Derivati bifenil-ureici e bifenil-carbossamidici quali nuovi potenziali modulatori allosterici del recettore cannabinoide CB1.

UNIVERSITÀ DI PISA

D

IPARTIMENTO DI

F

ARMACIA

Corso di Laurea Magistrale in

Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

Tesi di Laurea

:

DERIVATI UREICI E

BIFENIL-CARBOSSAMMIDICI QUALI NUOVI POTENZIALI

MODULATORI ALLOSTERICI DEL RECETTORE

CANNABINOIDE CB1

Relatori:

Dott. Simone Bertini Prof.ssa Clementina Manera

Candidato:

Simone Codini (matricola 427063)

Settore Scientifico Disciplinare: CHIM/08

2

3

INTRODUZIONE GENERALE

5

ASPETTI BOTANICI E TASSONOMIA DELLA CANNABIS

6

I CANNABINOIDI

8

I RECETTORI CANNABINOIDI

10

LIGANDI ENDOGENI DEI RECETTORI CANNABINOIDI

13

BIOSINTESI E CATABOLISMO DEGL ENDOCANNABINOIDI

15

MECCANISMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE

17

PANORAMICA SUI LIGANDI PER I RECETTORI

CANNABINOIDI

20

CB1/CB2 agonisti

20

Agonisti CB1-selettivi

22

Agonisti CB2-selettivi

22

Antagonisti/Agonisti inversi CB1-selettivi

24

Antagonisti/Agonisti inversi CB2-selettivi

25

Antagonisti neutrali

26

MODULAZIONE ALLOSTERICA DEI GPCRs

28

MODULAZIONE ALLOSTERICA DEI RECETTORI CB1

32

Derivati Indolici

33

Derivati ureici

41

Modulatori allosterici endogeni del recettore CB1

48

4

INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE

BACKGROUND

55

Maggiore selettività per il sottotipo recettoriale

56

Riduzione degli effetti collaterali

57

NUOVI POTENZIALI MODULATORI ALLOSTERICI DEL

RECETTORE CB1

60

PARTE SPERIMENTALE

66

5

I

NTRODUZIONE

6

ASPETTI BOTANICI E TASSONOMIA DELLA CANNABIS

La cannabis (Famiglia: Cannabaceae; Genere: Cannabis) è una pianta originaria dell’Asia Centrale. Essa cresce essenzialmente nelle zone temperate e tropicali. Tuttavia, lungo il corso dei secoli, la sua coltivazione si è diffusa un po’ ovunque, nonostante le

diversità ambientali.

La pianta della cannabis (Figura 1) è un arbusto alto 1.5 - 3 metri, costituito da un fusto sottile e scanalato longitudinalmente, con numerose foglie brattee.

7

Le foglie sono picciolate ed hanno il peculiare aspetto vellutato; sono palmato-composte (5-13 foglioline), con segmenti lanceolato-acuminati e margine dentato-seghettato. Sono inoltre provviste di stipole (appendici che si differenziano alla base del picciolo delle foglie).

La cannabis è una pianta dioica (con piante maschili e femminili distinte) ed i fiori unisessuali si sviluppano su individui di sesso diverso. Esistono tuttavia delle varietà monoiche (con fiori maschili e femminili sulla stessa pianta). I fiori maschili, staminiferi, sono disposti in pannocchie giallognole, hanno 5 tepali fusi alla base e 5 stami. I fiori femminili, pistilliferi, sono riuniti in spighe glomerulate, disposte a gruppi di 2-6 alle ascelle delle brattee, con calice urceolato, circondante l’ovario uniovulato.

La pianta germina in primavera e fiorisce in estate inoltrata. L’impollinazione è

effettuata ad opera del vento (anemofila) anemofila. I frutti sono degli acheni ovoidi, di 2.5-3.5 mm di lunghezza, lisci e di colore grigiastro.1

La tassonomia ufficiale include la canapa nella famiglia delle Cannabacee o

Cannabinacee, appartenente all’ordine delle Urticali, piante legnose o erbacee con fiori

poco appariscenti, isolati o riuniti in gruppi.

