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4. ANALISI CINETICA DELL’ENZIMA PURIFICATO

4.4 VELOCITA’ DI REAZIONE IN FUNZIONE DI [S]

L’analisi della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato (fig.35- 37) è stata condotta spettrofotometricamente secondo quanto descritto nella relativa sezione di Materiali e Metodi, e utilizzando concentrazioni crescenti di GS-HNE e PGB1, che come visto precedentemente, sono gli unici due substrati con i quali è stata misurata un’attività deidrogenasica NADP+ dipendente.

L’analisi della velocità di reazione in funzione della concentrazione di GS-HNE, è stata condotta con NADP+ 180 µM e 10 µl di enzima purificato e non dializzato alla

concentrazione di 0,01 mg/ml (fig.35), mentre nel caso della PGB1 la reazione è stata condotta con NADP+ 180 µM e 60 µl di enzima (fig.37).

Le costanti cinetiche per entrambi i substrati sono state determinate attraverso il diagramma di Lineweaver-Burk (fig.36 - 38) e riportate nella tabella 14.

Fig. 35 Diagramma di Michaelis-Menten che correla la velocità iniziale (V0) con la concentrazione del GS-HNE.

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0 20 40 60 80 100 120 V0 [GS-HNE] µM

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Fig.36 Diagramma di Lineweaver-Burk che correla tra loro i reciproci della velocità iniziale (1/V0) e della concentrazione del GS-HNE (1/[GS-HNE]).

Fig. 37 Diagramma di Michaelis-Menten che correla la velocità iniziale (V0) con la concentrazione di PGB1. 0 50 100 150 200 -0,06 -0,04 -0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 1/V 0 1/[GS-HNE] 0 0,0025 0,005 0,0075 0 100 200 300 400 V0 [PGB1] µM

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Fig.38 Diagramma di Lineweaver-Burk che correla tra loro i reciproci della velocità iniziale (1/V0) e della concentrazione di PGB1 (1/[PGB1] ). Substrato KM (µM) Vmax (mM min -1) Kcat (min-1) Kcat/Km (Ks) (mM-1min-1) GS-HNE 24 0,0036 713 30 x 103 PGB1 164 0,0015 297 1,8 x 103

Tab.14 Costanti cinetiche per il GS-HNE e il PGB1dell’enzima purificato. La Kcat è

stata calcolata assumendo un peso molecolare dell’enzima di 33 kDa ed una concentrazione di 0,01 mg/ml

I risultati di questa analisi cinetica indicano chiaramente un’elevata specificità dell’enzima per l’addotto GS-HNE soprattutto se confrontata con quella per la PGB1. Infatti, sebbene l’enzima sia stato identificato come Carbonil reduttasi 1/15- idrossiprostaglandina deidrogenasi, la costante di specificità per la prostaglandina B1, intesa come rapporto tra la Kcat e la Km, risulta circa 17 volte inferiore rispetto a quella relativa al GS-HNE. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 -0,01 -0,005 0 0,005 0,01 0,015 0,02 1/V 0 1/[PGB1]

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Diversi studi hanno evidenziato che, se comparate con le cellule normali, molte tipologie di cellule tumorali presentano aumentati livelli di ROS, in grado di indurre tutta una serie di effetti biologici. Tra questi particolare attenzione è stata rivolta alla perossidazione lipidica, un evento particolarmente comune in cellule tumorali del tessuto cerebrale, a causa del loro elevato contenuto di acidi grassi polinsaturi. L’HNE, uno dei principali prodotti della perossidazione lipidica, è una molecola chiave nel signaling cellulare [58,59,60,61] e media tutta una serie di effetti citotossici e mutageni. La sua elevata reattività, gli elevati livelli di GST e di glutatione intracellulare, conducono essenzialmente alla formazione dell’addotto GS-HNE, che sebbene risulti meno reattivo rispetto all’HNE, conserva potenzialmente la capacità di modulare il signaling cellulare [250].

