Ricerca di Adenovirus e Norovirus in acque di balneazione

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INTRODUZIONE

1.1 Acque ricreative e rischio connesso alla balneazione

L’ uso ricreativo delle acque marine sta aumentando in molti paesi: si stima che 129 milioni di persone abbiano visitato le spiagge negli Stati Uniti d'America fra il 2000 e il 2001, con un aumento del 6% dal 1995 (NOAA 2004) e si calcola che turisti stranieri e locali spendano insieme annualmente circa due miliardi di giorni in luoghi di villeggiatura lungo le coste (Shuval 2003).

Circa il 50% della popolazione mondiale vive in un’area intorno a poche centinaia di chilometri dal mare ed è stimato che su scala globale, il tasso di crescita della popolazione a livello delle aree costiere avvenga ad una velocità doppia della media mondiale. Ogni giorno bilioni di galloni di liquami, trattati o meno finiscono nelle acque costiere. Nei paesi in via di sviluppo si stima che circa il 90% di liquami provenienti da aree urbane siano scaricati senza alcun trattamento in laghi e mari. (Henrickson et al.2001). Negli Stati Uniti circa 9,3x107 persone (37% del totale) risiedono in aree costiere producendo una quantità di liquami di circa 1,0x1010 galloni al giorno (National Research Council, 1993) e nel 2005 più di 20.000 spiagge negli Stati Uniti sono state segnalate come non balneabili o addirittura chiuse alla balneazione. Nella maggior parte dei casi le chiusure sono state causate dall’inquinamento da acque di scarico (National Resources Defence Council, 2006).

In Europa il numero totale di zone di balneazione in acque costiere calcolato per i 25 stati membri dell’unione è risultato nel 2005 pari a 14.230, a cui si sommano 6.684 zone di balneazione in acque interne. Nelle zone costiere la conformità ai valori imperativi è passata dal 96,7% del 2004 al 96,1% nel 2005, con una diminuzione di 0,6 punti percentuali.

Il numero di zone vietate alla balneazione,in aumento per il quinto anno consecutivo, è risultato pari a 273, corrispondente all’1,9%. (vedi fig.1.1)

fig. 1.1 Dati sulla qualità delle acque costiere europee nel periodo 1990-2005 (http://ec.europa.eu/water/water-bathing/report_2006.html)

Essendo spesso utilizzate come recettori di reflui derivanti dai diversi usi (civili, agricoli, industriali), le acque di balneazione possono contenere numerosi agenti inquinanti di natura biologica, che conferiscono a tali acque una indubbia potenzialità nei confronti dell’uomo, sia direttamente attraverso la balneazione sia indirettamente attraverso il consumo di pesci o altri animali acquatici lamellibranchi, organismi filtratori che possono accumulare nell’epato-pancreas, senza danneggiarli, i microrganismi presenti nelle acque in forma libera o associate al materiale in sospensione (Patti 1992; Carducci et al.1998).

L’esistenza di un rischio infettivo legato alla balneazione in acque contaminate è dimostrato sia da studi epidemiologici che da dati provenienti dalla letteratura o più spesso da sistemi di sorveglianza.

Le patologie infettive legate alla balneazione in acque contaminate colpiscono soprattutto l’apparato gastrointestinale, respiratorio, visivo, uditivo e cutaneo (Cabelli et al., 1983; Leoni e Legnani 1991; Volterra 1992). L’ingestione di acqua durante il bagno non è infatti un evento insolito e il volume di acqua ingerito dipende da abitudini e capacità individuali, quindi la possibilità che da ciò possano derivare disturbi di natura gastroenterica è reale. Le patologie a carico dell’apparato cutaneo sono legate alla presenza di piccole lesioni della pelle che possono favorire l’infezione da parte di microrganismi presenti nell’acqua. L’occhio è protetto dal lisozima presente nelle lacrime e dall’azione meccanica esercitata dalle palpebre e questo meccanismo è solitamente molto efficace, purché un piccolo trauma non consenta la penetrazione di microrganismi o sostanze chimiche presenti nell’acqua; l’orecchio è normalmente protetto contro le infezioni batteriche dal cerume, che in seguito a ripetute esposizioni all’acqua subisce una riduzione rendendo il canale uditivo esterno più suscettibile; una rapida immersione della testa può far entrare acqua anche nel naso e nel tratto respiratorio superiore, predisponendo tali zone ad infezioni (Moretti et al.1998).

In Europa, e soprattutto in Italia, la mancanza di un sistema di sorveglianza epidemiologica esteso e ramificato riguardo alle malattie di origine idrica impedisce l’attuazione di uno studio approfondito del fenomeno che consenta di riconoscere il vero ordine di grandezza del problema.