Attualmente vi sono opinioni distinte in merito alla tassonomia del genere Cannabis: Nel 1753, Linneo parlò esclusivamente di Cannabis sativa.

Nel 1976, Small e Cronquist identificarono una sola specie, cioè la Cannabis sativa, con due sottospecie, ognuna con due varietà:

• Sottospecie indica

- variante indica;

- variante kafiristanica Vavilov. • Sottospecie sativa

8

- variante spontanea Vavilov.

La classificazione seguita dalla maggior parte dei botanici è quella di D. E. Janichewsky (1924), che suddivide la pianta in tre diverse specie:

• Cannabis sativa, cioè utile, detta volgarmente “canapa”, alta fino a tre metri e dalla

forma piramidale;

• Cannabis indica, cioè indiana, detta volgarmente “canapa indiana”, più bassa e con un

maggior numero di rami e foglie;

• Cannabis ruderalis, detta volgarmente “canapa russa”, alta al massimo 0.5 metri e priva

di rami.

Molto più recentemente, nel 2002, Clarke e Watson hanno indicato la specie Cannabis

sativa come unica specie possibile, comprendente tutti gli altri individui.2

I CANNABINOIDI

In passato, il termine “cannabinoidi” si riferiva ad un gruppo di composti derivanti dalla cannabis, cioè di origine naturale e che oggi vengono più propriamente definiti “fitocannabinoidi”.

Tutti i composti, naturali e di sintesi, in grado di interagire con i recettori cannabinoidi (vedi paragrafi successivi) vengono attualmente definiti “cannabinoidi”.

Tra i fitocannabinoidi (Figura 2), il principale composto attivo è il

delta-9-tetraidrocannabinolo (9-THC), olio viscoso rosso-marrone, concentrato nella resina della pianta.

I fitocannabinoidi sono molecole non polari e insolubili in acqua. La concentrazione di agenti psicoattivi presenti nella resina può variare dall’1% al 10% fino ad arrivare ad un

9

varietà stesse e della qualità di resina desiderata; la diversità di effetto nelle varietà di canapa è correlata con le differenze nella percentuale di cannabinoidi presenti.2

H O CH3 OH n-C₅H₁₁ 9_{-Tetraidrocannabinolo} O CH3 OH n-C5H11 8_{-Tetraidrocannabinolo} O CH3 OH n-C₅H₁₁ Cannabinolo HO CH3 OH n-C5H11 Cannabidiolo HO OH n-C₅H₁₁ Cannabigerolo OH n-C₅H₁₁ O Cannabicromene OH COOH O Cannabiciclolo HO O n-C5H11 Cannabielsoina OH H H H

Figura 2. Struttura dei principali fitocannabinoidi.

Dal punto di vista chimico, i cannabinoidi possono essere considerati dei terpenoidi sostituiti (terpeni uniti ad un residuo di resorcinolo a sostituzione alchilica), o anche dei dibenzopirani sostituiti (sistemi ad anello benzopiranico); le due classificazioni implicano anche una nomenclatura/numerazione differente: il Δ9_{-THC (numerazione dibenzopiranica)}

si chiamerebbe Δ1_{-THC secondo la numerazione terpenoide (Figura 3). In pratica, si usa}

10 O OH 6 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 6a 10a 10b 5' 3' 1' (a) O OH 6 1 2 3 4 5 7 8 9 10 _6' 4' 2' 1'' 3'' 5' 3' 1' (b) 5''

Figura 3. Numerazione dibenzopiranica (a) e terpenoide (b).

I RECETTORI CANNABINOIDI

Il forte interesse per il 9-THC ed il profondo desiderio di comprenderne gli effetti psicoattivi ha condotto, attraverso molteplici studi, all’identificazione dei recettori

cannabinoidi.

