Politecnico Di Milano
Facoltà di Ingegneria Dei Sistemi
Corso di Laurea in Ingegneria Biomedica
ANALISI E CARATTERIZZAZIONE DI UN SENSORE
OTTICO PER STRUMENTAZIONE PORTATILE
DI REAL-TIME PCR SU LAB-ON-CHIP
RELATORE:
Prof. Rafaelle Dellacà
CORRELATORE:
TESI DI LAUREA DI
Ing. Marco Bianchessi
Jorge Enrique Solorzano Pozo
Matr. N. 720046
Ringraziamenti
Desidero innanzitutto ringraziare il Professor Dellacà per i preziosi insegnamenti durante i due anni di laurea magistrale e le per le ore dedicate alla mia tesi. Inoltre, ringrazio sentitamente L'ingegnere Bianchessi che è stato sempre disponibili a dirimere i miei dubbi durante la stesura di questo lavoro. Inoltre, vorrei esprimere la mia sincera gratitudine ai miei colleghi, con cui sono trascorsi dodici mesi di tesi; ringrazio in modo particolare Alessandro, Pietro, Federica, Jasmin, Marco D., Marco C. per il gruppo Bio, Daniele, Davide e Luca per il gruppo Robot con cui ho imparato tanto sul controllo del sensore ottico. In ne, ho desiderio di ringraziare con aetto i miei genitori per il sostegno ed il grande aiuto che mi hanno dato, da lontano però sempre vicini nei miei pensieri e dentro il mio cuore ed in particolare Branka per essermi stata vicina ogni momento durante questo anno di lavoro.
Indice
Ringraziamenti 1
Elenco delle gure 6
Elenco delle tabelle 9
Sommario 10
Summary 14
Introduzione 17
1 Tecniche di analisi nucleotidiche 18
1.1 Introduzione . . . 18
1.2 Reazione a Catena della Polimerasi . . . 19
1.2.1 I componenti della miscela di reazione . . . 19
1.2.2 Meccanismo di funzionamento . . . 22
1.2.3 E cienza di reazione . . . 25
1.2.5 Applicazioni . . . 29
1.3 La Real-Time PCR . . . 30
1.3.1 Introduzione . . . 30
1.3.2 Marcatura del DNA . . . 30
1.3.3 La Fluorescenza . . . 32
1.3.4 Ciclo soglia e quantità iniziale di DNA . . . 34
1.3.5 Applicazioni . . . 37
1.4 PCR vs Real-Time PCR . . . 37
2 Sistema di Real-Time PCR basato su lab-on-chip 39 2.1 Introduzione . . . 39 2.2 Il lab-on-chip . . . 40 2.3 La scheda di controllo . . . 44 2.4 La componente meccanica . . . 47 2.5 La componente biologica . . . 48 2.6 Il sistema di illuminazione . . . 49 2.7 I ltri ottici . . . 51 2.8 Il sensore ottico . . . 53
3 Tecnologia dei sensori ottici 55 3.1 Introduzione ai sensori ottici . . . 55
3.1.1.1 Concetti di basi sui CCD . . . 55
3.1.1.2 Tipologia dei CCD . . . 56
3.1.1.3 Performance di un CCD . . . 60
3.1.2 Sensore CMOS . . . 63
3.1.2.1 Concetti di Base dei sensori a tecnologia CMOS . 63 3.1.2.2 Il sensore CMOS per immagini . . . 64
3.1.2.3 Architettura di base . . . 64
3.1.2.4 Riconoscimento colorimetrico . . . 65
3.1.3 Parametri Caratteristici di sensori d'immagini . . . 67
3.2 Sensore ST - VS6724 . . . 69
3.2.1 Descrizione del sensore: . . . 69
3.2.2 Funzionamento del coprocessore . . . 71
4 Caratterizzazione del sensore VS6724 73 4.1 Introduzione . . . 73
4.2 Set-up sperimentale. . . 73
4.2.1 Strumenti e programmi utilizzati per condurre gli esperimenti 76 4.2.1.1 Modulo Camera RVS: . . . 76
4.2.1.2 Strumenti Programmabili: Agilent E3631A e Ag-ilent 34410A . . . 77
4.2.2 Software implementati per l'acquisizione dei dati . . . 79
4.2.2.2 Creazione della sequenza di esperimenti . . . 80
4.2.2.3 Software per l'avvio gli esperimenti . . . 82
4.3 Prove sperimentali e risultati . . . 83
4.3.1 Esperimento 1 . . . 84 4.3.2 Esperimento 2 . . . 85 4.3.3 Esperimento 3 . . . 87 4.3.4 Esperimento 4 . . . 90 4.3.5 Esperimento 5 . . . 92 4.3.6 Esperimento 6 . . . 93
Conclusioni e sviluppi futuri 95
Bibliogra a 97
Elenco delle gure
1.1 Gli stadi della PCR . . . 22
1.2 Termociclatore . . . 23
1.3 Principio di funzionamento della PCR . . . 25
1.4 Fasi della PCR . . . 27
1.5 Apparato di elettroforesi . . . 28
1.6 Immagine di una corsa elettroforetica . . . 29
1.7 Molecola uorescente . . . 31
1.8 Sonda Taqman . . . 32
1.9 Diagramma di Jablonsky sempli cato . . . 33
1.10 Risultato della Real-Time PCR . . . 36
1.11 Rapporto fra numero di cicli termici CT e il logaritmo della con-centrazione iniziale . . . 37
2.1 Lab-on-chip . . . 40
2.2 Parte inferiore del chip - STMicroelectronics . . . 42
2.4 Cameretta da 9 pozzetti . . . 43
2.5 Cameretta da 6 pozzetti . . . 43
2.6 La scheda di controllo . . . 44
2.7 La contattiera . . . 47
2.8 La slitta . . . 48
2.9 Simbolo circuitale del LED . . . 49
2.10 Filtro passa banda ad una singola cavità . . . 52
2.11 Modulo di visione per la Real-Time PCR . . . 54
3.1 Sensore CCD . . . 56
3.2 Schema logico di un sensore CCD . . . 57
3.3 Interline Transfer . . . 58
3.4 Frame Transfer . . . 59
3.5 Full Frame Transfer . . . 60
3.6 Rete Pull-up, rete Pull-down . . . 63
3.7 Con gurazione di base del sensore CMOS . . . 65
3.8 Beam splitter . . . 66
3.9 Filtri a rotazione . . . 66
3.10 Filtro Bayern . . . 67
3.11 Formato Bayer . . . 71
4.1 Segnale di un duty-cycle del 20% . . . 74
4.3 Setup-sperimentale . . . 75
4.4 Modulo RVS . . . 77
4.5 Interfaccia USB . . . 77
4.6 Alimentatore Agilent E3631A . . . 78
4.7 Multimetro Agilent 34410A . . . 78
4.8 Sequenza di inizializzazione del sensore VS6724 . . . 80
4.9 Scelta della modalità di lavoro . . . 80
4.10 Interfaccia gra ca per l'utilizzo del Modo Diretto . . . 81
4.11 Interfaccia gra ca per l'utilizzo del Modo Compilato . . . 81
4.12 Finestra per la selezione del tipo di esperimento . . . 82
4.13 Finestra per caricare ed eseguire gli esperimenti . . . 83
4.14 Risultato esperimento n°1 . . . 85
4.15 Risultato dell'esperimento n°2 . . . 87
4.16 Risultati dell'esperimento n°3 . . . 88
4.17 Dettagli del gra co di Figura 4.16 . . . 89
4.18 Risultato dell'esperimento n°4 . . . 90
4.19 Curve isoluminose . . . 91
4.20 Rapporto fra media dei pixel e varianza . . . 92
Elenco delle tabelle
1.1 Vantaggi e svantaggi della PCR . . . 38
1.2 Vantaggi e svantaggi della Real-Time PCR . . . 38
4.1 Valori impostati nell'esperimento n°1 . . . 84
4.2 Valori impostati nell'esperimento n°2A . . . 86
4.3 Valori impostati nell'esperimento n°2B . . . 86
4.4 Valori impostati nell'esperimento n°3 . . . 88
4.5 Valori impostati nell'esperimento n°4 . . . 89
4.6 Valori impostati nell'esperimento n°5 . . . 92
Sommario
La genomica è lo studio della struttura, del contenuto e dell'evoluzione dei geni. I progressi tecnologici, dovuti inizialmente al sequenziamento di nucleotidi su larga scala, hanno in seguito determinato una rapida crescita di questo campo di ricerca. Nuovi strumenti sempre più automatizzati hanno permesso un ulteriore sviluppo e progresso della ricerca in questo campo. Tra gli attuali loni di ricerca, e' sempre più rilevante lo studio dell'espressione genica di tipo comparativo: cioè identi care, tra i diversi campioni in esame, eventuali sottogruppi di geni che presentano dif-ferenti espressioni. Tra le diverse tecnologie sviluppate per questo tipo di analisi, ha rivestito per molti anni un ruolo predominante la tecnica basata su una iniziale PCR, acronimo di Polymerase Chain Reaction, che comporta un'ampli cazione del materiale genomico di interesse (sequenza speci ca) attraverso una reazione enzimatica attivata da un processo termico, seguita da una procedura di elettro-foresi su gel o capillare, necessaria a determinare l'eventuale presenza nel campione biologico della sequenza nucleotidica di interesse. Due metodi più moderni per mis-urare la quantità di un singolo mRNA sono la real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR) o la reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), che permettono di quanti care la presenza di un determinato trascritto anche in pochi nanolitri di estratto cellulare. Per tale elevatissima sensibilità la RT-PCR è attualmente la tecnica di elezione, anche se i costi per gli strumenti ed i reagenti possono essere proibitivi.
