Valutazione della reazione acrosomiale

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 157-162)

essenziali al concepimento

4.2 Valutazione della reazione acrosomiale

4.2.1 Premessa

L’integrità dell’acrosoma, nella sua struttura, e la capacità di effettuare l’esocitosi acrosomiale sono necessarie per la normale fertilità. La reazione acrosomiale è un processo che, in vivo, avviene in prossimità dell’ovocita e deve avvenire prima che lo spermatozoo possa penetrare gli involucri dell’ovocita e fondersi con questo. Si ritiene che l’afflusso di calcio sia un evento iniziale nella normale reazione dell’a-crosoma. Nei casi di teratozoospermia e oligozoospermia, alcuni pazienti possono avere risultati normali all’esame dell’eiaculato, ma gli spermatozoi possono mostra-re alterazioni nella struttura acrosomiale o nella capacità di rispondemostra-re agli stimoli della reazione acrosomiale [288].

Diversi stimoli sono noti per indurre la reazione acrosomiale. Tra questi, le proteine della zona pellucida [289] e il progesterone [290] sono considerati possibili induttori fisiologici della reazione acrosomiale in considerazione della loro elevata concen-trazione in prossimità dell’ovocita. Altri stimoli, come gli ionofori di calcio, indurran-no la reazione acrosomiale, ma i risultati indurran-non soindurran-no correlati, o lo soindurran-no meindurran-no, a quelli ottenuti dalla reazione acrosomiale indotta dalla zona pellucida [291]. Una recente meta-analisi [288] ha dimostrato una correlazione significativa tra la percentuale di spermatozoi con avvenuta reazione acrosomiale, dopo l’induzione con stimoli, e il tasso di fertilizzazione degli ovociti. Lo stato dell’acrosoma, dopo l’induzione della reazione acrosomiale, può essere valutato mediante microscopia o citometria a flusso [292] con lectine marcate con fluorescenza, come agglutinina di Pisum sati-vum (pisello) (Sezione 4.4.1, p. 152) o lectina di Arachis hypogaea (arachide), oppure anticorpi monoclonali contro l’antigene acrosomiale CD46 [293]. Indurre l’afflusso di calcio utilizzando un induttore della reazione acrosomiale è un modo per testare la competenza degli spermatozoi capacitati a subire la reazione acrosomiale [294, 295]. Tuttavia, sono necessarie ulteriori valutazioni e convalide prima che il test dello stato dell’acrosoma possa essere considerato un test clinico di routine.

Qui saranno descritte le procedure per la valutazione statica dell’acrosoma e la reazione acrosomica dinamica e indotta.

4.2.2 Valutazione dello status acrosomiale

4.2.2.1 Procedura

Il metodo è stato originariamente sviluppato da Cross [296], ed è basato sullo stu-dio di Mortimer et al. [297], che ha dimostrato che l’agglutinina di Arachis hypogea (arachide) (FITC-PNA) si lega alla membrana acrosomiale esterna degli sperma-tozoi. Il metodo è stato successivamente modificato da Aitken [294] introducendo il reagente di rigonfiamento ipo-osmotico (Sezione 2.5.13.2, p. 69) per valutare la reazione acrosomiale solo in spermatozoi vivi. La procedura è semplice e riproduci-bile e genera immagini molto chiare (Figura 4.1, p. 147). È prefeririproduci-bile utilizzare una preparazione di spermatozoi altamente mobili priva di contaminanti come leucociti, cellule germinali e spermatozoi morti. Quindi, a seconda della qualità del campione e del protocollo di studio da seguire, il campione dev’essere lavato (Sezione 5.3, p. 164) oppure devono essere fatte preparazioni swim-up o a gradiente di densità (Sezione 5.4, p. 165 e Sezione 5.5, p. 166).

4. Esamiavanzati

ne2. Esame di base 3. Esame esteso 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

4.2.2.2 Reagenti

Agglutinina di Pisum sativum (PSA) marcata con isotiocianato di fluoresceina

(FITC) (PSA-FITC).

Lectina agglutinata di Arachis hypogaea (arachide) marcata con isotiocianato di fluoresceina (FITC) (AHLPNA-FITC).

DPBS, p. 228, pH 7,4.

0,9% (9 g/l) NaCl: sciogliere 0,9 g di NaCl in 100 ml di acqua purificata.

95% (v/v) etanolo.

Soluzione stock di PSA e AHLPNA: diluire 2 mg di PSA-FITC o AHLPNA-FITC in 4

ml di DPBS e conservare in aliquote da 0,5 ml a -20°C.