A tutt’oggi sono stati identificati ed ampiamente studiati due principali recettori

cannabinoidi, denominati CB1 e CB2.

La prima evidenza dell’esistenza di tali recettori risale alla metà degli anni ’80, quando

alcuni studi mostrarono che i cannabinoidi erano in grado di abbassare i livelli di cAMP in colture di cellule di neuroblastoma, suggerendo quindi l’attivazione di recettori accoppiati a proteine G.3, 4 Successivi studi immunoistochimici servirono a caratterizzare un recettore altamente espresso in certe regioni del cervello.5 Nel 1990 venne infine clonato il recettore CB1 dalla corteccia cerebellare di ratto.6 La clonazione del recettore CB2 avvenne pochi anni dopo, nel 1993, da cellule leucemiche umane HL-60 (human promyelocytic leukaemia cells.7

11 CB1 1 1 360 472 CB2

Figura 4. Rappresentazione schematica dei recettori cannabinoidi CB1 e CB2.8

Il recettore CB1 mostra un’omologia nella sequenza amminoacidica tra le specie, che va dal 97% al 99%. Il recettore CB1 umano (hCB1) è costituito da una catena polipeptidica di 472 amminoacidi (473 nel ratto e nel topo) ed è caratterizzato da sette domini transmembranali.

Il recettore CB2 mostra, rispetto al CB1, un’omologia del 68% nella sequenza

amminoacidica, per quanto riguarda i domini transmembranali, e solo del 44% per quanto riguarda la totalità della proteina.6 Il recettore CB2 umano (hCB2) è costituito da una sequenza di 360 amminoacidi, presenta anch’esso sette domini transmembranali ed è abbastanza differente dall’hCB1, specialmente per quanto riguarda il suo più corto dominio

ammino-terminale, dove non vi è sostanziale conservazione. I sette domini transmembrana (TM) di entrambi i recettori cannabinoidi sono collegati da tre loop intracellulari e tre loop extracellulari: I1, I2, I3 e E1, E2, E3, rispettivamente. La regione C-terminale intracellulare inizia con un piccolo dominio elicoidale e contiene un sito di palmitoilazione. La regione extracellulare N-terminale contiene un potenziale sito di N-glicosilazione. Una rappresentazione schematica dei recettori CB1 e CB2 è mostrata in Figura 4.

12

nel cervello, in particolare nelle aree collegate al comportamento, alla coordinazione motoria, alla cognizione ed alla memoria. Tale recettore è localizzato prevalentemente nei terminali pre-sinaptici; tuttavia è stata rilevata la sua presenza anche a livello post-sinaptico e nelle cellule della glia. L’ippocampo, i gangli basali, il cervelletto e la corteccia cerebrale sono distretti centrali in cui il recettore CB1 è altamente espresso. Una minore espressione di tale recettore si riscontra invece nell’amigdala, nell’ipotalamo, nel nucleus accumbens, nel midollo spinale ed in altre aree cerebrali, quali diencefalo e telencefalo. Il recettore CB1 è stato rilevato anche in tessuti periferici, quali testicolo, occhio, vescica urinaria, ileo, tessuto adiposo, fegato, muscoli scheletrici, pancreas, nervi sensoriali periferiche e nervi simpatici. Il recettore CB2 è invece espresso quasi esclusivamente in tessuti (timo, tonsille, midollo osseo, milza) e cellule (macrofagi, linfociti B e T, neutrofili) del sistema immunitario a livello periferico. La sua presenza è stata inoltre evidenziata nel tessuto osseo (osteoclasti, osteoblasti), nel pancreas, nell’endotelio vasale, nelle cellule

microgliali (in particolare, in condizioni di neuroinfiammazione) ed in alcuni neuroni, sia centrali che periferici (Figura 5).9-13