La tecnica di Real-Time PCR consente di monitorare in tempo reale l'ampli -cazione di una sequenza target dal materiale genetico di partenza, sfruttando una marcatura a emissione di uorescenza del campione biologico. Il segnale di uo-rescenza proviene da marcatori intercalanti, ovvero molecole che si insinuano nella doppia catena di DNA, una volta intercalate diventano uorescenti per l'eetto
di separazione sica di una molecola uorescente e del quencher (in soluzione il marcatore risulta avvolto su se stesso e pertanto il quencher riassorbe i fotoni emessi dal uoro foro). Pertanto la uorescenza globale del volume di reazione (campione in analisi) e' proporzionale alla quantità di dna target presente, tale quantità raddoppia ad ogni ciclo termico di PCR, monitorando l'andamento della uorescenza ad ogni ciclo, si riesce a quanti care la concentrazione iniziale di DNA target calcolando il momento (numero del ciclo termico) nel quale si supera una certa soglia. La tecnica di Real Time PCR e' descritta in dettaglio nel capitolo 1. STMicroelectronics sta sviluppando delle piattaforme LabOnChip per applicazioni diagnostiche di analisi molecolari. In particolare si sta investendo su un sistema di detection per real time PCR. Tali dispositivi renderanno più facile, agile e veloce l'analisi di determinate patologie, che oggi sono estremamente costose e compli-cate, tanto da essere svolte solo da personale specializzato in laboratori attrezzati con strumentazione molto costosa. Pertanto lo scopo e' quello di realizzare pi-attaforme di tipo Point Of Care, ove, mediante l'utilizzo di strumentazione a basso costo e semplice da utilizzare, queste tecniche diventano alla portata anche di utilizzatori meno esperti.
Il lavoro di tesi si inquadra nello sviluppo di una piattaforma per Real Time PCR, composta da un Lab On Chip disposable" (usa e getta) e uno strumento ded-icato. Lo strumento e' composto da una scheda a microcontrollore ARM per il controllo della ciclatura termica, ed un modulo ottico con sensore CMOS per l'analisi della uorescenza.
Obbiettivo del lavoro di tesi è analizzare e caratterizzare il sensore di rilevazione della uorescenza composta da un sensore ottico a tecnologia CMOS fabbricato da STMicroelectronics, un microcontrollore per la regolazione dei parametri della camera, dei LED per l'eccitazione e i ltri ottici per la separazione della lunghezza d'onda di interesse.
Il lavoro di tesi è articolato quattro capitoli principali:
Il primo ore una panoramica relativa alle due principali tecniche di analisi moleco-lari: PCR e Real Time PCR. Entrambe prevedono una iniziale fase di ampli -cazione del materiale genomico a disposizione mediante la reazione a catena della
polimerasi. Una semplice reazione di PCR deve, tuttavia, essere accompagnata da una successiva analisi del campione biologico mediante elettroforesi su gel, con l'obbiettivo di valutare la presenza della sequenza nucleotidica di interesse. La Real Time PCR rappresenta una evoluzione di tale tecnica: in particolare consente una ampli cazione ed una quanti cazione simultanea delle molecole di DNA di interesse. Mediante un sistema di rilevazione del segnale di uorescenza è possi-bile monitorare in tempo reale l'eettiva ampli cazione delle catene nucleotidiche e risalire alla concentrazione iniziale del DNA di interesse. La tecnica di PCR e in particolare di Real-Time PCR, ha rivoluzionato il campo della diagnostica molecolare, fornendo nuovi e potenti strumenti per eettuare diagnosi precoci di alterazioni genetiche anche a livello di singolo nucleotide. L'estrema sensibilità e la possibilità di funzionare a partire da campioni non trattati si è rivelata ottimale nel-la diagnosi prenatale di manel-lattie genetiche, nell'analisi precoce di marker tumorali e nei follow up clinici conseguenti ad asportazioni chirurgiche di tumori. Anche in campo forense e medico legale la PCR si è imposta come strumento essenziale sul quale si basano analisi di paternità e perizie medico-legali.
Il secondo capitolo ore una dettagliata descrizione del sistema sviluppato da STMicroelectronics per realizzare su un unico dispositivo la reazione di PCR, l'ibridazione delle catene ampli cate con sonde ad emissione di uorescenza e la detection di tale segnale. Il sistema è costituito da: il Lab-on-chip, la scheda di controllo, una componente meccanica, una componente biologica, un sistema di illuminazione, i ltri ottici e il sensore ottico per la rilevazione del segnale di uorescenza.
Il labOnChip è un dispositivo MEMS monolitico realizzato a partire da un unico substrato in silicio grazie alle tecniche di lavorazione dei semiconduttori. Il circuito di controllo è costituito da quattro blocchi: circuito di riscaldamento, circuito di rareddamento, circuito di controllo della temperatura e sistema di comunicazione verso PC. È stata progettata e realizzata una piccola camera di reazione in mate-riale polimerico tale da poter essere posizionata sopra il chip in silicio e contenente il campione biologico in esame. Il sensore ottico consente in ne la rilevazione del segnale di uorescenza eventualmente generato a seguito dell'ibridazione.
Il terzo capitolo illustra due tecnologie impiegate per la fabbricazione dei sensori ottici: CCD e CMOS. Entrambe le tecnologie sono utilizzate per la rilevazione
della luminosità però con diverse caratteristiche, mentre il CCD immagazzina l'en-ergia proveniente dai fotoni e richiede di un ulteriore processo per ottenere una rappresentazione digitale, il sensore CMOS, appro ttando la capacità di integrare convertitori analogo-digitale e altri circuiti elettronici per il processing del segnale proveniente dal sensore, non richiede di altri componenti esterni per elaborare l'in-formazione del sensore. Il costo del dispositivo è uno dei principali fattori per quanto riguarda la scelta Tra le due Tecnologie. Il sensore VS6724 appartiene al gruppo di sensori fabbricati con tecnologia CMOS, fabbricato da STMicroelectronics, scelto per le sue caratteristiche e le funzionalità.
Il quarto capitolo mostra una serie di esperimenti realizzati per quanti care le carat-teristiche e prestazioni del sensore come la linearità, il rapporto segnale rumore e le variazioni di luminosità in funzione delle impostazioni di guadagno e tempo di espo-sizione. Per eseguire gli esperimenti è stato necessario l'utilizzo di strumentazione digitale. I risultati di caratterizzazione del sensore permetteranno di ottimizzare lo strumento per Real Time PCR, contenendone i costi e massimizzandone le prestazioni.
Summary
The main starting point of this thesis has been understanding genomics i.e. the study of the genomes of organisms. Research in genomic studies has recently experienced rapid growth, and we can see more new tools created for studying genetics for continuing the research in an automatic manner.
Among the current areas of research, the study of comparative gene expression has become an important sector in which the basics of Polymerase Chain Reaction (PCR) are used. PCR involves ampli cation of genetic material through thermal processes. This procedure is followed by capillary or gel electrophoresis which is necessary to determine the speci c quantity of genetic material ampli ed in each PCR experiment.
Nowadays, there are two modern techniques that allow the measurement of quanti-ties of single mRNA: Real-Time PCR and Reverse Transcription-Polymerase chain reaction (RT-PCR). These techniques are used to quantify the presence of a specif-ic transcript inside a few nanoliters of the mix. For a highly sensitive test, RT-PCR is likely to be used even if instrumentation costs are high.
Real-Time PCR monitors the ampli cation of the target sequence inside the genetic material. Real time monitoring of the ampli cation of the target is accomplished by marking the sequence with a uorescent dye. As the target sequence is ampli ed the uorescent signal increases which is then detected by the sensor. Since there are uorescent markers which remain unattached to the target sequence, the presence of a quencher is required. The main function of the quencher is to absorb the photons emitted by the uorescent dye. Therefore, the overall uorescence emitted by the reaction solution is proportional to the amount of target sequence inside
the DNA. The uorescent signal doubles in each cycle of PCR. This characteristic permits the quanti cation of the initial concentration of target DNA by calculating the number of thermal cycles after a xed threshold value is surpassed.
STMicroelectronics is developing LabOnChip platforms for molecular analysis. They are investing eorts in a Real-Time PCR system which will simplify the analysis of various illnesses compared to instruments used in today's analyses. Specially trained employees are required for performing common Real-Time PCR tests, how-ever, specially trained employees. For the development of the new instrument are not required.