L’attività GS-HNE deidrogenasica NADP+ dipendente, oggetto di analisi in questo lavoro

di tesi, è stata isolata da cellule di astrocitoma umano ed efficacemente purificata fino ad omogeneità elettroforetica attraverso la successione di tre step cromatografici (tab. 9). I risultati del primo step di cromatografia su resina a scambio ionico DE-52 suggeriscono che la proteina presenti in condizioni fisiologiche (pH 7) una carica netta positiva. Inoltre, sebbene il passaggio cromatografico sia stato utile a separare l’enzima di interesse da numerose altre proteine, incrementando l’attività specifica di circa 5 volte, non è stata sufficiente a separarla dall’aldoso reduttasi, un enzima NADPH dipendente coinvolto anch’esso nel metabolismo dell’HNE e dell’addotto GS-HNE.

Il secondo step cromatografico invece, condotto su gel Sephacryl S200, oltre a separare l’enzima da proteine ad alto peso molecolare, aumentando l’attività specifica di circa 20 volte rispetto a quella iniziale nell’estratto grezzo, è stata utile per fornire una stima approssimativa del peso molecolare della proteina in condizioni native. L’enzima infatti, coeluendo assieme all’aldoso reduttasi (MW 36 kDa) risulterebbe avere un peso molecolare attorno ai 30 kDa. L’ultimo step cromatografico condotto su resina Blue Sepharose è stato infine determinante per incrementare di circa 250 volte l’attività specifica dell’enzima e per separarlo definitivamente dall’aldoso reduttasi. I risultati hanno mostrato che l’enzima in studio presenta una forte affinità per la resina e viene eluito solo in seguito all’applicazione di un’elevata forza ionica. La successiva analisi SDS-PAGE del campione di purificazione ha confermato l’efficacia del processo di

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purificazione, evidenziando due bande principali corrispondenti ad un peso molecolare apparente di circa 33 kDa. L’analisi delle bande elettroforetiche, condotte tramite spettrometria di massa tandem (MS/MS), ha evidenziato per entrambe un elevato grado di omologia con l’enzima umano Carbonil reduttasi 1 NADPH dipendente (CBR 1) / 15- idrossi-prostaglandina deidrogenasi NADP+ dipendente (15-HPGDH).

La CBR1 è un enzima ubiquitario, conosciuto principalmente per la sua attività reduttasica NADPH dipendente su un’ampia gamma di substrati carbonilici endogeni ed esogeni [193,194].

Dai dati disponibili in letteratura infatti, l’attività deidrogenasica NADP+ dipendente è

stata evidenziata solo nei confronti delle prostaglandine, per le quali però sono state misurate costanti di specificità molto basse se confrontate con quelle relative all’attività reduttasica verso i substrati chinonici [225,226].

L’ossidazione NADP+ dipendente dell’addotto GS-HNE rappresenterebbe quindi una

nuova ed importante attività per la CBR1, soprattutto considerando l’elevato rapporto (circa 17 volte) tra la costante di specificità per il GS-HNE e quella per la PGB1, evidenziate in questo lavoro di tesi.

Degno di nota è il fatto che l’enzima è risultato essere in grado di ossidare selettivamente l’addotto GS-HNE, ma non la sola aldeide (HNE). Le due molecole differiscono per la struttura emiacetalica ed ovviamente per la presenza di una porzione glutationilica. Il motivo di tale selettività è stato compreso osservando l’assenza di attività dell’enzima nei confronti della cisteinil-HNE e della cisteinilglicina-HNE; queste molecole infatti conservano la struttura emiacetalica tipica del GS-HNE, ma non presentano una porzione glutationilica completa. Quest’ultima sembra essere necessaria affinché il substrato venga riconosciuto, suggerendo la presenza nell’enzima di uno specifico sito di legame per il glutatione. Ciò è in accordo con quanto riportato in letteratura circa la presenza di un sito di legame per il glutatione in prossimità del sito catalitico della CBR1 [234], che svolgerebbe un’importante ruolo nel riconoscimento e nell’orientamento del substrato [238].