CB1 1. Corteccia 2. Nucleus accumbens 3. Gangli basali 4. Ipotalamo 5. Cervelletto 6. Ippocampo 7. Amigdala 8. Midollo spinale CB2 Cellule gliali CB1 + CB2 Tronco encefalico CB2 1. Milza 2. Ossa 3. Pelle CB1 1. Cervello 2. Polmoni 3. Sistema vascolare 4. Muscolo 5. Tratto gastrointestinale 6. Organi riproduttivi CB1 + CB2 1. Sistema immunitario 2. Fegato 3. Midollo osseo 4. Pancreas

13

LIGANDI ENDOGENI DEI RECETTORI CANNABINOIDI

I ligandi endogeni dei recettori cannabinoidi sono denominati “endocannabinoidi” ed appartengono alla famiglia dei lipidi biologicamente attivi che legano ed attivano tali recettori.16

L’anandamide (N-arachidonoil-etanolammina o etanolammide dell’acido arachidonico o

semplicemente AEA)17 ed il 2-arachidonoil-glicerolo (2-AG)18, 19 costituiscono gli endocannabinoidi “maggiori”, ovvero le molecole principali e più ampiamente studiate.

Altri endocannabinoidi, proposti nel corso degli ultimi anni, includono il 2-arachidonil-glicerol-etere (noladin etere),20 _{la N-arachidonoil-dopamina (NADA)}21,22 _{e la virodamina.}23

L’anandamide e il 2-AG sono paragonabili per quanto riguarda la loro affinità per i recettori cannabinoidi; inoltre entrambi si legano più selettivamente al recettore CB1 (Ki

(AEA) = 61 nM; Ki (2-AG) = 58.3 nM) piuttosto che al recettore CB2 (Ki (AEA) = 279

nM; Ki (2-AG) = 145 nM). In realtà, il 2-AG mostra una maggiore efficacia, rispetto ad

AEA, nell’attivare entrambi i recettori.24

Gli endocannabinoidi non vengono biosintetizzati “in anticipo” e stoccati in vescicole, come accade invece per la maggior parte dei neuromodulatori, bensì vengono biosintetizzati e liberati “on demand” a partire da derivati dell’acido arachidonico, ad opera

di enzimi specifici (come ad esempio la diacilglicerolo lipasi, DAGL).

Gli endocannabinoidi esercitano sia un’azione neuromodulatoria, attraverso l’inibizione

del rilascio di neurotrasmettitori (con un meccanismo di segnalazione retrograda),25 sia un’azione immunomodulatoria, mediante la regolazione del rilascio di citochine e della

14

È ormai generalmente accettato che in certi stati patologici il rilascio di endocannabinoidi aumenta in particolari tessuti, ma vi sono anche evidenze che questa “up-regulation” del sistema endocannabinoide conduce in molti casi alla soppressione dei sintomi non voluti e che quindi sia in qualche modo “auto-protettiva”, o addirittura vi sono situazioni in cui l’aumento degli endocannabinoidi produce esso stesso degli effetti

indesiderati.28 _{Per fare alcuni esempi, il rilascio di endocannabinoidi migliora la spasticità}

muscolare nella sclerosi multipla ed allevia il dolore infiammatorio, ma d’altro canto incrementa l’obesità o crea problemi di fertilità in alcune donne. Per questo motivo, l’interesse della ricerca è oggi rivolto non solo all’individuazione di composti che agiscano

in modo diretto sui recettori cannabinoidi (da agonisti o da agonisti inversi/antagonisti), ma anche di composti che influenzino l’attività degli endocannabinoidi in maniera indiretta,

essenzialmente mediante due meccanismi: 1) la modulazione allosterica dei recettori indotta dagli endocannabinoidi, che verrà approfondita nei paragrafi successivi; 2) la variazione dei livelli degli endocannabinoidi, agendo sugli enzimi preposti alla loro biosintesi o su quelli deputati alla loro degradazione.

15

Figura 6. Strutture chimiche degli endocannabionidi.