The thesis is developed within a Real-Time PCR instrument based on LabOnChip composed by: ARM micro-controlled based circuit in charge of thermal cycling, and CMOS optic sensor used for uorescent detection. The main objective is the analysis and characterization of uorescent detection CMOS sensor, produced by STMicroelectronics. The sensor is positioned inside a module that controls the camera parameters and LED luminance.
The thesis is divided in four parts:
The rst chapter explains two main techniques for molecular analysis, like PCR and Real-Time PCR. The two of them provide an initial phase of genetic material ampli cation produced by the polymerase chain reaction. A simple PCR is followed by analysis of biological sample using electro-phoretic procedure for detecting the presence of target DNA sequence. Using a uorescent detection sensor is possible to follow the actual ampli cation state within the cycles. The Real-Time PCR has changed the eld of molecular diagnosis. The technique's sensibility and the pos-sibility to use a non treated sample becomes useful for detecting genetic illnesses. There are many other applications of Real-Time PCR like the follow up of patients after a chirurgical session and paternity exam.
The second chapter oers a detailed description of Real-Time PCR instrument developed by STMicroelectronics. This process is done by a single chip called LabOnChip which response is measured by the optic sensor. The system has the following parts: LabOnChip, a control circuit, a mechanic component, a biological component, an illumination system, an optic lter and the optic sensor for detecting
uorescence. LabOnChip is a MEMS device made with a single silicon layer, the same used in semiconductors elaboration technique. The control circuit is made by four blocks: heating, cooling and temperature control circuits and a PC communication system. A small polymeric chamber has been made to place a silicon chip over it with the biological sample. The optic sensor allows the detection of uorescent signal produced after the end of every thermal cycle.
The third chapter shows two kinds of technologies used for optic sensors fabrication: CMOS and CCD. Although these are dierent technologies, both of them are used to measure luminance. The CCD saves energy produced by photons and requires a next step for representing this information in digital format. The CMOS sensor takes advantage of the fabrication technique for inserting inside the circuitry another functional blocks like: analog to digital converters, post-processing of the image and algorithms for image conversion. The cost is an important factor that guides the user's choice between the two technologies. The VS6724 sensor belongs to the CMOS technology. It's created by STMicroelectronics and due to the performances and special characteristics is the sensor chosen for detecting the luminance.
The fourth chapter shows the experiments done to get the quantitative character-istics of the optic sensor like the linearity, the signal to stress the relation and the changes of luminance as the function of gain and exposure time. It was necessary to use digital instrumentation in order to proceed with the experimentation. The results obtained by the experiments will be used to optimize the Real-Time PCR instrument.
INTRODUZIONE
Il recente e rapido sviluppo della genomica e della diagnostica molecolare e' es-tremamente promettente per le diverse applicazioni in diversi campi. Le scienze biologiche e biomediche, come l'oncologia, l'epidemiologia e la tassonomia, hanno introdotto con entusiasmo l'analisi del DNA e dell'RNA nei loro ambiti sperimentali. Conseguentemente è cresciuta la necessità di eettuare, anche sul campo, test molecolari come il sequenziamento del DNA, i saggi immunologici, le analisi di espressione genica per studi ambientali, medici, forensi. Le tipiche piattaforme cliniche attualmente utilizzate per realizzare tali test sono ancora ingombranti, ad alto consumo energetico, costo proibitivo e richiedono un numero elevato di reagen-ti, rendendole inadatte per queste applicazioni. L'utilizzo di tali strumentazioni e tecniche risulta particolarmente oneroso sia in termini di risorse umane (operatori specializzati) che temporali: per ottenere l'a dabilità richiesta è, infatti, spesso necessario che le analisi vengano ripetute diverse volte.
Gli sforzi compiuti recentemente in questo campo hanno portato allo sviluppo di soluzioni di tipo LabOnChip, dispositivi in grado di integrare funzioni, autom-atizzare reazione chimiche ed integrare sensori per la rilevazione delle molecole e specie target. In aggiunta alla riduzione della dimensione, dei costi e del consumo di energia, i LabOnChip possono incrementare notevolmente l'e cienza del sistema, contraendo i tempi e i costi di analisi e di lavoro. Tali tecnologie permettono analisi su volumi contenuti di campione; questa riduzione porta ad una diminuzione dei livelli di segnali biochimici generati, rendendo necessario concentrare gli sforzi nel miglioramento della sensibilità di rivelazione del segnale.
Capitolo 1
Tecniche di analisi nucleotidiche
1.1 Introduzione
La genomica è lo studio della struttura, del contenuto e dell'evoluzione dei genomi. I progressi tecnologici sono dovuti, da un lato, all'incremento signi cativo dell'infor-mazione derivante dal sequenziamento completo del genoma di numerosi organismi, dall'altro allo sviluppo di tecnologie innovative per sfruttare tale informazione. Le analisi sperimentali sono sempre più accompagnate dallo sviluppo di nuovi strumenti di indagine, sempre più veloci e sempre più e cienti.
Tra gli attuali loni di ricerca, occupa un ruolo rilevante lo studio dell'espressione genica di tipo comparativo; l'obbiettivo delle analisi è identi care, tra i diversi cam-pioni in esame, eventuali sottogruppi di geni che presentano dierenti espressioni geniche.
Tra le diverse tecnologie sviluppate per questo tipo di analisi, ha rivestito per molti anni un ruolo predominante la tecnica basata su una iniziale PCR (Polymerasi Chain Reaction) che comporta una ampli cazione del materiale genomico di interesse, seguita da una procedura di elettroforesi su gel o capillare, necessaria a determinare l'eventuale presenza nel campione biologico della sequenza nucleotidica di interesse. Negli ultimi anni, si è invece sviluppata una nuova tecnica di indagine de nita Real Time PCR, che consente di monitorare in tempo reale l'ampli cazione di una
sequenza bersaglio dal materiale genomico di partenza sfruttando una marcatura a emissione di uorescenza del campione biologico.
Nel presente capitolo vengono confrontate le tecniche di PCR e Real Time PCR che permettono di arrivare ad un analisi dei vantaggi e degli svantaggi introdotti da ognuno di queste tecniche.
1.2 Reazione a Catena della Polimerasi
La PCR è una tecnica di indagine genomica che consente la moltiplicazione di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. Mediante la reazione a catena della polimerasi è possibile ottenere in vitro una quantità di catene nucleotidiche su ciente per le successive applicazioni. Mediante elettroforesi su gel si valuta la presenza della sequenza nucleotidica di interesse.
1.2.1 I componenti della miscela di reazione
Gli elementi fondamentali alla reazione di PCR sono: Acqua (H2O) ultrapura e sterile DNA templato
È il DNA di partenza, che fa da stampo per la reazione di polimerizzazione; la sequenza nucleotidica di partenza può anche non contenere la sequenza target che si vuole ampli care. La natura e il grado di purezza del templato ne determinano la quantità minima richiesta.
L'unità di misura più corretta per quanti care il templato è la molarità, in quanto indica inequivocabilmente il numero iniziale di copie della sequenza target, che è un parametro fondamentale per valutare il risultato di una PCR. Quantità elevate di DNA templato facilitano il buon esito della PCR, ma aumentano la resa di prodotti non speci ci.
DNA - Polimerasi
È l'enzima che catalizza la reazione di polimerizzazione del DNA. La DNA polimerasi è un enzima che esiste in natura in ogni organismo; la replicazione cellulare di tut-ti gli esseri viventut-ti dipende dalla sua attut-tività, in quanto duplica accuratamente il DNA quando le cellule si dividono.
Una DNA polimerasi lega un lamento singolo di DNA e sintetizza il lamento complementare, procedendo in direzione 5'3'; ha bisogno di un innesco (primer) appaiato ad un singolo lamento di DNA, che fornisca un gruppo libero 3'OH necessario per l'inizio della sintesi.
I primers
Permettono la buona riuscita della PCR. Essi, infatti, devono potersi ibridare in maniera speci ca ed e ciente alla sequenza d'interesse, tralasciando quelle aspeci- che. I primers sono piccole sequenze nucleotidiche costituite da poche decine di basi in grado di legarsi alla singola elica di DNA stampo mediante un processo de nito annealing
1; in questo modo si ottiene l'innesco della la fase di polimerizzazione con il vantaggio di poter decidere quale segmento di DNA replicare.
La tipologia di primer da usare varia a seconda dello scopo della PCR.
Grazie alle banche dati ed alle pubblicazioni scienti che stanno diventando sempre più disponibili le sequenze di acidi nucleotidici necessarie per poter disegnare i primer da utilizzare nelle PCR.
Una concentrazione di primer troppo elevata potrebbe portare all'ampli cazione di sequenze non speci che, mentre, al contrario, una troppo scarsa presenza di primer rende la PCR ine cace.
1Il termine è entrato nel gergo tecnico di laboratorio per indicare l'appaiamento di un primer
o di una sonda di DNA ad una catena a singola elica di DNA durante una reazione a catena della polimerasi.