Se da una parte la presenza della porzione glutationilica risulta determinante per il riconoscimento del substrato GS-HNE, dall’altra anche la struttura emiacetalica risulta necessaria affinché il substrato venga efficacemente ossidato dall’enzima. L’ossidazione

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del GS-HNE è stata infatti indagata tramite analisi NMR dei prodotti, dal quale è emerso che ad essere ossidato è proprio il gruppo ossidrilico che viene esposto in seguito alla ciclizzazione della molecola, formando GS-HNA lattone, che in condizioni fisiologiche può andare incontro a idrolisi e formazione di GS-HNA [158].

Il GS-HNA e il GS-Lattone-HNA possono infine essere metabolizzati attraverso la via degli acidi mercapturici, concludendo quindi il processo di detossificazione dell’HNE [158].

Questi risultati messi insieme delineano un nuovo ruolo della CBR1 nel metabolismo ossidativo dell’HNE, che diventa particolarmente significativo in condizioni di stress ossidativo, dove si verifica un aumento del rapporto tra NADP+ e NADPH.

L’importanza di questa nuova attività enzimatica si esplica non solo attraverso la detossificazione del GS-HNE, a cui consegue un’alterazione del signaling ad esso correlato, ma anche attraverso la rigenerazione del potere riducente, fornendo potenzialmente alla cellula un supporto nel contrastare lo stress ossidativo. Ciò potrebbe infine essere associato anche alla resistenza a trattamenti di stress ossidativo, evidenziata in precedenti studi [249], della linea cellulare da cui è stato isolato l’enzima, e che potrebbe acquistare una certa rilevanza nella prospettiva di definire strategie di trattamento di cellule tumorali.

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92

[1] M.L. Riess, A.K. Camara, L.G. Kevin, " Reduced reactive O2 species formation and preserved

mitochondrial NADH and [Ca2+] level during short-term 17°C ischemia in intact hearts"

Cardiovascular Research, vol.61 no. 3, pp. 580-590, 2004.

[2] J.M. Lü, P.H. Lin, Q. Yao, "Chemical and molecular mechanism of antioxidants: experimental approaches and model systems", Journal of cellular and molecular medicine, vol.14, no. 4, pp. 840- 860, 2010.

[3] Dix TA, Aikens J. Mechanisms and biological relevance of lipid peroxidation initiation. Chem Res Toxicol 1993;6:2–18.

[4] F. Guéraud , M. Atalay , N. Bresgen, A. Cipak , P. M. Eckl , L. Huc , I. Jouanin , W. Siems & K. Uchida, "Chemistry and biochemistry of lipid peroxidation products" Free Radical Research, October 2010; 44(10): 1098–1124

[5] Porter NA, Caldwell SE, Mills KA. Mechanisms of free radical oxidation of unsaturated lipids. Lipids 1995;30:277–292.

[6] Neil Hogg, B. Kalyanaraman, "Nitric oxide and lipid peroxidation" Review Biochimica et Biophysica Acta , 1411, 378-384 1999

[7] Esterbauer, H., Schaur, R.J., Zollner, H., 1991. Chemistry and biochemistry of 4- hydroxynonenal,malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic. Biol. Med. 11, 81–128 [8] Uchida K, Kanematsu M, Sakai K, Matsuda M, Hattori N, Mizuno Y, et al. Proc Natl Acad Sci

USA 1998; 95:4882–7.

[9] Uchida K. Free Radic Biol Med 2000;28:1685–96.

[10] Ichihashi K, Osawa T, Toyokuni S, Uchida K. JBiol Chem 2001;276:23903–13.

[11] International Agency for Research on Cancer. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans: dry cleaning, some chlorinated solvents and other industrial chemicals, vol. 63. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 1995. pp 3–391.

[12] Shibamoto T. Analytical methods for trace levels of reactive carbonyl compounds formed in lipid peroxidation systems. J Pharm Biomed Anal 2006;41:12–25.

[13] Fu MX, Requena JR, Jenkins AJ, Lyons TJ, Baynes JW, Thorpe SR. J Biol Chem 1996;271:9982– 6.