BIOSINTESI E CATABOLISMO DEGLI ENDOCANNABINOIDI

La biosintesi ed il catabolismo dell’anandamide sono rappresentati nella Figura 7.29

L’anandamide viene prodotta a partire da una piccola famiglia di fosfolipidi di membrana, le N-arachidonoil-fosfatidil-etanolammine (NarPE), prodotte a partire dai fosfolipidi e da fosfatidiletanolammina, mediante una aciltransferasi calcio-dipendente. Da questo punto in poi, essendo la precisa via biosintetica controversa, sono state suggerite almeno 4 alternative:

1) La fosfolipasi D N-acilfosfatidiletanolammina-specifica (NAPE-PLD) converte direttamente NArPE in anandamide;

2) La -idrolasi 4 (ABHD4) catalizza la conversione di NarPE in liso-NArPE e quindi in glicerofosfoanandamide che, mediante la glicerofosfodiesterasi-1 (GDE1) viene convertita in anandamide;

16

3) La formazione di liso-NArPE sembra avvenire anche mediante una fosfolipasi A2

solubile, seguita dalla conversione diretta in anandamide, mediante una liso-fosfolipasi D; 4) Una fosfolipasi C non ancora ben definita converte NArPE in fosfo-anandamide, seguita da una fosfatasi (come la protein tirosin fosfatasi N22 o la inositolo fosfatasi SHIP2) che converte la fosfo-anandamide in anandamide;

L’anandamide viene inattivata in seguito all’idrolisi del gruppo ammidico ad opera dell’enzima acido grasso ammide idrolasi (“Fatty Acid Amide Idrolase”, FAAH).

AA P -O-Et-NH2 + P -O-Et-NH-AA NArPE Aciltransferasi Ca2+_-dipendente NAPE-PLD AA-NH-Et-OH ANANDAMIDE P -O-Et-NH-AA LysoNArPE OH LysoPLD ABHD4 ABHD4 P -O-Et-NH-AA OH OH Glicero-fosfo-anandamide GDE1 sPLA2 1 2 2 2 3 3 P -O-Et-NH-AA Fosfono--anandamide PLC 4 4 PTPN22 SHIP2 Fosfolipide Fosfatidil--etanolammina FAAH AA + HO-Et-NH2

Figura 7. Biosintesi e catabolismo dell’anandamide.29

La biosintesi ed il catabolismo del 2-AG sono mostrate nella Figura 8.29 I precursori biosintetici di 2-AG, ovvero gli sn-1-acil-2-arachidonoilgliceroli (AArG) vengono prodotti a partire dai fosfatidilinositidi (o fosfatidilinositoli) di membrana, ad opera della fosfolipasi C (PLC). Gli AArG vengono quindi convertiti in 2-AG, ad opera di una qualsiasi delle

due isoforme ( o ) della sn-1-diacilglidcerolo lipasi (DAGL o DAGL. Quest’ultimo enzima è sensibile al Ca2+ ed attivato dal glutatione.

17

(MAGL) pre-sinaptica è sicuramente quello più importante (un altro enzima, quale la ,-idrolasi 6, di cui è stata recentemente dimostrata la capacità di controllare i livelli di 2-AG nei neuroni e nella microglia, è localizzato post-sinapticamente). Da notare come l’inositolo trifosfato, prodotto in seguito alla formazione di AArG, stimoli la mobilizzazione di Ca2+ intracellulare attraverso specifici recettori sul reticolo endoplasmatico, contribuendo alla stimolazione di DAGL.

AArG PLC Fosfatidilinositoli P -In- P - P AA AA OH Ca2+ + P -In- P - P Inositolo trifosfato DAGL o  AA OH OH 2-AG Recettore dell’IP3 Ca2+ OH OH OH AA + MAGL

Figura 8. Biosintesi e catabolismo del 2-AG.29

MECCANISMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE

I meccanismi di trasduzione del segnale associati all’attivazione dei recettori CB1 e

CB2 sono schematizzati nella Figura 9.