Deossiribonucleotidi trifosfati (dNTPs)
Sono i monomeri che servono per la polimerizzazione del DNA; vengono idrolizza-ti dalla DNA polimerasi a dNMP (deossiribonucleoidrolizza-tide monofosfato), incorporato nella catena di DNA nascente, e PPi (pirofosfato), il by-product della reazione di sintesi del DNA. Sono 4 diverse molecole: dATP, dCTP, dGTP e dTTP. Tipi-camente, ognuno dei 4 dNTPs è presente a una concentrazione di 20-200 µM; tale concentrazione è scelta in funzione della lunghezza dell'ampli cato e del nu-mero di cicli. È importante che tutti e quattro i dNTPs siano presenti in uguale quantità, poiché altrimenti aumentano sensibilmente gli errori di incorporazione da parte della DNA polimerasi, così come quando i dNTPs sono presenti in concen-trazione eccessiva. Inoltre, come i primers, i dNTPs non devono nemmeno essere mai limitanti, altrimenti l'e cienza di reazione ne risentirebbe.
Il magnesio
La concentrazione di magnesio è senza dubbio il fattore più critico di tutta la PCR. Questo parametro deve essere fatto oggetto d'una attenta procedura d'ottimiz-zazione in quanto può variare anche se si utilizzano diversi primer per ampli care una medesima regione di DNA. La presenza di magnesio condiziona l'attività della polimerasi, l'ibridizzazione dei primer ed aumenta la temperatura cui il DNA stam-po si denatura. Per allestire una PCR, di conseguenza, è bene allestire diverse miscele di reazione contenenti quantità progressivamente scalari di magnesio che varino da un minimo di 0.05 mM ad un massimo di 5 mM (il più delle volte si utilizza magnesio 1,5 mM).
Tampone
La soluzione tampone ha il compito di mantenere il pH del campione biologico ad un valore ottimale per l'attività enzimatica della polimerasi. Tipicamente si usa un tampone Tris-HCl 10-50 mM, con un pH compreso tra 8.3 e 9 a 25°C.
Cloruro di Potassio (KCl)
Dà la forza ionica necessaria alla soluzione, facilita l'annealing dei primers e au-menta l'emivita della Taq polimerasi. La concentrazione di KCl non deve superare 50 mM, altrimenti comincia ad inibire la Taq
1.2.2 Meccanismo di funzionamento
All'interno di una cellula in divisione, la replicazione del DNA coinvolge una serie di reazioni mediate da molti enzimi, il cui risultato nale è una copia fedele dell'in-tero genoma. Durante la PCR, invece, un solo enzima è fondamentale, cioè una DNA polimerasi. Il meccanismo della PCR permette di ampli care in provetta so-lamente una porzione speci ca e determinata dell'insieme di acidi nucleici presenti nel campione. La speci cità è consentita dalla presenza nella miscela di reazione di una coppia di primers: si tratta di corti frammenti di DNA (oligonucleotidi), lunghi in media 20-30 nucleotidi, disegnati in modo da essere complementari alle sequenze che si trovano alle due estremità della regione target da ampli care. Un primer (forward) è complementare a uno dei due lamenti di DNA, in corrispon-denza dell'inizio della regione target; l'altro primer (reverse) è complementare alla sequenza, sul lamento opposto, che si trova alla ne del frammento target ().
Figura 1.1: Gli stadi della PCR
Per eettuare una PCR, si mescolano in una provetta una soluzione acquosa tam-ponata, una piccola quantità di DNA templato (stampo), l'enzima DNA polimerasi,
la coppia di primers e i quattro deossiribonucleotidi trifosfati. Successivamente, la provetta viene posta all'interno di uno strumento apposito, chiamato termocicla-tore (Figura 1.2), che fa variare la temperatura all'interno della miscela di reazione in modo preciso e ciclico.
Figura 1.2: Termociclatore
In particolare, ogni ciclo di PCR si compone di tre fasi, ognuna a una diversa temperatura: la denaturazione, l'appaiamento e l'estensione (Figura 1.3).
1. Denaturazione: la miscela di reazione viene portata a 94-96°C per 30 secondi-1 minuto. Il calore rompe i deboli legami idrogeno che tengono insieme le due eliche complementari di DNA, le quali dunque si aprono.
2. Appaiamento (annealing): la soluzione viene rareddata a 50-60°C (a secon-da della sequenza dei primers e del DNA target) per 30 secondi - 1 minuto.
A queste temperature i due primers possono appaiarsi ai singoli lamen-ti di DNA, attraverso la formazione di legami idrogeno, in corrispondenza delle sequenze a loro complementari e vanno così a delimitare la regione da ampli care.
3. Estensione (polimerizzazione): la miscela viene portata a 70-75°C per 40 secondi-qualche minuto. La DNA polimerasi si lega al gruppo ossidrile (OH) libero all'estremità 3' dei primers appaiati; dopodiché, l'enzima comincia ad allungare i primers, incorporando i nucleotidi complementari a quelli sul lamento stampo. Si ottiene così la sintesi, o polimerizzazione, del DNA target.
All'inizio di un protocollo di PCR si eettua una denaturazione iniziale (3-10 minuti a 94-96°C), per assicurare una completa denaturazione del lungo e com-plesso DNA templato di partenza; al termine dei cicli termici, tipicamente si ef-fettua un'estensione nale (3-15 minuti a 72°C), per completare tutti i prodotti neosintetizzati.
Figura 1.3: Principio di funzionamento della PCR
1.2.3 E cienza di reazione
In linea teorica ogni ciclo dovrebbe raddoppiare la quantità di DNA; ciò, tuttavia, non si realizza. Per avere una stima su cientemente attendibile del numero di lamenti di DNA ottenuti dopo n cicli si può ricorrere alla formula:
Yn= A · (1 + E)n
dove:
A= quantità iniziale di DNA presente n= numero di cicli di PCR eettuati
E= e cienza dell'ampli cazione (in genere compresa tra 0,7 e 0,8) L'andamento della PCR nel tempo presenta quattro fasi (Figura 1.4):
All'inizio, la quantità di DNA sembra rimanere a un livello di background, ma è perché si è sotto la soglia di sensibilità di questo sistema di rilevazione.
1. Fase esponenziale. Dopo alcuni cicli, si comincia ad osservare un aumento esponenziale del prodotto, che corrisponde a quanto atteso, in base al mec-canismo della PCR; ciò grazie al fatto che i reagenti sono ancora freschi e tutti disponibili. In questa fase, l'ampli cazione è molto speci ca e precisa. 2. Fase lineare. Dopo un'ampli cazione esponenziale, si entra in una fase in
cui la quantità di prodotto aumenta linearmente. Ciò è dovuto al fatto che qualcuno dei reagenti inizia ad essere limitante e/o la DNA polimerasi comincia a perdere la propria attività. Questa fase è caratterizzata da un'el-evata variabilità nella resa di ampli cazione, anche tra esperimenti replicati a confronto.
3. Plateau. Negli ultimi cicli, quando il prodotto comincia ad essere presente a concentrazione piuttosto elevata (0.3-1 nM), la reazione raggiunge un plateau: non si produce più ulteriore prodotto e se la miscela viene lasciata ad incubare per parecchio tempo, i prodotti cominciano a degradarsi. Il raggiungimento del plateau è molto variabile per ogni campione e può essere dovuto a diversi motivi:
degradazione di alcuni reagenti: DNA polimerasi o dNTPs, a causa delle alte temperature.
esaurimento di alcuni reagenti: primers, nel caso di prodotti corti, o dNTPs, nel caso di prodotti lunghi.
inibizione da prodotto nale: la reazione di polimerizzazione del DNA prevede la formazione di pirofosfato (PPi) come prodotto di scarto. L'idrolisi di questo legame ad alta energia è necessaria per far procedere la reazione di polimerizzazione. La reazione opposta alla polimerizzazione del DNA è la pirofosforolisi; verso la ne della PCR, quando il rapporto tra PPi e dNTPs è in netto favore di PPi, comincia ad avvenire anche la pirofosforolisi (che comunque è molto più lenta della polimerizzazione).
competizione per i reagenti da parte di prodotti non speci ci.
competizione per il legame coi primers da parte dei prodotti, poiché questi sono ora presenti in concentrazione molto elevata ( no a 10nM); dunque, i prodotti ss iniziano a fare preferenzialmente re-annealing, piuttosto che appaiarsi coi primers.
Dunque, l'end-point detection su gel viene fatta quando la reazione è in fase di plateau; per questa ragione, l'intensità della banda osservata su gel non è neces-sariamente correlata con la quantità iniziale di DNA target presente nel campione analizzato.
Figura 1.4: Fasi della PCR
1.2.4 Rivelazione del DNA ampli cato
Al termine di una PCR, un'aliquota della miscela di reazione viene caricata in un pozzetto di un gel di agarosio, che viene poi sottoposto ad elettroforesi (Figura
1.5), per determinare se l'ampli cazione desiderata sia eettivamente avvenuta. Infatti, nel gel o nel tampone di corsa è presente una sostanza che si intercala al DNA, emettendo uorescenza (tipicamente è il bromuro d'etidio, EtBr, che viene eccitato dagli UV ed emette nel visibile); dunque, i frammenti ampli cati possono essere visualizzati ad occhio nudo su gel come bande (Figura 1.6), poiché la PCR genera grandi quantità di prodotto, nell'ordine dei µg. Inoltre, facendo correre in contemporanea sullo stesso gel una miscela di frammenti di DNA di riferimento con dimensioni note, si possono valutare anche la correttezza dell'ampli cazione, in base alla dimensione in paia di basi (base pairs, bp) della banda d'interesse, e la speci cità dell'ampli cazione, in base alla presenza di una sola banda con la dimensione attesa.