[14] Lee, S.H., and Blair, I.A., "Characterization of 4-oxo-2-nonenal as a novel product of lipid peroxidation", Chem. Res. Toxicol. 13, 698-702, 2000

[15] Lee, S.H., and Blair, I.A., " Vitamin C-induced decomposition of lipid hydroperoxides to endogenous genotoxins, Science 292, 2083-2086, 2001

[16] Uchida K. 4-Hydroxy-2-nonenal: a product and mediator of oxidative stress. Prog Lipid Res 2003;42:318–343.

93

[18] Benedetti A, Comporti M, Esterbauer H. Biochim Biophys Acta 1980;620:281–96. [19] Porter NA, Pryor WA. Free Radic Biol Med 1990;8:541–3.

[20] Gardner HW, Hamberg M. JBiol Chem 1993;268:6971–7.

[21] Schneider C, Tallman KA, Porter NA, Brash AR. JBiol Chem 2001;276:20831–8.

[22] Barrera, G. 2012. Oxidative stress and lipid peroxidation products in cancer progression and therapy. ISRN Oncol:137289.

[23] Grootveld, M., Atherton, M.D., Sheerin, A.N., Hawkes, J., Blake, D.R., Richens, T.E., Silwood, C.J., Lynch, E., Claxson, A.W., 1998. In vivo absorption, metabolism, and urinary excretion of α,β-unsaturated aldehydes in experimental animals. J. Clin. Invest. 101, 1210–1218.

[24] Owen AD et al., " Indices of oxidative stress in Parkinson's disease, Alzheimer's disease and dementia with Lewy bodies."J Neural Trans 1997, Suppl 51:167

[25] Esterbauer H, Ertl A, Scholz N. Tetrahedron 1976;32:285–9.

[26] Schaur, R. J. 2003. Basic aspects of the biochemical reactivity of 4-hydroxynonenal. Mol Aspects Med 24 (4-5):149-159.

[27] Bacot S, Bernoud-Hubac N, Chantegrel B, Deshayes C, Doutheau A, Ponsin G, Lagarde M, Guichardant M. Evidence for in situ ethanolamine phospholipid adducts with hydroxy-alkenals. J Lipid Res 2007;48:816–825.

[28] Guichardant M, Bernoud-Hubac N, Chantegrel B, Deshayes C, Lagarde M. Aldehydes from n-6 fatty acid peroxidation. Effects on aminophospholipids. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2002;67:147–149.

[29] Gueraud, F., M. Atalay, N. Bresgen, A. Cipak, P. M. Eckl, L. Huc, I. Jouanin, W. Siems, and K. Uchida. 2010. Chemistry and biochemistry of lipid peroxidation products. Free Radic Res 44 (10):1098-1124.

[30] Irvine RF. How is the level of free arachidonic acid controlled in mammalian cells? Biochem J 1982;204:3–16.

[31] Awasthi YC, Sharma R, Cheng JZ, Yang Y, Sharma A, Singhal SS, Awasthi S. Role of 4- hydroxynonenal in stress-mediated apoptosis signaling. Mol Aspects Med 2003;24:219–230. [32] Sayre LM, Arora PK, Iyer RS, Salomon RG. Pyrrole formation from 4-hydroxynonenal and

primary amines. Chem Res Toxicol 1993;6:19–22.

[33] Petersen DR, Doorn JA. Reactions of 4-hydroxynonenal with proteins and cellular targets. Free Radic Biol Med 2004;37:937–945.

[34] Szweda LI, Uchida K, Tsai L, Stadtman ER. JBiol Chem 1993;268:3342–7.

[35] Gardner, H.W., Deighton, N., 2001. Effect of 4-hydroxy-2(E)-nonenal on soybean lipoxygenase- 1. Lipids 36, 623–628

[36] Uchida K, Stadtman ER. JBiol Chem 1993;268:6388–93.

94

[38] Vander Jagt DL, Hunsaker LA, Vander Jagt TJ, Gomez MS, Gonzales DM, Deck LM, et al. Biochem Pharmacol 1997;53:1133–40.

