, 18, 21, X e Y. Le traslocazioni robertsoniane sono una causa ben nota di aumento dei livelli di spermatozoi aneuploi-di. Negli uomini con tale aumento, ci può essere un accumulo di anomalie cromosomi-che numericromosomi-che e prodotti di segregazione sbilanciati nello stesso nucleo spermatico [204, 205]. Anche gli uomini con traslocazioni reciproche bilanciate sono a rischio. I pa-dri di bambini con la sindrome di Down costituiscono una preponderanza di portatori di traslocazioni reciproche bilanciate [204]. L’aumento dell’aneuploidia dello spermato-zoo è anche associato a un aumento dei livelli di frammentazione del DNA [206]. L’altro grande gruppo di individui sono i partner maschili nelle coppie con aborti ricorrenti [207]. Livelli anormali di spermatozoi aneuploidi sono più comunemente osservati ne-gli uomini con insufficienza spermatica, oligozoospermia o oligoastenozoospermia, e tra gli uomini normozoospermici che sono partner in coppie con aborti ricorrenti.

3.3.1.2 Ibridazione in situ in fluorescenza

L’ibridazione in situ in fluorescenza è un test diagnostico clinico citogenetico che va-luta le frequenze delle anomalie cromosomiche. I cromosomi X, Y, 13, 18 e 21 sono valutati nel test di aneuploidia del liquido seminale perché le aneuploidie in questi cromosomi sono associate a una prole vitale ma con patologie (sindrome di Kline-felter [XXY-XXXXY], sindromi di Turner [XO], Patau [trisomia 13], Edwards [trisomia 18] e Down [trisomia 21]). Probabilmente, ciò che potrebbe essere più utile sarebbe analizzare tutti i cromosomi, perché altre aneuploidie possono essere letali per gli embrioni, ma queste analisi hanno costi proibitivi. Come strumento di screening, il risultato di un test di aneuploidia spermatica è utile nella consulenza genetica delle coppie con difficoltà procreative [208] (in particolare quelle con aborti ricorrenti o con

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

precedenti fallimenti di ART e, in misura minore, quelle con astenoteratozoospermia e oligozoospermia severa) e in alcuni casi permette alle coppie di prendere decisioni consapevoli sulla riproduzione [209]. La metodologia fornita di seguito è adattata da Ryu et al., 2001 [210].

Reagenti

•

SSC (diluito da 20× SSC) (3 M NaCl, 0,3 M trisodio citrato 2H₂O, pH 7,0).

•

2× SCC (diluito da 20× SCC).

•

Lavaggi con etanolo (100% e diluito al 70% e 80%).

•

25 mM DTT.

•

Sonde alfa satelliti specifiche per i cromosomi marcate direttamente (kit di sonde DNA multicolore disponibile).

•

DAPI II (colorante nucleare, 4,6-diamidino2-fenilindolo).

Procedura

Secondo Ryu et al., 2001 [210]:

1. La colorazione e l’olio vengono rimossi mettendo i vetrini in xilene per 5 minuti e in etanolo per 5 minuti e poi asciugandoli all’aria.

2. I nuclei vengono poi fissati in metanolo per 15 minuti. I vetrini vengono incubati in 2× SSC e poi sottoposti a tre lavaggi in etanolo (70%, 80% e 100%) per 2 minuti ciascuno e lasciati asciugare all’aria.

3. I vetrini vengono poi incubati per 6-8 minuti a 37°C in una soluzione appena prepa-rata di 25 mM DTT, permettendo alle teste degli spermatozoi di decondensarsi e gonfiarsi. I vetrini vengono immediatamente posti in 2× SSC a temperatura ambien-te per 3 minuti, poi disidratati in tre lavaggi con etanolo e lasciati asciugare all’aria.

4. Si esegue l’ibridazione in situ con fluorescenza a cinque colori per rilevare i cro-mosomi X, Y, 13, 18 e 21, con sonde alfa satelliti specifiche per i crocro-mosomi, mar-cate direttamente e disponibili in commercio (sonde DNA multicolore).

5. La miscela di sonde viene sigillata sul vetrino e poi posta in un termostato a 80°C per 2-3 minuti per denaturare simultaneamente il DNA cellulare e le sonde.

6. Dopo un’ibridazione notturna a 37°C, il vetrino viene lavato in 0,25× SSC (pH 7,0) a 68°C per 10 secondi e risciacquato in 1× tampone fosfato detergente (sonde DNA multicolore).

7. Viene applicata la soluzione DAPI II. L’efficienza complessiva di ibridazione do-vrebbe essere > 97%.

Criteri di punteggio

•

Le sonde specifiche del cromosoma sono identificate dal colore e i nuclei sono

analizzati per la presenza di zero, uno, due, tre o più segnali per ciascuna delle tre sonde.

•

I nuclei che contengono segnali di dimensioni inaspettate o che sembrano al di

fuori della membrana nucleare vengono eliminati dall’analisi.

•

Si considera che i segnali rappresentino un dominio diviso se: (1) la dimensione e l’intensità di ciascuno dei due segnali sono inferiori a quella del segnale dell’altro

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

omologo; (2) la distanza tra i due segnali è inferiore al diametro di uno dei due segnali. I risultati sono riportati in percentuale di spermatozoi che presentano una disomia o più (due cromosomi o più) rispetto a un campione seminale normal-mente aploide. Gli spermatozoi monosomici (mancanti di un intero cromosoma) non vengono contati.

Nota tecnica

I sistemi automatizzati di imaging citogenetico migliorano la precisione e l’accura-tezza e sono una necessità. Includono un microlocalizzatore e prevedono analisi secondo una serie di regole per la citologia in cui otto piani focali sono catturati e veicolati per la microscopia fluorescente. La messa a fuoco e l’esposizione per campo controllate dal software permettono di catturare più strati focali, di massi-mizzare l’intensità del segnale e di mantenere bassi livelli di rumore di fondo [211].

Calcoli statistici

La distribuzione dei segnali di ibridazione in situ in fluorescenza viene confrontata collettivamente tra i gruppi infertili e quelli di controllo. Le variabili continue sono analizzate utilizzando il test t indipendente a due campioni. Il test della somma dei ranghi Mann-Whitney è usato per le variabili con varianze disuguali. La significativi-tà statistica è definita come P < 0,05 per le analisi continue.

Livelli basali di disomia dei cromosomi spermatici

L’incidenza dell’aneuploidia spermatica è rara negli uomini fertili. I risultati sono simili tra i diversi laboratori che eseguono questo test (Tabella 3.3).

Cromosoma n. Templado et al. Neusser et al.

1 0,08 0,16

2 0,09 0,09

3 0,20 0,20

4 0,08 0,10

6 0,04 0,07

7 0,06 0,10

8 0,03 0,18

9 0,16 0,13

12 0,14 0,09

Tabella 3.3 Livelli basali della disomia dei cromosomi spermatici di uomini fertili sani

Adattato da Neusser et al., 2015 [212], e Templado et al., 2013 [213].

Cromosoma n. Templado et al. Neusser et al.

13 0,12 0,13

15 0,10 0,10

16 0,07 0,12

18 0,06 0,10

20 0,12 0,12

21 0,17 0,21

22 0,47 0,41

X,Y 0,27 0,21

3. Esame esteso

ne2. Esame di base 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

3.4 Test relativi all’immunologia e ai metodi

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 118-121)