Infatti, la mobilità elettroforetica di una molecola di DNA double-stranded (ds, os-sia a doppio lamento) lineare è inversamente proporzionale al log10delle dimensioni in bp.
Figura 1.5: Apparato di elettroforesi
Se durante una PCR si prelevano aliquote della miscela di reazione a vari cicli, le si sottopongono ad elettroforesi su gel e poi si eettua un'analisi densitometrica delle bande ottenute, si può avere un'idea della cinetica reale di reazione.
Figura 1.6: Immagine di una corsa elettroforetica
1.2.5 Applicazioni
La PCR viene utilizzata in tutte quelle situazioni in cui bisogna ampli care un quantitativo di DNA no a livelli utili per analisi successive. I campi di appli-cazione sono enormi. La tecnica viene sfruttata, per esempio, in medicina per la diagnostica microbiologica o per l'evidenziazione di cellule tumorali, in tumori liquidi, quando esse sono troppo poche per essere evidenziate da altre metodiche. Estremamente utile è l'uso della PCR in medicina legale. In biologia la PCR viene usata per le analisi di paleontologia e di antropologia molecolare ed in numerosi campi dell'ingegneria genetica. Fondamentale è poi il suo utilizzo per lo studio del genoma di organismi non coltivabili, quali numerosi batteri e protisti, e per lo studio di popolazioni in ecologia. Le diverse gradazioni di speci cità dei primer integrate alla diversa e cienza con cui essi si legano all'ampli cato a seconda della temperatura garantiscono a questa tecnica una straordinaria essibilità per studi a tutti i diversi livelli tassonomici.
1.3 La Real-Time PCR
1.3.1 Introduzione
La PCR real-time, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-PCR), è un metodo di ampli cazione e quanti cazione simultanee del DNA.
Il DNA è ampli cato da reazioni a catena della DNA-polimerasi. Dopo ogni fase di ampli cazione, il DNA è quanti cato. I metodi comuni di quanti cazione includono l'uso delle colorazioni uorescenti che intercalano con il DNA doppio- lamento(ds) e gli oligonucleotidi modi cati del DNA (denominati sonde) che sono uorescenti una volta ibridati con un DNA.
Spesso la PCR real-time è combinata con la PCR Retro Trascrizionale (RT-PCR) per quanti care i livelli di espressione di speci ci RNA: la retro-trascrizione (o trascrizione inversa) produce del DNA complementare a singolo lamento detto cDNA (complementary DNA) mantenendo inalterati i rapporti relativi di concen-trazione delle diverse specie degli RNA. In questo modo è possibile, ad esempio, misurare l'espressione relativa di un gene ad un tempo particolare, o in una cellula o in un tipo particolare di tessuto. La combinazione di queste due tecniche è spesso denominata RT-PCR quantitativa.
1.3.2 Marcatura del DNA
Esistono due tecniche principali di marcatura a uorescenza del DNA (Figura 1.7). La prima sfrutta dei coloranti che si intercalano alla doppia elica di DNA, come il SYBR Green, la seconda sfrutta il fenomeno del trasferimento di energia per risonanza dovuta a uorescenza (FRET) come la sonda TaqMan.
Figura 1.7: Molecola uorescente SYBR Green
Il SYBR Green è un agente intercalante e si lega preferenzialmente a DNA a doppio lamento (dsDNA). Il complesso DNA-colorante assorbe luce blu ad una lunghezza d'onda λmax = 488 nm ed emette luce verde λmax = 522 nm.
Emette segnale di uorescenza solo se intercalata alla molecola di DNA. Ques-ta caratteristica permette di ottenere un segnale di uorescenza proporzionale al numero di doppie eliche all'interno del campione biologico. In funzione dell'in-tensità di uorescenza è quindi possibile conoscere il numero di molecole di DNA ampli cate dalla polimerasi.
Tuttavia queste molecole si legano in modo non speci co a tutte le doppie eliche presenti in soluzione, anche ad eventuali primers inattivi e complementari che si sono tra loro appaiati o ad eventuali sequenze non speci che ampli cate. Nonos-tante questi limiti, la semplicità e i costi contenuti rendono tale metodica ampia-mente utilizzata nei laboratori di analisi.
SYBR Green viene utilizzato sempre più spesso come alternativa al meno costoso bromuro di etidio. Infatti il bromuro è un potente mutageno mentre, u cialmente, il SYBR Green viene indicato come non pericoloso, sebbene deve essere maneggiato con cura a causa di legarsi al DNA con elevata a nità.
Sonde TaqMan
Si tratta di un oligonucleotide (Figura 1.8) che contiene in 5' un marcatore uores-cente e in 3' un quencer (un gruppo colorante in grado di mascherare l'emissione luminosa). Il quencer, inoltre, non è in grado di innescare la sintesi di nuovo DNA. Quando colpita dalla luce, la molecola uorescente in 5' trasferisce ener-gia al quencer, il quale, grazie alle sue proprietà mascheranti determina una inibizione della uorescenza del substrato. Le sonde Taqman sono disegnate in modo che si leghino ad una regione interna di un prodotto di PCR. Durante la PCR, la Taq polimerasi scalza la sonda, il che determina una separazione della molecola uorescente dal quencer, con una conseguente emissione di uorescenza.
Figura 1.8: Sonda Taqman
1.3.3 La Fluorescenza
La uorescenza è il risultato di un processo sico composto da tre stadi successivi che avviene in certe molecole (generalmente idrocarburi policiclici o eterocicli), chiamati uorofori o uorocromi. Una sonda uorescente non è altro che un uoroforo espressamente progettato o per localizzarsi entro una speci ca regione di un campione biologico, o per rispondere ad uno speci co stimolo biologico, o entrambe le cose.
Il processo responsabile della uorescenza dei uorofori può essere illustrato da un semplicissimo diagramma energetico chiamato diagramma di Jablonski (Figura 1.9). A causa della dissipazione di energia che avviene durante la permanenza del
uoroforo nello stato eccitato, l'energia del fotone emesso è minore di quella del fotone assorbito, e, di conseguenza, la lunghezza d'onda della luce di uorescenza è più grande di quella della luce di eccitazione. Uno schema estremamente sem-plice come il diagramma di Jablonski potrebbe, in realtà, essere valido solamente se riferito ad un singolo atomo, mentre i uorofori sono generalmente molecole poliatomiche.
Figura 1.9: Diagramma di Jablonsky sempli cato
La dierenza fra l'energia del fotone di eccitazione e quella del fotone di emissione, o, analogamente, la dierenza fra la lunghezza d'onda del picco di emissione e quel-la del picco di assorbimento, è una delle proprietà fondamentali che caratterizzano un uoroforo, e viene de nita Stokes shift
Un'altra importante conseguenza di quei processi che fanno perdere energia al uo-roforo allo stato eccitato, è che alcuni degli elettroni che hanno assorbito un fotone ritornano direttamente allo stato fondamentale attraverso processi non radiativi, senza cioè emettere luce di uorescenza.
Fenomeni di questo tipo, come ad esempio collisioni con altre molecole, portano quindi ad uno spopolamento dello stato eccitato. Una misura del peso relativo di questi processi è dato da un altro dei parametri fondamentali della uorescenza che è il rapporto fra il numero dei fotoni di uorescenza emessi Nem ed il numero di fotoni assorbiti Nab. Questo parametro, che è evidentemente un numero sempre minore di uno, si chiama guadagno quantico.
Qy= NEM NAB
I uorofori possono avere valori del guadagno quantico compresi fra 0.1 e poco meno di 1, ma per le applicazioni di carattere biologico vengono usate in pratica solamente molecole che abbiano un valore di guadagno quantico di almeno 0.4 -0.5.
Un altro aspetto fondamentale del processo di uorescenza consiste nella sua ci-clicità. A meno che il uoroforo non sia irreversibilmente deteriorato quando si trova allo stato eccitato lo stesso uoroforo può essere ripetutamente eccitato, e ogni volta riemettere fotoni di uorescenza.
In condizioni di forte intensità della luce di stimolazione, la distruzione irreversibile del uoroforo eccitato (photobleaching) diventa il fattore limitante per la rive-lazione della uorescenza. Il rimedio più e cace contro il photobleaching è quello di massimizzare la sensibilità del sistema di rivelazione, consentendo così la riduzione della potenza della sorgente della luce di eccitazione. E' opportuno, a questo scopo, utilizzare come rivelatori strumenti come fotomoltiplicatori e telecamere intensi cate, servirsi di obiettivi ad alta apertura numerica e ltri di sbarramento con banda passante più larga possibile, compatibilmente con le esigenze di sep-arazione dei segnali da rivelare. Alternativamente, poiché la predisposizione al photobleaching varia da uoroforo a uoroforo, la scelta deve cadere su uorofori meno fotolabili.