[39] Del Corso A, Dal Monte M, Vilardo PG, Cecconi I, Moschini R, Banditelli S, et al. Arch Biochem Biophys 1998; 350:245–8.

[40] Carbone DL, Doorn JA, Kiebler Z, Sampey BP, Petersen DR. Inhibition of Hsp72-mediated protein refolding by 4-hydroxy-2-nonenal. Chem Res Toxicol 2004;17:1459–1467.

[41] Fink AL. Chaperone-mediated protein folding. Physiol Rev 1999;79:425–449.

[42] Mark RJ, Lovell MA, Markesbery WR, Uchida K, Mattson MP. J Neurochem 1997;68:255–64. [43] Mark RJ, Pang Z, Geddes JW, Uchida K, Mattson MP. J Neurosci 1997;17:1046–54.

[44] Keller JN, Pang Z, Geddes JW, Begley JG, Germeyer A, Waeg G, et al. J Neurochem 1997;69:273– 84.

[45] de Jongh R, Haenen GR, van Koeveringe GA, Dambros M, van Kerrebroeck PE. Lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal contributes to bladder smooth muscle damage. Urology 2008;71:974–978.

[46] Brambilla G, Sciaba L, Faggin P, Maura A, Marinari UM,Ferro M, Esterbauer H. Cytotoxicity, DNA fragmentation and sister-chromatid exchange in Chinese hamster ovary cells exposed to the lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal and homologous aldehydes. Mutat Res 1986; 171:169–176.

[47] Eckl PM, Ortner A, Esterbauer H. Genotoxic properties of 4-hydroxyalkenals and analogous aldehydes. Mutat Res 1993;290:183–192.

[48] Karlhuber GM, Bauer HC, Eckl PM. Cytotoxic and genotoxic effects of 4-hydroxynonenal in cerebral endothelial cells. Mutat Res 1997;381:209–216.

[49] Chung FL, Nath RG, Ocando J, Nishikawa A, Zhang L. Deoxyguanosine adducts of t-4-hydroxy- 2-nonenal are endogenous DNA lesions in rodents and humans: detection and potential sources. Cancer Res 2000;60:1507–1511.

[50] Chen HJ, Chung FL. Epoxidation of trans-4-hydroxy- 2-nonenal by fatty acid hydroperoxides and hydrogen peroxide. Chem Res Toxicol 1996;9:306–312.

[51] M eister A. Selective modification of glutathione metabolism. Science 1983;220:472–477. [52] Yadav S, Zajac E, Singhal SS, Singhal J, Drake K, Awasthi YC, Awasthi S. POB1 over-expression

inhibits RLIP76-mediated transport of glutathione-conjugates, drugs and promotes apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 2005;328:1003–1009.

[53] Schaur, R. J., H. Zollner, and H. Esterbauer. 1991. Biological effects of aldehydes with particular attention to hydroxynonenal and malondialdehyde. In Membrane Lipid Peroxidation. Vol. 111. C. Vigo-Pelfrey, editor. CRC Press, Boca Raton. 141-163.

95

[55] Alary J, Fernandez Y, Debrauwer L, Perdu E, Gueraud F. Identification of intermediate pathways of 4-hydroxynonenal metabolism in the rat. Chem Res Toxicol 2003;16:320–327.

[56] Zhu P, Jian W, Blair IA. A 4-oxo-2(E)-nonenal-derived glutathione adduct from 15-lipoxygenase- 1-mediated oxidation of cytosolic and esterifi ed arachidonic acid. Free Radic Biol Med 2009;47:953–961.

[57] Tammali R, Ramana KV, Singhal SS, Awasthi S, Srivastava SK. Aldose reductase regulates growth factor-induced cyclooxygenase-2 expression and prostaglandin E2 production in human colon cancer cells. Cancer Res 2006;66:9705–9713.

[58] Uchida, K. 2003. 4-Hydroxy-2-nonenal: a product and mediator of oxidative stress. Prog Lipid Res 42 (4):318-343.

