Tutti gli aspetti della raccolta e dell’esame dell’eiaculato, se i risultati devono fornire

2.4 Procedure di esame e post-esame

2.4.4 Valutazione al microscopio

Per la valutazione di tutti i preparati a fresco è necessario un microscopio dotato di ottica a contrasto di fase (Sezione 8.3, p. 221 per come impostare un microscopio).

2.4.4.1 Basso ingrandimento

Un esame microscopico iniziale prevede l’osservazione dell’aliquota di eiaculato preparato a un ingrandimento totale di 100x (ovvero la combinazione di un obiettivo 10x con un oculare 10x).

Questo fornisce una panoramica del campione, per ravvisare se gli spermatozoi sono distribuiti uniformemente nella preparazione, se sono presenti e visibili even-tuali filamenti di muco e se c’è aggregazione o agglutinazione di spermatozoi. In caso di distribuzione non uniforme, la causa potrebbe essere:

miscelazione insufficiente;

alta viscosità;

liquefazione insufficiente;

raggruppamento degli spermatozoi.

2.4.4.2 Alto ingrandimento

La preparazione dovrebbe poi essere valutata con un ingrandimento totale di 200x o 400x (ovvero la combinazione di un obiettivo 20x o 40x con un oculare 10x). Que-sto permette:

la valutazione della motilità nemaspermica;

la determinazione della diluizione necessaria per una valutazione accurata del

numero di spermatozoi (Sezione 2.4.4.3);

2. Esame di base

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

la determinazione della presenza di cellule diverse dagli spermatozoi (per esem-pio, cellule epiteliali) o “cellule rotonde” (leucociti e cellule germinali immature) che richiedono un’ulteriore valutazione.

2.4.4.3 Scelta della corretta diluizione per la conta nemaspermica

La diluizione dell’eiaculato necessaria per permettere un calcolo accurato della con-centrazione di spermatozoi è valutata in base al numero di spermatozoi osservati in un intero campo microscopico ad alto ingrandimento. Si dovrebbero usare almeno 50 µl di eiaculato ben miscelato e il volume totale della sospensione nemaspermica dovrebbe essere di almeno 200 µl (il calcolo dell’area del campo è descritto nella Sezione 2.5.9, p. 67).

Se non si rilevano spermatozoi, occorre esaminare una seconda preparazione a fresco replicata. Se non si trovano spermatozoi nel secondo preparato, si deve pro-cedere come riportato nella Sezione 2.4.8.8, p. 35. La Tabella 2.1 è stata sviluppata per assicurare l’uso di volumi sufficienti di eiaculato e ottenere volumi finali di so-spensioni spermatiche diluite per una gestione adeguata.

2.4.4.4 Fissativo per diluire le aliquote di eiaculato

Preparare, per esempio, 1 litro di una soluzione acquosa contenente 0,595 M di bicarbonato di sodio e circa 0,14 M di formalina (qualsiasi soluzione liquida di for-maldeide è chiamata formalina). La concentrazione finale di formalina è un decimo di quella usata nei laboratori di patologia e citologia. Rispetto alla situazione in tali laboratori, l’evaporazione della formalina dai preparati della camera di conteggio è estremamente bassa. Vanno seguiti i regolamenti locali sulla manipolazione della formalina, ma la manipolazione in cappe di ventilazione è probabilmente obbligato-ria solo per la preparazione della soluzione stock a bassa concentrazione.

1. Sciogliere 50 g di bicarbonato di sodio (NaHCO3) in circa 500 ml di acqua distillata, aggiungere 10 ml di soluzione di formaldeide al 36-40% e aggiungere acqua fino a ottenere un volume finale di 1.000 ml.

2. Se lo si desidera, aggiungere 0,25 g di blu trypan (indice di colore 23859) o 5 ml di violetto di genziana saturo (> 4 mg/ml) (indice di colore 42555) per evidenziare le teste degli spermatozoi e facilitare il corretto caricamento delle camere di conteggio.

3. Conservare a 2-8°C per un massimo di 12 mesi. Se si formano cristalli nella solu-zione, passarla attraverso un filtro da 0,45 µm prima dell’uso.