1.3.4 Ciclo soglia e quantità iniziale di DNA
I coloranti e le sonde utilizzate per marcare le molecole di DNA appartengono alla famiglia dei uorofori, molecole che, eccitate ad una speci ca lunghezza d'on-da, emettono radiazione luminosa ad una lunghezza d'onda maggiore di quella di eccitazione.
Per rilevare il segnale di uorescenza, la cui intensità è proporzionale alla quantità di DNA presente nel campione, è necessario utilizzare un sistema ottico in grado
sia di inviare un segnale di eccitazione, la cui lunghezza d'onda è funzione del tipo di uoroforo utilizzato, sia di garantire la detection del segnale di uorescenza proveniente dai uorofori.
La sorgente di eccitazione genera un segnale ad una speci ca lunghezza d'onda funzione del tipo di uoroforo impiegato per marcare il DNA; le sorgenti sono gen-eralmente laser, in grado di generare un segnale luminoso monocromatico, oppure lampade policromatiche: in questo caso è necessario l'utilizzo di ltri ottici per selezionare la lunghezza d'onda desiderata. Il fascio luminoso prodotto incontra un divisore di fascio che devia verso il campione biologico solo il fascio luminoso caratterizzato da una speci ca lunghezza d'onda, mentre viene attraversato dalle altre componenti. Il segnale di uorescenza, emesso dal uoroforo in seguito al-l'eccitazione, viene in ne raccolto da opportuni sensori generalmente costituiti da camere a tecnologia CCD o CMOS.
La quanti cazione accurata e riproducibile tramite real-time PCR è basata sul concetto di ciclo soglia (Threshold Cycle, CT). I valori di uorescenza vengono misurati ad ogni ciclo e rappresentano la quantità di prodotto ampli cato no a quel momento (Figura 1.10). Più templato è presente all'inizio della reazione, meno cicli saranno necessari a nché il segnale di uorescenza raggiunga un certo livello: il ciclo a cui ciò avviene è il CT. Il valore soglia di uorescenza viene scelto arbitrariamente: esso deve rappresentare un valore statisticamente signi cativo al di sopra del background che si ha ai primi cicli, quando il segnale è inferiore al limite di sensibilità dello strumento; dunque, il valore soglia è scelto in base alla deviazione standard media della uorescenza normalizzata nei primi cicli, che viene moltiplicata per un fattore intero aggiustabile (di solito, 2 o 3). Per una precisa quanti cazione è fondamentale che, col valore soglia scelto, tutti i campioni da analizzare abbiano un CT all'interno della fase esponenziale dell'ampli cazione. Il segnale del reporter2 viene normalizzato rispetto alla uorescenza di un altro uoroforo presente in soluzione, che fa da riferimento interno passivo, cioè che non partecipa alla reazione di ampli cazione. Ciò serve per correggere le uttuazioni della uorescenza non dovute alla PCR, tra i campioni a confronto.
Figura 1.10: Risultato della Real-Time PCR
Nel gra co di una real-time PCR si osserva l'andamento della uorescenza del reporter in funzione del numero di cicli di ampli cazione. Di solito, la uorescenza viene riportata come ∆Rn, che equivale a:
∆Rn= R+n − R−n
R+nè la uorescenza normalizzata del reporter per una reazione che contiene tutti i componenti.
R−n è invece il segnale normalizzato di un campione in cui non avviene un'ampli -cazione rilevabile; questo valore può essere ottenuto dai primi cicli di una real-time PCR (quando si osserva ancora un segnale di background) oppure da una miscela di reazione che non contiene il templato (ossia un controllo negativo).
∆Rn rappresenta la vera quantità di segnale generata da determinate condizioni di PCR.
Si riporta dunque un valore di CT per ogni campione; questo valore viene poi trasformato nel vero dato quantitativo, relativo o assoluto (Figura 1.11).
Figura 1.11: Rapporto fra numero di cicli termici CT e il logaritmo della concentrazione iniziale
1.3.5 Applicazioni
Di seguito si presentano le più importanti applicazioni della tecnologia descritta: Determinazione del numero di copie di DNA e RNA (Sybr Green, TaqMan)
.
Analisi delle Mutazioni (TaqMan, Sonde d'ibridazione) .
Misura della variazione di espressione genica (Sybr Green, TaqMan). Ruolo centrale nella diagnostica e nella ricerca genetica.
Analisi dell'e cacia di una particolare terapia. Musura del danneggiamento del DNA.
1.4 PCR vs Real-Time PCR
La PCR e la Real-Time PCR sono due tecniche che presentano vantaggi e svan-taggi. L'utilizzo di una tecnica piuttosto che l'altra dipende da tanti fattori, come quella economica, o il tempo che si impiega per avere dei risultati a dabili.
In Tabella 1.1 e Tabella 1.2 sono riportati i vantaggi e gli svantaggi delle due tecniche analizzate.
PCR
Vantaggi Svantaggi
Velocità e facilità d'uso, in poche ore si possono ottenere millioni di copie della sequenza di DNA
Richiede l'analisi elettroforetica dei prodotti di ampli cazione
Sensibilità, virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una singola cellula come template
Non consente la quanti cazione del DNA bersaglio di partenza
Robustezza. Ampli cazione possibile
anche utilizzando DNA di bassa qualità Tecnica complessa e richiede dicompetenze specialistiche. Consente di fare diagnosi certa perché
individua il DNA o RNA del patogeno Costi elevati per la strumentazione Tempi di risposta rapidi La presenza di DNA/RNA non implica a
vitalità del microorganismo Individuazione di diversi patogeni
contemporaneamente Rispetto alla sierologia non consente dirilevare un contatto progresso Tabella 1.1: Vantaggi e svantaggi della PCR
Real Time PCR
Vantaggi Svantaggi
La metodica a sistema chiuso diminuisce le possibilità di contaminazioni
carry-over.
Richiede una elevata conoscenza tecnica Consente un notevole risparmio di
tempo con una diagnosi molto accurata e sensibile.
Alti costi per la strumentazione Le analisi di melting consentono una
rapida genotipazzione e l'identi cazione di mutazioni di resistenza
Non è quantitativa a meno di non usare particolari accorgimenti
Riduce il tempo richiesto per il referto
Turn-Around-Time Non è adatto per multiplexing Tabella 1.2: Vantaggi e svantaggi della Real-Time PCR
Capitolo 2
Sistema di Real-Time PCR
basato su lab-on-chip
2.1 Introduzione
Lab-on-a-chip (LOC) è un dispositivo che integra funzioni multiple che si possono svolgere in laboratorio in un singolo chip che va da pochi millimetri a qualche centimetro quadrato di grandezza ed è capace di trattare volumi di uidi estrema-mente piccoli, inferiore ai picolitri. I dispositivi Lab-on-a-chip sono un sottogruppo dei dispositivi MEMS (dall'inglese Micro Electro Mechanical Systems) e spesso indicati anche come Micro Total Analysis Systems (µTAS). Tuttavia, con il ter-mine "Lab-on-a-Chip" si indica generalmente la misurazione di un singolo o un multiplo processo di laboratorio con un semplice chip, mentre "µTAS" si dedica all'integrazione di tutte le sequenze di processi di laboratorio per eettuare analisi chimiche.
Il punto di partenza per la maggior parte dei processi di fabbricazione dei LOC è la litogra a. Inizialmente la maggior parte dei processi erano in silicio, dato che queste tecnologie, ben sviluppate, erano direttamente derivate dalla fabbri-cazione dei semiconduttori. Data la richiesta di caratteristiche ottiche speci che, biocompatibili o chimico compatibili, minori costi di produzione e più veloce fase di prototipazione, nuovi processi sono stati sviluppati come incisione del vetro,
ceramica e metallo, deposition e bonding, processi PDMS (polidimetilsilossano), thick- lm e stereolitogra a allo stesso modo di metodi di replicazione veloce via electroplating, injection molding (formatura) e embossing (stampaggio). Per di più il campo dei LOC supera sempre più i con ni tra la tecnologia dei microsistemi basati sulla litogra a, nanotecnologia e ingegneria di precisione.
2.2 Il lab-on-chip
Il dispositivo (Figura 2.1), progettato e realizzato da STMicroelectronics, consente di integrare in un unico chip in silicio le fasi di ciclatura termica, necessarie alla reazione a catena della polimerasi, e le successive operazioni di ibridazione e de-tezione delle catene nucleotidiche. Esso è costituito da tre parti: il chip in silicio, lo strato adesivo,la cameretta per la reazione.