[59] G. Barrera, S. Pizzimenti, and M. U. Dianzani, "4-hydroxynonenal and regulation of cell cycle: effects on the prb/e2f pathway" Free Radic Biol Med. Vol. 37, No. 5, pp. 597 – 606, 2004 [60] Awasthi Y.C., R. Sharma , J.Z. Cheng , Y. Yang , A. Sharma , S. S. Singhal, S. Awasthi "Role of

4-hydroxynonenal in stress-mediated apoptosis signaling" Molecular Aspects of Medicine 24 (2003) 219–230

[61] Awasthi Y.C., R. Sharma, A. Sharma, S. Yadav, S. S. Singhal, P. Chaudhary, S. Awasthi. "Self- regulatory role of 4-hydroxynonenal in signaling for stress-induced programmed cell death" Free Radical Biology & Medicine 45 (2008) 111–118

[62] Awasthi, Y. C.; Yang, Y.; Tiwari, N. K.; Patrick, B.; Sharma, A.; Li, J.; Awasthi, S. Regulation of 4-hydroxynonenal-mediated signaling by glutathione S-transferases. Free Radic. Biol. Med. 37:607–619; 2004.

[63] Awasthi, Y. C.; Sharma, R.; Cheng, J. Z.; Yang, Y.; Sharma, A.; Singhal, S. S.; Awasthi, S. Role of 4-hydroxynonenal in stress-mediated apoptosis signaling. Mol. Aspects Med. 24:219–230; 2003.

[64] Cheng, J.Z., Singhal, S.S., Saini, M., Singhal, J., Piper, J.T., Van Kuijk, F.J., Zimniak, P., Awasthi, Y.C., Awasthi, S., 1999. Effects of mGSTA4 transfection on 4-hydroxynonenal-mediated apoptosis and differentiation of K562 human erythroleukemia cells. Arch. Biochem. Biophys. 372, 29–36.

[65] Uchida, K., Shiraishi, M., Naito, Y., Torii, Y., Nakamura, Y., Osawa, T., 1999. Activation of stress signaling pathways by the end product of lipid peroxidation. 4-hydroxy-2-nonenal is a potential inducer of intracellular peroxide production. J. Biol. Chem. 274, 2234–2242.

[66] Camandola, S., Poli, G., Mattson, M.P., 2000. The lipid peroxidation product 4-hydroxy-2,3- nonenal increases AP-1-binding activity through caspase activation in neurons. J. Neurochem. 74, 159–168.

96

[67] Cheng, J.Z., Sharma, R., Yang, Y., Singhal, S.S., Sharma, A., Saini, M.K., Singh, S.V., Zimniak, P., Awasthi, S., Awasthi, Y.C., 2001a. Accelerated metabolism and exclusion of 4-hydroxynonenal through induction of RLIP76 and hGST 5.8 is an early adaptive response of cells to heat and oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 41213–41223.

[68] Cheng, J.Z., Singhal, S.S., Sharma, A., Saini, M.K., Yang, Y., Awasthi, S., Zimniak, P., Awasthi, Y.C., 2001b. Transfection of mGSTA4 in HL-60 cells protects against 4-hydroxynonenal-induced apoptosis by inhibiting JNK-mediated signaling. Arch. Biochem. Biophys. 392, 197–207. [69] Ruef, J., Rao, G.N., Li, F., Bode, C., Patterson, C., Bhatnagar, A., Runge, M.S., 1998. Induction of

rat aortic smooth muscle cell growth by the lipid peroxidation product 4-hydroxy-2-nonenal. Circulation 97, 1071–1078.

[70] Zarkovic, N.; Ilic, Z.; Jurin, M.; Schaur, R. J.; Puhl, H.; Esterbauer, H. Stimulation of HeLa cell growth by physiological concentrations of 4-hydroxynonenal. Cell Biochem. Funct. 11:279– 286; 1993.

[71] Kreuzer, T.; Grube, R.; Wutte, A.; Zarkovic, N.; Schaur, R. J., 4-Hydroxynonenal modifies the effects of serum growth factors on the expression of the c-fos proto-oncogene and the proliferation of HeLa carcinoma cells. Free Radic. Biol. Med. 25:42– 49; 1998.