Spermatozoi

per campo 400x Spermatozoi

per campo 200x Diluizione Eiaculato (µl) Fissativo (µl)

> 200 > 800 1 : 50 (1 + 49) 50 2.450

40-200 160-800 1 : 20 (1 + 19) 50 950

16-40 64-160 1 : 10 (1+ 9) 50 450

2-15 8-64 1 : 5 (1 + 4) 50 200

< 2 < 8 1 : 2 (1 + 1) 100 100

Tabella 2.1 Volumi sufficienti di eiaculato e volumi finali di sospensioni spermatiche diluite per una gestione adeguata

2. Esame di base

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

2.4.4.5 Diluizione per la valutazione del numero di spermatozoi

La diluizione con un fissativo è necessaria per immobilizzare gli spermatozoi (gli spermatozoi immobili sono più facili da contare in modo accurato rispetto a quelli mobili). La diluizione è importante anche per creare un campione più acquoso per un caricamento più affidabile dell’emocitometro. Almeno 50 µl di eiaculato dovreb-bero essere mescolati con la soluzione diluente per garantire una rappresentatività affidabile e un volume della sospensione sufficiente per un’accurata miscelazione del campione (la miscelazione al vortex è possibile dopo la fissazione). La diluizione appropriata è decisa durante l’esame microscopico iniziale.

1. Utilizzare una pipetta a spostamento d’aria per collocare la quantità appropriata di fissativo in due vials di diluizione.

2. Mescolare accuratamente il campione di liquido seminale senza fare bolle.

3. Utilizzare una pipetta a spostamento positivo per prendere un volume di liquido seminale esatto per la diluizione.

4. Pulire l’esterno della punta della pipetta dal liquido seminale, facendo attenzione a non toccare l’apertura; accertarsi che non vi siano bolle d’aria nella punta della pipetta.

5. Immettere il liquido seminale nel fissativo e sciacquare la punta della pipetta aspi-rando ed espellendo il fissativo. Rimuovere la punta della pipetta con lo stantuffo completamente premuto e miscelare immediatamente la diluizione al vortex, per ridurre il rischio di formazione di precipitati visibili che renderebbero le valutazio-ni inaffidabili.

6. Mescolare di nuovo bene il campione di spermatozoi e preparare la diluizione replicata seguendo i passaggi precedenti.

2.4.4.6 Valutazione delle aggregazioni nemaspermiche

Ci sono due diversi tipi di aggregazioni nemaspermiche che è essenziale valutare separatamente.

Aggregati di spermatozoi

L’adesione di spermatozoi immobili tra loro o di spermatozoi mobili a filamenti di muco, cellule non spermatiche o detriti è definita “aggregazione non specifica” (Figura 2.1).

2. Esame di base

Figura 2.1 Aggregazione non specifica degli spermatozoi nel liquido seminale

Immagini di spermatozoi aggregati con una cellula epiteliale (a), detriti (b) o spermatozoi (c, d).

Microfotografie per gentile concessione di C. Brazil.

(a) (b) (c) (d)

ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

Agglutinazioni nemaspermiche

L’agglutinazione si riferisce specificamente agli spermatozoi mobili che si attaccano l’uno all’altro testa a testa, coda a coda o in modo misto. La motilità è spesso vigo-rosa, con un movimento frenetico, ma a volte gli spermatozoi sono così agglutinati che il loro movimento è limitato. Qualsiasi spermatozoo mobile che si agglutina per la testa, la coda o la metà del corpo dev’essere annotato. Gli spermatozoi mobili attaccati a cellule, a detriti o agli spermatozoi immobili che sono attaccati gli uni agli altri (aggregazione) non devono essere indicati come agglutinazione.

Il principale tipo di agglutinazione, che riflette il grado e il sito di attaccamento, do-vrebbe essere registrato [52] (Figura 2.2).

2. Esame di base

Figura 2.2 Schema dei diversi gradi di agglutinazione nemaspermica

Localizzazione

B. Coda-coda, le teste sono libere e si muovono al di fuori

delle agglutinazioni

C. Estremità della coda- estremità della coda

D. Miste (chiare agglutinazioni testa-testa e coda-coda)

E. Groviglio (teste e code intrecciate; le teste non sono al di fuori delle agglutinazioni in quanto sono inglobate nelle

agglutinazioni coda-coda)

Tratto da Rose et al., 1976 [52], per gentile concessione.

Nel documento Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione (pagine 32-35)