Figura 2.1: Lab-on-chip Il chip
Il chip è realizzato in silicio, materiale particolarmente adatto per la realizzazione dei cicli termici: infatti è caratterizzato da eccellenti proprietà termiche, che con-sentono un rapido trasferimento di calore alla miscela di reazione con cui è a contatto e un'ottima uniformità di temperatura all'interno della miscela stessa. Inoltre, il silicio rende possibile la combinazione di elementi meccanici, elettronici e uidici, miniaturizzati e integrati nello stesso supporto. Poiché le tecniche di
produzione del lab-on-chip sono simili a quelle utilizzate per i circuiti integrati, è possibile utilizzare tutto il know-how e le linee di produzione preesistenti. Il chip è un substrato di silicio avente uno spessore di 675 µm e dimensioni 17.5 Ö 12 mm; esso si compone di due parti:
Parte inferiore: E' lo strato del chip in cui sono integrati il riscaldatore ed il sensore di temperatura (Figura 2.2), necessari rispettivamente per il riscaldamento ed il controllo della temperatura del chip durante le fasi della PCR. Il riscaldatore è una semplice resistenza metallica in alluminio, all'interno della quale viene forzato il passaggio di corrente: l'aumento di temperatura della resistenza determina la generazione, per eetto Joule, di un'elevata quantità di energia termica, che viene dissipata nel chip e nella miscela di reazione. Il sensore di temperatura (Resistance Temperature Detector, RTD) è anch'esso una resistenza che sfrutta la variazione di resistività del silicio al variare della temperatura come metodo di funzionamen-to. In particolare, per i metalli esiste una relazione lineare che lega resistività e temperatura:
ρ (T ) = ρ0· (1 + α · (T − T0))
dove: T è la temperatura espressa in gradi Kelvin (K), ρ(T) è la resistività del materiale alla temperatura T , ρ0 è la resistività del materiale alla temperatura T0 e α un coe ciente che dipende dal materiale. Sfruttando la relazione che lega resistenza e resistività mediante la sezione S e la lunghezza L del conduttore, si ottiene una relazione che permette di ricavare la temperatura (T ) da una semplice misura di resistenza (R).
R= ρ · L · S
R(T ) = R0· (1 + α · (T − T0))
Tuttavia, questa relazione è valida solo per stabilire la temperatura nelle imme-diate vicinanze del sensore, cioè all'interno del chip di silicio. Ciò implica che la
temperatura all'interno della miscela di reazione sia leggermente dierente rispetto alla temperatura nelle immediate vicinanze del sensore, nonostante il silicio goda di ottime proprietà termiche. Per questo motivo, è necessario tarare il dispositivo e quindi il sensore di temperatura, in modo da calcolare gli esatti coe cienti e avere così una misura accurata della temperatura reale all'interno della miscela di reazione.
Le terminazioni del riscaldatore e del sensore raggiungono dei pads sulla supercie dello strato del chip: essi sono messi in collegamento con la scheda di controllo mediante un'apposita contattiera.
Parte superiore: E' il retro del substrato di silicio sulla cui super cie viene alloggiata la miscela di reazione. Poiché il silicio può inibire la PCR, le super cie di questo strato vengono ricoperte con diossido di silicio SiO2; esso diminuisce l'inibizione sulla PCR e aumenta l'idrolicità della super cie, favorendo il posizionamento della miscela.
Per ottenere uno strato di SiO2, si deposita sul silicio un vapore di tetra-etil-orto-silicato (TEOS), che viene poi idrolizzato col calore a etanolo e SiO2.
Figura 2.2: Parte inferiore del chip - STMicroelectronics La cameretta di reazione
Al ne di poter eettuare una reazione di Real-Time PCR è stato necessario realiz-zare delle camerette di reazione da posizionare sopra il chip in modo da contenere la soluzione biologica.
La cameretta di reazione sono realizzati in policarbonato che garantisce una buona biocompatibilità e vengono incollate sul chip in silicio mediante PDMS (silicone neutro).
Esistono 3 con gurazioni: 6 (Figura 2.5), 9 (Figura 2.4) e 12 (Figura 2.3) pozzetti che possono contenere da 2 a 15µldi mixdi reazione a seconda del protocollo chimico da eseguire.
Figura 2.3: Cameretta da 12 pozzetti
Figura 2.4: Cameretta da 9 pozzetti
Lo strato adesivo
La cameretta di reazione viene fatta aderire alla super cie superiore del chip me-diante un'apposito strato adesivo. Attualmente viene utilizzato come collante il PDMS (poli-dimetil-sillosano), comunemente noto come silicone, per le sue buone caratteristiche di biocompatibilità con la reazione di real-time PCR, per la sua resistenza alle alte temperature e per la sua idrofobicità. L'unico svantaggio nel-l'utilizzo del silicone è che il processo di incollaggio è poco meccanizzabile ed automatizzabile; attualmente il PDMS viene depositato sulla super cie del chip manualmente. Ciò in uisce sia sui tempi di realizzazione del singolo chip, che si allungano, sia sulle prestazioni nali dello stato adesivo, che viene deposto in modo poco ripetibile.
2.3 La scheda di controllo
La real-time PCR richiede che, all'interno della camera di reazione, si realizzino cicli termici caratterizzati da precisi valori di durata temporale e di temperatura, e che l'accensione della sorgente di eccitazione avvenga in un istante preciso alla ne della fase di estensione di estensione. Per questo motivo, si è progettato e realizzato una scheda di controllo, che costituisce il cuore del sistema e che possiede dimensioni molto ridotte (5 Ö 4 cm) (Figura 2.6).
In essa è presente un microcontrollore STM32F103, che controlla le fasi di riscal-damento e raredriscal-damento, il campionamento dei sensori di temperatura e l'ac-censione e lo spegnimento della sorgente di eccitazione (LED). Il microcontrollore realizza ciò mediante tre segnali a modulazione di larghezza d'impulso (Pulse-Width Modulation, PWM). Il PWM è un segnale ad onda quadra che può assumere uni-camente due livelli logici: nel caso del microcontrollore STM32F103, esso può assumere un valore pari a 0 V per il livello logico basso e pari a 3.3 V per quello alto.
Il grande vantaggio del segnale PWM è dato dalla possibilità di poter modulare i tempi in cui il segnale assume valori logici alti e bassi. Impostando opportuni valori a particolari registri del microcontrollore, il segnale viene diviso in intervalli temporali di durata ben precisa; all'interno di ogni intervallo è possibile impostare il duty-cycle del segnale, cioè la frazione del periodo dell'onda quadra durante la quale il segnale resta ad un valore logico alto. Complessivamente l'intero sistema è composto da 5 blocchi:
circuito di riscaldamento:
Il circuito di riscaldamento serve per aumentare la temperatura all'interno della camera di reazione; è caratterizzato da due elementi:
Il riscaldatore, situato all'interno del chip, che ha il compito di trasformare la potenza elettrica fornita in potenza termica;
il circuito di pilotaggio della corrente: esso comprende un MOSFET (Metal-Oxide-Semiconductor Field-Efect Transistor), utilizzato come interruttore di corrente, e un segnale PWM in uscita dal microcontrollore, che pilota l'apertura o la chiusura del canale del MOSFET.
La funzione del MOSFET nel circuito di riscaldamento è quella di comportarsi come un interruttore di corrente: in funzione della tensione applicata al gate del MOSFET, direttamente correlata al segnale digitale PWM in uscita dal microcon-trollore, è possibile determinare l'apertura o la chiusura del canale del MOSFET e, di conseguenza, permettere o impedire il passaggio di corrente attraverso il
riscaldatore. La tensione da applicare al gate del MOSFET per determinare l'aper-tura del suo canale deve essere uguale o maggiore della tensione di soglia. In risposta ad un valore logico alto del segnale PWM in uscita dal microcontrollore, si applica al gate del MOSFET la tensione su ciente per ottenere l'apertura del canale; al contrario, in risposta a valori di PWM corrispondenti ad un livello logico basso, il canale rimane chiuso.
circuito di rareddamento
Per velocizzare la fase di diminuzione della temperatura, è stato implementato un circuito di rareddamento della camera di reazione, caratterizzato dalla presenza di una piccola ventola assiale. Il sistema di attivazione della ventola è del tutto simile a quello realizzato per modulare la corrente attraverso i riscaldatori, nel circuito di riscaldamento: si utilizza dunque un secondo segnale PWM in uscita dal microcontrollore ed un secondo MOSFET.
circuito di controllo della temperatura
La necessità di garantire un buon monitoraggio della temperatura raggiunta du-rante le varie fasi di una PCR richiede la presenza nel lab-on-chip di un sensore di temperatura e di un convertitore analogico-digitale (Analog to Digital Converter, ADC) adibito al suo campionamento.
Dal segnale digitale in uscita dal microcontrollore, è possibile risalire al valore analogico di tensione presente ai capi del sensore di temperatura e che entra nell'ADC.
circuito di pilotaggio del LED;
Il circuito di controllo del LED gestisce l'accensione del LED quando la reazione della polimerasi si trova alla ne della fase di estensione, circa 3 secondi prima del termine della stessa. Il sistema di attivazione del LED è molto simile a quello utilizzato per modulare la corrente nei riscaldatori attraverso il circuito di riscal-damento. Questo signi ca perciò utilizzare un terzo segnale PWM in uscita dal microcontrollore e un terzo MOSFET.
sistema di comunicazione verso personal computer.