[72] Barrera, G.; Pizzimenti, S.; Muraca, R.; Barbiero, G.; Bonelli, G.; Baccino, F. M.; Fazio, V. M.; Dianzani, M. U. Effect of 4-hydroxynonenal on cell cycle progression and expression of differentiation associated antigens in HL-60 cells. Free Radic. Biol. Med. 20:455–462; 1996. [73] Pizzimenti, S.; Barrera, G.; Dianzani, M. U.; Bru¨sselbach, S. Inhibition of D1, D2, and A-cyclin

expression in HL-60 cells by the lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal. Free Radic. Biol. Med. 26:1578–1586; 1999.

[74] Xiong, Y.; Hannon, G. J.; Zhang, H.; Casso, D.; Kobayashi, R.; Beach, D. p21 is a universal inhibitor of cyclin kinases. Nature 366:701– 704; 1993.

[75] Ikeda, M.; Laszlo, J.; Nevins, J. R. A unique role for the Rb protein in controlling E2F accumulation during cell growth and differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3215– 3220; 1996.

[76] Hoffman B, Amanullah A, Shafarenko M, Liebermann DA (13 maggio 2002). The proto-oncogene c-myc in hematopoietic development and leukemogenesis. Oncogene 21 (21): 3414–21. DOI:10.1038/sj.onc.1205400. PMID 12032779

[77] Fazio, V. M.; Barrera, G.; Martinotti, S.; Farace, M. G.; Giglioni, B.; Frati, L.; Manzari, V.; Dianzani, M. D. 4-Hydroxynonenal, a product of cellular lipid peroxidation, which modulates c- myc and globin gene expression in K562 erythroleukemic cells. Cancer Res. 52:4866–4871; 1992.

97

[78] Barrera, G.; Muraca, R.; Pizzimenti, S.; Serra, A.; Rosso, C.; Saglio, G.; Farace, M. G.; Fazio, V. M.; Dianzani, M. U. Inhibition of c-myc expression induced by 4-hydroxynonenal, a product of lipid peroxidation, in theHL-60 human leukemic cell line. Biochem. Biophys. Res. Commun. 203:553 – 561; 1994.

[79] Barrera, G.; Pizzimenti, S.; Serra, A.; Ferretti, C.; Fazio, V. M.; Saglio, G.; Dianzani, M. U. 4- Hydroxynonenal specifically inhibits c-myb but does not affect c-fos expressions in HL-60 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:589– 593; 1996.

[80] Danial, N. N.; Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell 116:205–219; 2004.

[81] Itoh, N.; Nagata, S. A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen. J. Biol. Chem. 268:10932–10937; 1993.

[82] Helton ES, Chen X. p53 modulation of the DNA damageresponse. J Cell Biochem 2007;100:883– 896.

[83] Levine, A. J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 88:323–331; 1997. [84] Shieh, S. Y.; Ikeda, M.; Taya, Y.; Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53

alleviates inhibition by MDM2. Cell 91:325–334; 1997.

[85] Riley T, Sontag E, Chen P, Levine A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:402–412.

[86] Fridman JS, Lowe SW. Control of apoptosis by p53. Oncogene 2003;22:9030–9040.

[87] Awasthi, Y. C.; Ansari, G. A.; Awasthi, S. Regulation of 4-hydroxynonenal mediated signaling by glutathione S-transferases. Methods Enzymol. 401:379–407; 2005.

[88] Sharma, R.; Yang, Y.; Sharma, A.; Awasthi, S.; Awasthi, Y. C. Antioxidant role of glutathione S- transferases: protection against oxidant toxicity and regulation of stress-mediated apoptosis. Antioxid. Redox Signal. 6:289–300; 2004.

[89] Uchida, K.; Shiraishi, M.; Naito, Y.; Torii, Y.; Nakamura, Y.; Osawa, T. Activation of stress signaling pathways by the end product of lipid peroxidation. 4-hydroxy-2-nonenal is a potential inducer of intracellular peroxide production. J. Biol. Chem. 274:2234–2242; 1999.