Soluzione di lavoro PSA: diluire 0,5 ml di soluzione stock di PSA in 10 ml di DPBS e conservare a 4°C. Questa soluzione è stabile fino a 4 settimane.

4.2.2.3 Lavaggio semplice degli spermatozoi

1. Mescolare bene il campione seminale e prelevare un’aliquota di circa 0,2 ml.

2. Diluire a 10 ml con una soluzione salina allo 0,9% (9 g/l).

3. Centrifugare a 800 g per 10 minuti.

4. Rimuovere e scartare tutto il surnatante tranne 20-40 µl.

5. Risospendere il pellet di spermatozoi nel surnatante rimanente pipettando deli-catamente.

6. Ripetere la procedura di lavaggio.

4.2.2.4 Preparazione del liquido seminale trattato

1. Diluire lo swim-up (Sezione 5.4, p. 165) o le preparazioni a gradiente di densità lavate una volta (Sezione 5.5, p. 166) a 10 ml con tampone per ottenere una con-centrazione di 10 milioni/ml.

2. Centrifugare a 800 g per 10 minuti.

3. Rimuovere e scartare tutto il surnatante tranne 20-40 µl.

4. Risospendere il pellet di spermatozoi in un tampone di rigonfiamento ipo-osmoti-co per 30 minuti.

5. Centrifugare a 800 g per 10 minuti.

6. Eliminare e scartare il surnatante e risospendere in un piccolo volume di tampo-ne con una delicata pipettatura.

4. Esamiavanzati

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4.2.2.5 Allestimento di uno striscio

1. Preparare strisci replicati di liquido seminale lunghi circa 1 cm da circa 5 µl di sospensione.

2. Valutare gli strisci ancora umidi al microscopio a contrasto di fase (400x).

3. Assicurarsi che gli spermatozoi siano distribuiti uniformemente sui vetrini senza sovrapposizioni.

4. Lasciare asciugare i vetrini all’aria.

5. Fissare in etanolo 95% (v/v) per 30 minuti.

6. Lasciare asciugare all’aria.

4.2.2.6 Colorazione con PSA-FITC

1. Versare 10 ml di soluzione di lavoro PSA-FITC o AHL-FITC in una vaschetta di colorazione verticale.

2. Immergere i vetrini fissati e asciugati all’aria nella colorazione PSA-FITC.

3. Lasciare colorare per più di 1 ora a 4°C. Tempi di colorazione più lunghi – fino a 18 ore – non influiscono sui risultati del PSA. Tempi più brevi – meno di 1 ora – rendono difficile l’analisi del vetrino.

4. Lavare ogni vetrino con acqua purificata e montare in un mezzo solubile in acqua (Sezione 2.4.9.5, p. 48).

4.2.2.7 Valutazione

Visualizzare il vetrino con microscopia a fluorescenza a ingrandimento 1.000x a immersione a olio con filtro di eccitazione di 450-490 nm e obiettivo dicroico con combinazione di filtri adatti per l’osservazione del picco di emissione a 519 nm.

Valutare gli spermatozoi come segue:

vivi con acrosoma intatto: spermatozoi con coda arricciata in cui più della metà della testa è brillante e uniformemente fluorescente (Figura 4.1);

vivi con reazione acrosomiale avvenuta: spermatozoi con coda arricciata che mo-strano solo una banda fluorescente nel segmento equatoriale o nessuna colora-zione fluorescente nella regione dell’acrosoma (Figura 4.1).

Di solito gli spermatozoi morti non vengono conteggiati in questo test, ma valuta-re contestualmente la percentuale di cellule morte può consentivaluta-re la risoluzione di eventuali errori di conteggio/elaborazione tra gli operatori che eseguono il test.

La percentuale di cellule morte non dovrebbe essere significativamente diversa dalla valutazione iniziale.

4. Esamiavanzati

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Vengono mostrati spermatozoi con acrosoma intatto, con teste prossimali colorate (acrosoma), e spermatozoi con acrosoma reatto, con bande equatoriali o regioni post-acrosomali colorate. Le code arricciate indicano la vitalità dello spermatozoo dopo la procedura HOS (vedere anche Sezione 2.5.13.2, p. 69).

4.2.2.8 Valutazione degli spermatozoi con acrosoma reatto

1. Contare il numero in ogni categoria acrosomiale (acrosoma intatto e acrosoma reatto) con l’aiuto di un contacellule da laboratorio.

2. Valutare 200 spermatozoi in ogni replicato, per ottenere un errore di campiona-mento accettabilmente basso.

Calcolare la media e la differenza delle due percentuali di spermatozoi reatti dai vetrini replicati.