Al contrario negli Stati Uniti enti impegnati nella classificazione e definizione delle malattie di origine idrica (“Center for Disease Control and Prevention” e “U.S.Environmental Protection Agency”) dal 1971 raccolgono dati al riguardo ed hanno potuto associare alle acque ricreative molte epidemie verificatesi negli anni. Dal 1971 al 2000 si sono verificati 21.740 casi di malattia e circa 259 epidemie associate ad acque ricreative, soprattutto laghi, piscine o stagni. Nel biennio 2001-2002 poi, si sono verificate altre 65 epidemie, con un totale di 2536 persone interessate. Il numero di epidemie associate all’uso di acque ricreative è in aumento dal 1993; resta da capire se questo sia dovuto al reale aumento delle epidemie stesse oppure rifletta l’incremento del numero di utenti delle acque ricreative o l’aumentato riconoscimento dei potenziali rischi per la salute associati dalla balneazione, (che ha condotto ad una migliore sorveglianza e ricerca), o rappresenti una combinazione di tutti questi fattori.

Le patologie connesse alla balneazione (dal 1971 al 2000) hanno colpito soprattutto l’apparato gastrointestinale e cutaneo e gli agenti patogeni maggiormente responsabili sono risultati batteri (37,5% degli episodi epidemici), protozoi(37,5%) e virus enterici (6,9%), mentre nel 15,4% dei casi non è stato identificato l’agente patogeno, lasciando pensare ad una sottostima del totale di casi realmente dovuti agli agenti virali (vedi tab. 1.1)

A questo proposito è ad esempio indicativo il fatto che nel 1971, quando è iniziata la sorveglianza da parte degli enti preposti americani, le colture cellulari rappresentavano l’unico metodo per l’individuazione di agenti virali in campioni ambientali.

tab. 1.1.1 Agenti eziologici ed epidemie associate alla balneazione negli Stati Uniti nel periodo 1971-2000 (Craun et al. 2000)

Epidemie Casi di malattia

Agente eziologico

Numero di casi % Numero di casi %

Protozoi 97 37,5 12701 58,4 Batteri 97 37,5 4548 20,9 Agente non identificato 40 15,4 2966 13,6 Virus 18 6,9 1433 6,6 Agenti chimici 5 1,9 40 0,2 Batteri e Protozoi 1 0,4 38 0,2 Alghe 1 0,4 14 0,1 Totale 259 100% 21740 100%

La tabella 1.1.2mostra una lista dei patogeni che sono stati associati ad epidemie associate alle acque ricreative negli Stati Uniti nel periodo 1985-1998.

Nonostante la quantità di dati raccolti sulle acque ricreative in generale, per quanto riguarda la balneazione in mare si hanno pochi episodi di epidemie documentate e la maggior parte dei dati a disposizione in letteratura provengono dai risultati di numerosi studi epidemiologici, che dagli anni ’50 ad oggi hanno indagato sul rischio infettivo connesso alla balneazione in acque contaminate.

tab. 1.1.2 Agenti eziologici di epidemie legate alle acque ricreative negli Stati Uniti nel periodo 1985-1998*

Già a partire dagli anni ’50 infatti, alcuni autori (Stevenson, 1953) hanno dimostrato una maggiore incidenza di patologie nei bagnanti rispetto ai non bagnanti; negli anni ’70 è stata evidenziata l’inadeguatezza degli indicatori batterici di inquinamento (Cabelli et al.1978) e le difficoltà connesse ad una precisa valutazione del rischio infettivo legato alla balneazione in acque contaminate (Madhy, 1979).

Uno studio caso-controllo del 1977 (D’Alessio et al. 1981) ha evidenziato infezioni virali contratte da ragazzi esposti all’acqua di mare (OR=3,41; p<0,0005): i casi erano 296 bambini sottoposti a visita pediatrica in seguito alla manifestazione di sintomi gastrointestinali e/o respiratori, mentre i controlli erano in totale 679 individui sani. Sono state analizzate le feci di 241 casi e 27 controlli: in 119 casi è stata evidenziata la presenza di enterovirus non-polio e in 13 casi di altri tipi di virus. Altre indagini condotte negli anni ’80 attraverso studi a coorte prospettica (Cabelli et al. 1983) hanno evidenziato una associazione tra sintomi gastrointestinali e inquinamento microbiologico delle acque, con un rischio di contrarre gastroenteriti dalle tre alle quattro volte superiore nei bagnanti rispetto ai non bagnanti (Cabelli et al.1982). Studi simili sono stati attuati

4 65 Giardia lambia 20 1780 Shigella spp. 9 234 Escherichia coli 0157:H7 1 595 Adenovirus 3 3 89 Norwalk-like viruses 1984 429 389 Numero di casi 21 Infezioni gastrointestinali acute (nessun

agente identificato) 3 Cryptosporidium parvum 3 Leptospira sp. Numero di epidemie Agente eziologico

negli anni successivi in Egitto (El Sharkawi e Hassan, 1982), Israele (Fattal et al. 1987), Sud Africa (von Schirnding et al. 1992), Australia (Corbett et al. 1993) e Hong Kong (Cheung et al. 1990).

