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PARTE SPERIMENTALE

VIRTUAL SCREENING

La ricerca di nuovi scaffold potenzialmente attivi sulla FPPS, con gruppi leganti il magnesio alternativi rispetto al bifosfonato, si è basata sul database di composti MayBridge, contenente circa 85000 molecole, che è stato interamente filtrato attraverso due diverse applicazioni, Rocs e FLAP. I due programmi, descritti nel capitolo precedente, lavorano con due sistemi di calcolo completamente differenti; è quindi prevedibile che, pur utilizzando procedure di filtrazione con uguali templati, i risultati possano non essere sovrapponibili.

VS con ROCS

Prima di procedere con la filtrazione, il database è stato analizzato con un altro programma, OMEGA, tramite il quale si producono diversi conformeri per ogni molecola presente nel database.

E’ stata predisposta la generazione di 1000 conformeri per ognuna delle 85000 molecole, che sono poi state analizzate mediante l’utilizzo di Rocs per effettuare una prima filtrazione del database usando come molecola di riferimento l’IPA e parallelamente il composto A13. Il coefficiente di Tanimoto è stato regolato a un cutoff di 0,75 per quantificare la somiglianza richiesta tra le diverse molecole del database e la molecola che si pone come riferimento, nel nostro caso l’IPA e il composto A13, in modo che gli hits derivanti fossero un numero congruo.

Filtrazione con IPA

Le molecole che hanno superato questa filtrazione virtuale sono 1933, corrispondenti allo 2,3% del database utilizzato, ma comunque un numero eccessivo per poterlo prendere in considerazione per un’analisi sperimentale.

La seconda modalità di filtrazione è stata di tipo “qualitativo”, valutando la capacità dei 1933 composti di coordinare con gli ioni di Mg presenti nel sito attivo della FPPS.

E’ stato quindi effettuato il docking dei composti filtrati nel complesso 1ZW5 utilizzando la funzione ASP– fitting points, a le orientazioni risultanti sono state analizzate impostando come termine di filtrazione la collocazione di atomi elettronegativi, quali ossigeno e azoto, nella zona compresa entro i 3 Å dai Mg. Tale

59 requisito è stato soddisfatto da 87 molecole, diminuendo circa del 95% le molecole ottenute dalla prima filtrazione.

Le molecole residue sono state analizzate graficamente, visualizzando tramite il programma Chimera le diverse strutture. E’ stato osservato che alcune molecole erano ripetute in diversi stati di protonazione o più tautomeri, quindi è stato possibile diminuire ulteriormente il numero delle molecole da prendere in considerazione a 52 molecole.

Filtrazione con A13

Utilizzando il medesimo database della Maybridge, è stata applicata la procedura di virtual screening ponendo come molecola di riferimento un bifosfonato di nuova generazione:

composto A13

Lo scopo di questa seconda filtrazione, parallela alla prima, è la ricerca di composti che abbiano una struttura “comune” a un inibitore noto con scaffold piuttosto tradizionale, e un potenziale nuovo scaffold in grado di inibile la FPPS.

Dopo la prima filtrazione sono state ottenute 4014 molecole possibili; la filtrazione “qualitativa”, basata sulla coordinazione fra gli atomi di magnesio e gli eteroatomi dei ligandi orientati dal docking, è stata superata da 320 molecole.

I risultati dei due differenti virtual screening sono stati messi a confronto, e sono individuate due molecole che hanno superato entrambi i procedimenti di filtrazione.

Le strutture ricavate sono le seguenti:

ZINC 20459018

60 VS con FLAP

Un secondo procedimento di screening è stato effettuato con il programma FLAP. Contrariamente al metodo già descritto, in cui Rocs operava una filtrazione per somiglianza strutturale, FLAP realizza il virtual screening per sovrapposizione delle MIFs precedentemente calcolate sulle molecole del database (vedi capitolo dei Metodi). Quindi il primo passo è stata la costruzione del database contenente, oltre a tutte le conformazioni degli 85000 ligandi Maybridge, anche le mappe calcolate su tutti i conformeri utilizzando i probe N1, O, DRY e H, in grado di studiare le interazioni polari, idrofobe e la forma dei ligandi. Questa fase ha richiesto tempi di calcolo piuttosto lunghi; alle molecole Maybridge sono state aggiunte le molecole note, allo scopo di effettuare con FLAP anche una valutazione dello screening tramite il calcolo dell’Enrichment Factor (EF). Il database completo, quindi, è composto da 85060 composti, di cui 65 attivi. La definizione di attività è stata impartita considerando valori di IC50 minore di 1μ. Per ogni ligando del database sono presenti fino a 25 conformazioni possibili.

Lo studio dell’EF consiste nella valutazione dell’andamento degli score nel complesso del database rispetto a quello relativo ai soli ligandi attivi. Si presuppone che limitando la frazione del database filtrato, ordinato in base agli score decrescenti, a quella contenente i composti attivi sia più probabile individuare le molecole potenzialmente attive. Nel caso di FLAP, lo score calcolato per ogni molecola corrisponde alla percentuale di sovrapposizione fra le MIFs dei ligandi nelle varie conformazioni e quelle del ligando utilizzato come templato. La distribuzione degli score dei ligandi noti e delle molecole del database è rappresentata da una distribuzione Gaussiana e nel caso di una perfetta previsione di attività si ottengono due curve di distribuzione distinte per molecole attive e inattive (Figura 3.1 A). Riportando in grafico la percentuale di database filtrato ordinato per score (x) vs la percentuale di composti attivi filtrati rispetto al numero totale degli attivi aggiunti (y), si ottiene la curva di enrichment (Figura 3.1 B),

Se gli score dei ligandi attivi sono distribuiti in un intervallo molto ampio di valori, la loro dispersione è uniforme all’interno del database filtrato, e la curva di EF corrisponde alla bisettrice del I quadrante.