Determinare l’accettabilità della differenza dalla Tabella 2.3, p. 33 (la differenza massima tra due conteggi attesa nel 95% dei campioni a causa del solo errore di campionamento).

Se la differenza tra le percentuali è accettabile, riportare la percentuale media di spermatozoi con acrosoma reatto. Se la differenza è troppo alta, rivalutare i due vetrini.

Riportare la percentuale di spermatozoi reatti arrotondando al numero intero più vicino.

4.2.3 Test di reazione acrosomiale indotta

La reazione acrosomiale può essere indotta utilizzando ionofori (Acrosome Reaction following Ionophore Challenge, ARIC) [298] o usando il progesterone (Acrosome Re-action following Progesterone Challenge, ARPC) [290] o altri stimoli.

Figura 4.1 Esempi di spermatozoi vitali e non vitali colorati con FITC-PNA, con acrosoma intatto e con acrosoma reatto Spermatozoo non vitale Spermatozoo vitale

Spermatozoo vitale con acrosoma intatto Spermatozoo vitale con acrosoma reatto

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4.2.3.1 Reagenti

Soluzione salina bilanciata di Earle integrata (sEBSS; vedere Sezione 8.4, p. 226) contenente il 3,0% (30 g/l) di BSA.

Nota: Se si intraprende l’induzione con progesterone, il siero delipidato/rimosso con carbone dovrebbe essere usato per evitare gli effetti della contaminazione di altre molecole liposolubili (incluso l’ormone).

Dimetil solfossido (DMSO).

Ionoforo A23187, soluzione stock 1 mmol/l: sciogliere 5,23 mg di A23187 in 10 ml di DMSO, progesterone 2-10 µg/ml [299] o altri induttori di reazione acrosomiale [288].

Nota: Possono esistere requisiti legali riguardanti le precauzioni di sicurezza, e i rischi dovrebbero essere attentamente valutati prima di usare lo ionoforo.

70% (v/v) di etanolo.

4.2.3.2 Procedura

1. Attendere 30-60 minuti per la completa fluidificazione del liquido seminale fresco.

2. Preparare per ogni test il mezzo di induzione della capacitazione sEBSS fresco.

3. Riscaldare il mezzo a 37°C prima dell’uso, preferibilmente in un ambiente con 5%

(v/v) di CO2 in un incubatore ad aria.

4. Preparare una popolazione di spermatozoi altamente mobili, liberi da contami-nanti come leucociti, cellule germinali e spermatozoi morti, mediante centrifuga-zione in gradiente di densità (DGC) (Secentrifuga-zione 5.5, p. 166) o swim-up utilizzando un mezzo sEBSS fresco.

5. Preparare le vials dei controlli e dei replicati, ciascuna contenente circa 1 ml di sospensione con 1×106 di spermatozoi mobili.

6. Incubare le sospensioni di spermatozoi per 3 ore a 37°C in un’atmosfera di 5%

(v/v) di CO2 in aria per indurre la capacitazione (allentare il tappo della vial per consentire lo scambio di gas). Se non è disponibile un incubatore con CO2, utiliz-zare un terreno di coltura tamponato con HEPES (Sezione 8.4, p. 226), tappare bene le vials e incubare a 37°C in aria.

7. Aggiungere 10 µl di soluzione stock di A23187 (1 mmol/l) alle vials dei campioni e dei replicati per ottenere una concentrazione finale di 10 µmol/l.

8. Aggiungere 10 µl di DMSO alla vial di controllo.

9. Incubare tutte le vials a 37°C per 15 minuti.

10. Prelevare una piccola aliquota da ogni vial per la determinazione della motilità.

11. Passi successivi su come preparare gli spermatozoi (Sezione 4.2.2.4, p. 145).

Procedura (Sezioni 4.2.2.5 e 4.2.2.6, p. 146), valutazione (Sezione 4.2.2.7, p. 146) e conta (Sezione 4.2.2.8, p. 147) sono descritte alle rispettive pagine.

4. Esamiavanzati

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4.2.3.3 Controllo di qualità

Un campione di controllo positivo (liquido seminale di un uomo i cui spermatozoi hanno precedentemente risposto bene allo ionoforo o al progesterone) dovrebbe essere disponibile ogni volta che il test viene eseguito.

Ogni volta che viene preparato un nuovo lotto di colorante, eseguire un test di crossover con il vecchio colorante, utilizzando – come controllo positivo – sper-matozoi con una risposta nota, per garantire che il colorante sia stato realizzato correttamente.

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 157-162)