Entrambi i recettori CB1 e CB2 appartengono alla famiglia della rodopsina GPCR

(Classe A) e sono principalmente accoppiati a proteine Gi/o, (tramite le subunità ),

attraverso cui essi inibiscono l’adenilato ciclasi (da cui ne consegue un diminuito livello di

18

Tipici eventi intracellulari Gi/o-mediati, accoppiati esclusivamente all’attivazione dei

recettori CB1, sono rappresentati dall’inibizione dei canali al Ca2+ _{voltaggio-dipendenti}

(VGCCs) di molti tipi (incluso i canali P/Q, N e L) e dalla stimolazione dei canali al K+ di tipo Kir (“inward rectifying”),30-32 la PKA infatti, in assenza di cannabinoidi fosforila la

proteina del canale potassio, con conseguente diminuzione della corrente del potassio verso l'esterno, ma in presenza di questi, si verifica una riduzione della fosforilazione del canale potassio con un conseguente aumento della corrente dello ione verso l’esterno,33 diminuendo così l'eccitabilità neuronale.34-36 Inoltre, vi sono evidenze sempre maggiori della capacità di CB1-agonisti (inclusi endocannabinoidi, come anandamide e 2-AG) di stimolare direttamente: 1) L’idrolisi del fosfatidil-inositolo-difosfato (PIP2) ad opera della

PLC- (fofsfolipasi C-), con il conseguente rilascio di inositolo-1,4,5-trifosfato (IP3) e la

mobilitazione di Ca2+ _{dal reticolo endoplasmatico (ER), attraverso meccanismi G} q/11

-mediati o Gi/o-mediati;37-40 2) La modulazione, attraverso Gi/o, della “cascata di segnale”

mediata dalla fosfoinositide-3-chinasi (PI3K), che può essere di tipo positivo o negativo a seconda del tipo di cellula,41-45 influenzando così la successiva via Akt/protein chinasi B.

Un altro meccanismo di trasduzione del segnale descritto per entrambi i recettori è rappresentato dal rilascio di ossido nitrico (NO)46-48 _{con conseguente attivazione della} guanilato ciclasi ed aumento dei livelli di cGMP,49, 50 mentre il recettore CB2 risulta anche accoppiato ad un aumento del rilascio di ceramide30 _{ma non agisce sui canali ionici.}51-53

19

G

PIP2

IP3

DAG

PKC

PI3K

K

PLC

G

GC

NO

AC

MAPK





g

g





CB

CB

Terminale

presinaptico

20

PANORAMICA SUI LIGANDI PER I RECETTORI CANNABINOIDI

CB1/CB2 Agonisti

I composti in grado di attivare sia i recettori CB1 che i recettori CB2, all’incirca con la stessa potenza, rientrano essenzialmente in una delle seguenti quattro classi chimiche: 1)

Cannabinoidi classici; 2) Cannabinoidi non classici; 3) Amminoalchilindoli; 4)

Eicosanoidi.

1) Cannabinoidi classici. Si tratta di derivati naturali e sintetici aventi struttura

dibenzopiranica. Gli esempi più importanti sono: il (-)-9-THC che si lega con

uguale affinità ai recettori CB1 e CB2 e si comporta da agonista parziale su entrambi; esso tuttavia presenta una maggiore efficacia sul recettore CB1; il (-)-8

-THC ricalca il derivato precedente per quanto riguarda l’affinità recettoriale e l’efficacia nell’attivare il recettore CB1; l’HU-210, particolarmente potente, i cui

effetti farmacologici in vivo risultano di durata eccezionalmente lunga (ciò può essere in gran parte attribuito alla presenza della catena laterale dimetileptilica, al posto di quella pentilica presente nel THC).

(-)-9_-THC (-)-8_-THC

21

2) Cannabinoidi non classici. Sono analoghi biciclici o triciclici del THC, in cui l’anello piranico è stato rimosso. L’esempio più tipico è il CP55,940, agonista cannabinoide

considerevolmente più potente del THC ed ampiamente utilizzato come riferimento nei test di laboratorio.