Nel caso ideale (Figura 3.1 B), tale curva cresce rapidamente e raggiunge subito un plateau (100% degli attivi); questo significa che la probabilità che nella prima piccola frazione del database filtrato siano contenuti tutti i ligandi attivi è alta.

In casi realistici, invece, le curve di distribuzione degli score dei ligandi attivi e inattivi sono in parte sovrapposte (Figura 3.1 C), ovvero non è possibile fare una distinzione netta tra molecole attive ed inattive sulla base degli score. Nel grafico dell’enrichment si ottiene, di conseguenza, una curva che cresce più lentamente (Figura 3.1 D). Questo significa che è necessario selezionare una frazione più grande del database perché vi sia contenuta un’alta percentuale di ligandi attivi.

61 Se il metodo di docking o la valutazione degli score non sono adeguati al virtual screening, gli score dei ligandi attivi e inattivi saranno completamente sovrapposti (Figura 3.1 E) e la curva di EF sarà sinusoidale (Figura 3.1 F).

Figura 3.1: Relazione tra la funzione di distribuzione degli score e le curve di enrichment.

Nel nostro caso, FLAP ha ordinato le molecole del database in base al grado di sovrapposizione fra le loro mappe precalcolate con GRID e quelle del ligando usato come templato. Analogamente alla procedura descritta con ROCS, sono stati utilizzati parallelamente il composto A13 e l’IPA.

Filtrazione con A13

La sovrapposizione è stata calcolata separatamente per le mappe di interazione con i probe N1, O, DRY e H, e anche per le loco possibili combinazioni. La migliore correlazione fra l’attività dei composti e la sovrapposizione delle MIFs è stata evidenziata per il probe N1 puro (98% di sovrapposizione), a dimostrazione dell’importanza della porzione negativa del bifosfonato. In seconda posizione, FLAP pone il calcolo derivante dalla combinazione dei probe N1 e H, confermando la necessità del gruppo legante elettronegativo unitamente

62 all’importanza della forma molecolare. Di seguito è riportato il grafico della percentuale degli attivi filtrati dal virtual screening rispetto al totale del database:

Figura 3.2: Curva di enrichment relativa al docking dei composti Maybridge filtrati.

La curva ha un andamento decisamente positivo, mostrando come il 95% circa dei composti con IC50 minore di 1μ aggiunti al database Maybridge siano stati filtrati entro lo 0,5% del database totale.

I primi 400 composti sono quindi stati considerati come potenzialmente attivi, e sottoposti a docking con procedura analoga a quella descritta per i ligandi noti e per il precedente VS effettuato con Rocs. Le orientazioni ottenute per i 400 hits sono state filtrate considerando la capacità di coordinare gli atomi di magnesio, ottenendo 106 composti in cui uno o più eteroatomi interagiscono con uno o più atomi di magnesio. Fra questi erano però presenti molte strutture differenti solo per stato di protonazione o tautomeria, o composti simili all’acido trimellitico variamente sostituito con alogeni che sono stati eliminati, riducendo gli hits finali dopo analisi grafica a 32.

Filtrazione con IPA

Anche in questo caso, la sovrapposizione è stata calcolata separatamente per le mappe di interazione con i probe N1, O, DRY e H, e anche per le loco possibili combinazioni. Analogamente allo screening con A13, la migliore correlazione fra l’attività dei composti e la sovrapposizione delle MIFs è stata evidenziata per il probe N1 puro (97% di sovrapposizione), seguita dalla combinazione dei probe N1 e O, a differenza del primo screening. Di seguito è riportato il grafico della percentuale degli attivi filtrati dal virtual screening rispetto al totale del database:

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Figura 3.3: Curva di enrichment relativa al docking dei composti Maybridge filtrati.

In questo caso la curva non mostra una filtrazione degli attivi nelle primissime fasi del database, infatti il 95% degli attivi è filtrato in un range di circa il 10% del database totale. Il risultato è comprensibile, tenendo conto che il templato usato per il virtual screening è l’IPA, che è strutturalmente molto diversa dai composti noti attivi. Sono stati sottoposti a docking i primi 800 composti filtrati, le orientazioni ottenute per gli 800 hits sono state filtrate considerando la capacità di coordinare gli atomi di magnesio, ottenendo 163 composti in cui uno o più eteroatomi interagiscono con uno o più atomi di magnesio. Eliminando poi le strutture ridondanti, gli hits finali rimasti sono 35.

Confrontando le strutture derivanti dalle due filtrazioni con FLAP, quella effettuata utilizzando il composto A13 come templato e quella derivante dallo screening con IPA, si sono trovate 4 strutture a comune:

ZINC01028885 ZINC03125968

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Virtual Screening work-flow:

VS con ROCS

IPA Composto A13

Filtrazione shaped-based 85000 - 1933 85000 – 4014

Coordinazione Mg 1933 - 87 4014 – 320

Eliminazione ridondanti 87 - 52 320 – 240

Molecole comuni 2

VS con FLAP

IPA Composto A13

Filtrazione MIF-based

EF guided 85000 - 800 85000 - 400

Coordinazione Mg 800- 163 400 - 106

Eliminazione ridondanti 163 - 35 106 - 32

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BIBLIOGRAFIA

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CAPITOLO 4

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