La necessità di comunicazione tra utente e microcontrollore ha richiesto l'imple-mentazione di un protocollo di comunicazione, per l'invio e la ricezione di dati e comandi. L'elasticità che contraddistingue tale protocollo consente di poter inviare al microcontrollore sia comandi relativi all'inizializzazione delle periferiche utiliz-zate, come ad esempio l'ADC, sia i parametri riguardanti alcune funzionalità del microcontrollore, come ad esempio il duty-cycle del segnale PWM. Tramite un software intuitivo, una Graphical User Interface (GUI) sviluppata in linguaggio C, l'utente può facilmente impostare la durata e le temperature dei cicli termici di PCR, salvare e richiamare dei protocolli termici e osservare in tempo reale i dati in uscita dal sistema, come la temperatura. Il protocollo di comunicazione implemen-tato si appoggia sull'interfaccia USB utilizzando la Virtual-Com per comunicare, in modo da garantire un'ottima velocità di trasferimento dei dati e la compatibilità con tutti i personal computer attualmente in commercio.
2.4 La componente meccanica
La interfaccia tra la scheda di controllo e le terminazioni del sensore e del riscalda-tore, presenti sul chip, viene realizzata tramite una contattiera (Figura 2.7). Il sistema prevede che il chip monouso venga inserito nella posizione corretta e venga mantenuto in prossimità della contattiera mediante una slitta (Figura 2.8).
L'interfaccia tra la scheda di controllo e le terminazioni del sensore e del riscalda-tore, presenti sul chip, viene realizzata mediante un'apposita contattiera. Il sis-tema prevede che il chip monouso venga inserito nella posizione corretta e venga mantenuto in prossimità della contattiera mediante una slitta.
Figura 2.8: La slitta
2.5 La componente biologica
In una tecnica di real-tme PCR, per poter accoppiare la sintesi di DNA con l'aumen-to di un segnale di uorescenza si possono utilizzare diversi mel'aumen-todi come accenal'aumen-to nel capitolo 1. Nel sistema progettato da si utilizza come chimica di rivelazione la sonda TaqMan marcata con un uoroforo.
Attualmente, il sistema di real-time permette l'identi cazione di una singola se-quenza nucleica, ma si prevede di includere nella miscela di reazione due sonde TaqMan, legate a due dierenti uorofori, per realizzare una tecnica di real-time quantitativa multipla. Lo strumento quindi possiederà due sorgenti di eccitazione, ed il lettore ottico dovrà essere in grado di distinguere i contributi di uorescenza provenienti dai rispettivi uorofori.
2.6 Il sistema di illuminazione
Il sistema di real-time PCR a singola lunghezza d'onda, realizzato da STMicro-electronics, permette di illuminare la miscela di reazione mediante una precisa con gurazione di illuminazione. Essa comprende:
un LED (Light Emitting Diode) ad alta luminosità; un ltro ottico di eccitazione;
un ltro ottico di emissione.
In particolare, il LED (Figura 2.9) è la sorgente di eccitazione che ha il compito di suscitare la uorescenza delle molecole di uoroforo presenti nel campione e, per realizzare ciò, deve essere tale che il suo spettro si sovrapponga almeno parzial-mente allo spettro di eccitazione della molecola uorescente. Se così non fosse, l'eetto del LED sull'eccitazione della sonda sarebbe nullo e non si rivelerebbe alcun segnale di uorescenza dal campione.
Figura 2.9: Simbolo circuitale del LED
Dato che non è necessario che tutto lo spettro di eccitazione del uoroforo venga coperto dallo spettro del LED, per limitare le possibili interferenze tra l'eccitazione e l'emissione, a valle della sorgente è posto un ltro ottico. Esso è di tipo passa-banda ed ha il compito di tagliare le componenti spettrali del LED che si sovrappongono allo spettro di emissione del uoroforo; di fatto, scegliere questo ltro signi ca decidere a quali lunghezze d'onda il uoroforo verrà eccitato.
Una volta che lo spettro del LED è stato ltrato, la luce entra nella cameretta di reazione. Lì, dopo aver sorpassato le sottili pareti in PC della cameretta, raggiunge
la soluzione e ne causa l'eccitazione. In ne, il ltro ottico di emissione ha il compito di selezionare la radiazione uorescente di interesse che deve essere rivelata dal sensore.
Attualmente lo strumento sviluppato permette di eseguire real-time PCR volte ad identi care una sola sequenza nucleotidica di interesse e, per fare ciò, nella miscela è inserita la sonda di idrolisi TaqMan legata covalentemente o al uorocromo 5(6)-Carbossi- uoresceina o al 5(6)-Carbossi-X- rodamina.
A seconda del uoroforo che viene utilizzato nel processo di marcatura, ne abbi-amo bisogno d'una sorgente di luce diversa che riesca ad eccitare il uoroforo alla larghezza d'onda corrispondente. In totale si hanno fatto le prove con tre tipi di uorofori:
Il uoroforo 5(6)-FAM viene eccitato con un LED (LXK2-PB12-K00) ad alta luminosità prodotto da Lumileds Lighting caratterizzato da:
Lunghezza d'onda di picco: 470 nm; Angolo di emissione: 140 ° ;
V di funzionamento : 3.6 V; I di funzionamento: 700 mA; Flusso luminoso: 9.5 lumen
Il uoroforo 5(6)-ROX viene eccitato con un LED (L-7701C4SYC-H) ad alta luminosità prodotto da Kingbright caratterizzato da:
Lunghezza d'onda di picco: 590 nm; Angolo di emissione: 50 ° ;
V di funzionamento : 2.9 V; I di funzionamento: 150 mA; Intensità luminosa: 3700 mcd.
Il uoroforo NED viene eccitato con un LED (DS45) prodotto Lumileds caratterizzato da:
Lunghezza d'onda di picco: 530 nm; Angolo di emissione: 140 ° ;
V di funzionamento : 3.7 V; I di funzionamento: 700 mA; Flusso luminoso: 64 lumen
2.7 I ltri ottici
Molti strumenti per la rivelazione della uorescenza comprendono ltri ottici per il controllo dello spettro di eccitazione e di emissione della luce; essi infatti per-mettono alla sola radiazione che cade nella banda di assorbimento del uoroforo di raggiungere il campione biologico e alla sola radiazione uorescente emessa di raggiungere il sensore di luce.
L'assenza dei ltri determinerebbe l'impossibilità del rivelatore di distinguere la uorescenza desiderata da altre sorgenti di luce, come la diusione della radiazione di eccitazione, l'auto uorescenza del campione, e la luce ambientale. Un ruolo chiave nelle applicazioni biologiche e biomediche è svolto dai ltri ottici dicroici (o thin-lm, o a interferenza) multistrato.
Principio di funzionamento
I ltri dicroici sono formati da strati multipli alternati di materiali ad alto e basso indice di rifrazione, dello spessore pari ad un quarto della lunghezza d'onda del picco di trasmissione, depositati su un substrato di vetro; l'insieme di questi strati è chiamato stack. La loro modalità di funzionamento si basa sulla proprietà di interferenza distruttiva della luce ri essa o trasmessa alle interfacce tra i vari strati. In un ltro passa-banda (Figura 2.10) la combinazione di due stacks e uno spacer (sottile strato di un materiale dielettrico dello spessore pari a metà della lunghezza d'onda desiderata per il picco di trasmissione), dà origine ad una singola cavità e il numero di strati presenti in uno stack determina la larghezza della banda passante del ltro stesso.
Figura 2.10: Filtro passa banda ad una singola cavità
Generalmente, un ltro passa-banda a singola cavità non esibisce una ripida tran-sizione tra le lunghezze d'onda interne ed esterne alla banda passante, perciò, nella pratica comune si sovrappongono più cavità su un unico substrato, tipicamente di vetro. Un ltro così costruito riduce notevolmente la trasmissione del ltro nelle lunghezze d'onda non di interesse. Con un numero elevato di cavità, il pro lo trasmissivo del ltro tende a diventare molto simile a quello di un ltro ideale (rettangolare) con il quale è garantita una transizione marcata tra la trasmissione in banda e fuori banda.
In commercio esistono varie tipologie di ltri ad interferenza: alto, passa-basso, passa-banda e beamsplitter dicroici. In base alle loro caratteristiche, sono utilizzati con grande successo in applicazioni biologiche e biomediche.
Vantaggi
I ltri interferenziali sono utilizzati con successo per selezionare la banda passante in eccitazione e in emissione in dispositivi per la rivelazione della uorescenza. Il principale motivo del loro successo è da ricercarsi nelle ottime caratteristiche trasmissive che riescono a garantire in banda, fuori banda e nella transizione tra le due. La loro durevolezza nel tempo, adattabilità e facilità di pulizia, grazie ai loro rivestimenti resistenti, li rende adatti sia per applicazioni diagnostiche ad alti volumi sia nei laboratori di ricerca.
I ltri ottici nel sistema di real-time PCR
Nel sistema di real-time PCR in fase di prototipazione presso STMicroelectronics, vengono utilizzati due ltri ad interferenza. Il primo è un ltro di eccitazione di