[90] West, J. D.; Ji, C.; Duncan, S. T.; Amarnath, V.; Schneider, C.; Rizzo, C. J.; Brash, A. R.; Marnett, L. J. Induction of apoptosis in colorectal carcinoma cells treated with 4-hydroxy-2-nonenal and structurally related aldehydic products of lipid peroxidation. Chem. Res. Toxicol. 17:453–462; 2004.

[91] Sharma, R.; Yang, Y.; Sharma, A.; Dwivedi, S.; Popov, V. L.; Boor, P. J.; Singhal, S. S.; Awasthi, S.; Awasthi, Y. C. Mechanisms and physiological significance of the transport of the glutathione conjugate of 4-hydroxynonenal in human lens epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44:3438–3449; 2003.

98

[92] Cheng, J. Z.; Singhal, S. S.; Sharma, A.; Saini, M.; Yang, Y.; Awasthi, S.; Zimniak, P.; Awasthi, Y. C. Transfection of mGSTA4 in HL-60 cells protects against 4-hydroxynonenal-induced apoptosis by inhibiting JNK-mediated signaling. Arch. Biochem. Biophys. 392:197–207; 2001. [93] Sharma, A.; Patrick, B.; Li, J.; Sharma, R.; Jeyabal, P. V.; Reddy, P. M.; Awasthi, S.; Awasthi, Y.

C. Glutathione S-transferases as antioxidant enzymes: small cell lung cancer (H69) cells transfected with hGSTA1 resist doxorubicin-induced apoptosis. Arch. Biochem. Biophys. 452:165–173; 2006.

[94] Itoh, N.; Yonehara, S.; Ishii, A.; Yonehara, M.; Mizushima, S.; Sameshima, M.; Hase, A.; Seto, Y.; Nagata, S. The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis. Cell 66:233–243; 1991.

[95] Awasthi YC, Sharma R, Sharma A, Yadav S, Singhal SS, Chaudhary P, Awasthi S. Self-regulatory role of 4-hydroxynonenal in signaling for stress-induced programmed cell death. Free Radic Biol Med 2008;45:111–118.

[96] Cenini G, Sultana R, Memo M, Butterfi eld DA. Elevated levels of pro-apoptotic p53 and its oxidative modifi cation by the lipid peroxidation product, HNE, in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease. J Cell Mol Med 2008;12:987–994. [97] Tang SC, Lathia JD, Selvaraj PK, Jo DG, Mughal MR, Cheng A, Siler DA, Markesbery WR,

Arumugam TV, Mattson MP. Toll-like receptor-4 mediates neuronal apoptosis induced by amyloid beta-peptide and the membrane lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal. Exp Neurol 2008;213:114–121.

[98] Bresgen N, Jaksch H, Lacher H, Ohlenschlager I, Uchida K, Eckl PM. Iron mediated oxidative stress plays an essential role in ferritin induced cell death. Free Radic Biol Med 2010; 48:1347– 1357 .

[99] Jacobs AT, Marnett LJ. Heat shock factor 1 attenuates 4-Hydroxynonenal-mediated apoptosis: critical role for heat shock protein 70 induction and stabilization of Bcl-XL. J Biol Chem 2007;282:33412–33420.

[100] W.G. Siems, H. Zollner, T. Grune and H. Esterbauer, "Metabolic fate of 4-hydroxynonenal in hepatocytes: 1,4-dihydroxynonene is not the main product" Journal of Lipid Research Volume 38, 1997

[101] S. Choudhary, S. Srivastava, T. Xiao, U. P. Andley, S. K. Srivastava, and N.H. Ansari, " Metabolism of Lipid Derived Aldehyde, 4-Hydroxynonenal in Human Lens Epithelial Cells and Rat Lens", IOVS, June 2003, Vol. 44, No. 6

[102] Stephen W. Luckey and Dennis R. Petersen, " Metabolism of 4-Hydroxynonenal by Rat Kupffer Cells" Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 389, No. 1, May 1, pp. 77-83, 2001

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