CP55,940

3) Amminoalchilindoli. Il prototipo di questa classe è il WIN 55,212-2, ampiamente utilizzato nella ricerca sui cannabinoidi. Presenta livelli di affinità recettoriale nel range del basso nM ma, a differenza del CP55,940, è leggermente più affine al recettore CB2 rispetto al CB1.

WIN55,212-2

4) Eicosanoidi. Fanno parte di questa classe i già citati AEA e 2-AG. L’AEA, pur presentando dei livelli di affinità recettoriali molto inferiori rispetto al THC, ricalca quest’ultimo nel profilo di agonista parziale sia sul recettore CB1 che sul CB2 e per il fatto che mostra un’efficacia inferiore sul recettore CB2. Il 2-AG presenta dei livelli di affinità

22

efficacia superiori, sia sul recettore CB1 che sul CB2, come già accennato nei paragrafi precedenti.

Agonisti CB1-selettivi

I primi agonisti CB1-selettivi sono stati sviluppati proprio a partire da AEA, la cui leggera selettività per il recettore CB1 è stata significativamente incrementata inserendo un gruppo metilicosul carbonio in posizione 2’ (R-(+)-metanandamide). Inoltre, tale modifica

strutturale conferisce una notevole resistenza all’azione idrolitica di FAAH, per cui la R-(+)-metanandamide ed anche il suo ciano-analogo O-1812 rappresentano degli analoghi metabolicamente stabili di AEA.

Altri agonisti CB1-selettivi caratterizzati da elevata efficacia, ma non resistenti alla

FAAH, sono la arachidonil-2’-cloroetilammide (ACEA) e la

arachidonil-ciclopropilammide (ACPA).

R-(+)-metanandamide O-1812

ACEA ACPA

Agonisti CB2-selettivi

Di questa classe fanno parte JWH-133 e JWH-015; entrambi si legano maggiormente al recettore CB2 rispetto al CB1, ma JWH-015 risulta essere meno selettivo.

23

Altri composti di questa classe sono GW-405833 che si comporta come agonista parziale dei recettori CB2,HU-308, AM-1241, L-759,633 e L-759,656.In particolare, AM-1241 risulta interessante per il fatto che potrebbe rappresentare un “protean agonist” per il recettore CB2; infatti si comporta da agonista nei tessuti dove i recettori CB2 sono naturalmente espressi, ma non in quelli dove i recettori CB2 sono stati inseriti geneticamente e quindi risultano presumibilmente sovraespressi.

JWH-133 JWH-015 HU-308 AM-1241 GW-405833

24

Antagonisti/agonisti inversi CB1-selettivi

Il primo e più importante composto di questa classe ad essere stato sviluppato è il derivato diarilpirazolico SR141716A. Si tratta di un ligando selettivo e potente in grado di prevenire o “revertare” gli effetti CB1-mediati, sia in vitro che in vivo. Questo derivato,

maggiormente noto con il nome di rimonabant, presenta una selettività per il recettore CB1 di circa 1000 volte rispetto al recettore CB256 _{ed è stato approvato nel 2006 come farmaco}

anti-obesità. A soli due anni dall’immissione in commercio l’EMEA (European Medicines Agency) ha disposto il suo ritiro dal mercato a causa dell’aumentata incidenza di ansia, depressione e tendenza suicida. Attualmente SR141716A trova impiego essenzialmente come “tool” di laboratorio, ovvero come composto di riferimento in esperimenti volti a

valutare le proprietà farmacologiche di nuovi ligandi cannabinoidi.

Altri derivati degni di nota sono AM-251 e AM-281 (analoghi di SR141716A).

Un altro composto appartenente a questa classe è il benzofurano LY320135. Esso è meno affine al recettore CB1 rispetto ai tre composti sopra citati. A concentrazioni nel “range” del basso micromolare è in grado di legarsi anche ai recettori muscarinici e

serotoninergici.

Vi sono evidenze ormai assodate che SR141716A, AM251, AM281 e LY320135 non siano antagonisti “neutrali”, ma che, oltre ad essere in grado di attenuare gli effetti dei

CB1-agonisti, possano essi stessi provocare risposte opposte rispetto a quelle mediate dai CB1-agonisti. Ciò può essere dovuto sia ad un diretto antagonismo delle risposte evocate dal rilascio di endocannabinoidi, che ad una riduzione della cosiddetta attività “costitutiva” dei recettori CB1 (il “coupling” del recettore CB1 con i suoi meccanismi effettori, in assenza di endocannabinoidi e/o agonisti esogeni).

25

SR141716A (rimonabant) AM251

AM281 LY320135

Antagonisti/Agonisti inversi CB2-selettivi

I principali composti di questa classe sono il derivato diarilpirazolico SR144528 e il derivato indolico AM630. Entrambi si legano con maggiore affinità al recettore CB2, mostrano una potenza notevole come antagonisti e si comportano anche come CB2-agonisti inversi. AM630 è in grado di “revertare” l’inibizione della produzione di cAMP (stimolata da forskolina) indotta da CP55,940 in cellule CHO trasfettate con recettori CB2 umani, a concentrazioni nel range del nM (EC50 = 1289 nM). Esso è inoltre in grado di

incrementare la produzione di cAMP (stimolata da forskolina) nella stessa linea cellulare, quando viene somministrato da solo (EC50 = 230 nM).

26

SR144528 AM630

Antagonisti neutrali

Si tratta di composti aventi un’affinità più o meno elevata per i recettori cannabinoidi

(possibilmente CB1- o CB2-selettivi), ma che mancano di effetti agonisti e agonisti inversi. In realtà, un antagonista neutrale potrebbe essere sfruttato come “tool” farmacologico per distinguere, in un sistema biologico che esprima i recettori CB1 o CB2, tra l’attività cannabimimetica derivante dal rilascio di endocannabinoidi (alla quale può opporsi) e quella “costitutiva”, cioè indipendente dal ligando (alla quale non può opporsi).

Si hanno evidenze di un comportamento antagonista neutrale a livello del recettore CB1 per i seguenti composti (strutture non riportate): il 6’’-azidoes-2’-inil-cannabidiolo (O-2654), l’O-2050 (analogo solfonammidico del 8_{-THC con una catena laterale acetilenica)}

e il VCHR (analogo di SR141716A).

Per quanto riguarda il recettore CB2, gli esempi di antagonisti neutrali sono veramente esigui. WIN-55,212-3, enantiomero del già citato WIN-55,212.2, ha mostrato di comportarsi da antagonista neutrale competitivo a livello del recettore CB2, sebbene esso sia un ligando caratterizzato da un’affinità piuttosto bassa.57

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Alcune serie di derivati a struttura bifenilica (strutture non riportate), quali antagonisti neutrali CB2-selettivi caratterizzati da buoni livelli di C2-affinità, sono stati sviluppati molto recentemente nel laboratorio di ricerca presso il quale ho svolto la presente tesi di laurea.58,59

I composti mostrati nei precedenti paragrafi costituiscono esempi di ligandi cannabinoidi cosiddetti “ortosterici”, ovvero che si legano al sito principale, denominato appunto “ortosterico”. Tuttavia, è ormai assodato che i recettori accoppiati a proteine G

(GPCRs) e quindi in particolare i recettori cannabinoidi, presentino anche dei siti di legame “allosterici” topograficamente distinti da quello ortosterico. Dopo la scoperta di un sito di legame allosterico presente sul recettore CB1, l’interesse della ricerca è stato rivolto

proprio all’identificazione ed allo sviluppo di possibili ligandi allosterici (meglio definiti “modulatori allosterici”) per questo sottotipo recettoriale.

La struttura chimica e le proprietà dei composti aventi queste ultime caratteristiche, così come alcuni aspetti teorici della modulazione allosterica, verranno specificamente trattati nella prossima sezione dell’Introduzione Generale.