Quest’ultimo ha stimato che i bagnanti erano più di 5 volte soggetti a sviluppare gastroenteriti rispetto a coloro che non avevano fatto il bagno, attribuendo non meno di 400000 casi alla contaminazione dell’acqua di mare nel solo anno 1990 (Cheung et al., 1990). Sempre nel 1990 il Department of Environment inglese ha commissionato uno studio per valutare il rischio per la salute connesso ai bagni in acque di mare contaminate: questa indagine è stata effettuata su 1883 soggetti a Ramsgate (Balarajan, 1991) e da essa emerge un aumento dose correlato del rischio di malattie manifestatesi in seguito a bagni in acqua di mare e tale rischio sembra associato alla qualità microbiologica dell’acqua.

Negli anni ’90 i più credibili studi epidemiologici che dimostrano la presenza di un rischio infettivo attribuibile all’esposizione ad acque contaminate sono basati su studi clinici controllati e randomizzati attraverso l’utilizzo di volontari( Kay et al.1994, Fleisher et al. 1996) ed hanno determinato che tra le persone che facevano il bagno immergendo la testa in acque marine “accettabili”, esposte ad un basso livello di contaminazione da liquami, c’è una significativa presenza in eccesso di casi di gastroenteriti e AFRI (Acute Febbrile Respiratory Illness), nonostante queste acque fossero in accordo con i correnti limiti degli standard microbiologici europei. Questi studi sono stati presi come riferimento dal WHO e utilizzati nella stesura delle Guidelines for Safe Recreational Waters Environments (WHO 2003). Altre indagini svolte in California ( R. Haile., 1996), in Italia (F.A. Aulicino et al., 2000 e 2001), e in altri Paesi (vedi tab.1.1.3) confermano la presenza di maggiori rischi di contrarre infezioni a carico degli apparati gastroenterico, respiratorio, occhi e mucose per coloro che fanno il bagno in acque contaminate e quindi sottolineano l’importanza del controllo della qualità microbiologica dell’acqua di mare.

tab. 1.1.3 Principali studi epidemiologici sulle acque ricreative (Pruss 1998)

Anno di studio Luogo di studio Tipo di studio Tipo di acqua Riferimento

1996 UK Randomized Controlled trial Marina Fleisher (1996)

1996 Stati Uniti Coorte Marina Haile (1996)

1996 UK Coorte Marina Van Djik (1996)

1995 Nuova Zelanda Coorte Marina Bandaranajake (1995)

1995 Hong Kong Coorte Marina Kueh (1995)

1995 Sud Africa Coorte Marina Medical Research Council

(1995)

1994 UK Randomized Controlled trial Marina Kay (1994)

1994 UK Coorte Marina Pike (1994)

1993 Australia Coorte Marina Corbett (1993)

1992 UK Coorte Dolce Fewtrel l(1992)

1991 Israele Coorte Marina UNEP/WHO n°.46 (1991)

1991 Spagna Coorte Marina UNEP/WHO n°53 (1991)

1989 Hong Kong Coorte Marina Cheung (1991)

1989 Francia Coorte retrospettiva Dolce Ferley (1989)

1989 Canada Coorte Dolce Lightfoot (1989)

1987 Israele Coorte Marina Fattal (UNEP/WHO (1991)

1985 Canada Coorte Dolce Seyfrid (1985)

1984 Stati Uniti Coorte Dolce Dufour (1984)

1983 Egitto Coorte Marina Cabelli (1983)

1982 Stati Uniti Coorte Marina e Dolce Cabelli (1982)

1982 Spagna Coorte retrospettiva Marina Mujeriego (1982)

1953 Stati Uniti Coorte Dolce Stevenson (1953)

È quindi possibile affermare che l’utilizzo delle acque a scopi ricreativi può rappresentare un rischio per la salute dei bagnanti, che dipende da vari fattori quali la natura del rischio, le caratteristiche del corpo acquatico, la condizione immunitaria dell’utente.

1.2 I virus e le acque di balneazione

Tra i microrganismi patogeni che possono essere riversati nelle acque e rappresentare un rischio per la salute dell’uomo, i virus enterici patogeni stanno assumendo sempre maggiore importanza, anche a seguito del miglioramento delle tecniche di analisi che permettono di attribuire a questi molti episodi epidemici prima classificati come ad eziologia sconosciuta. Fino ai primi anni del 1970 infatti le evidenze circa una possibile implicazione di agenti virali nell'eziologia di enterite nell'uomo sono state piuttosto scarse e frutto per lo più di osservazioni occasionali in rapporto alla complessità e scarsa sensibilità dei metodi disponibili per l'identificazione dei virus enterici (metodi colturali, microscopia elettronica, ecc.). Più recentemente, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ne ha segnalato un notevole aumento di incidenza (Bern C, 1992)

. Numerosi studi epidemiologici hanno dimostrato che circa il 30% delle diarree infettive del bambino e dell'adulto sono attribuibili a batteri e/o parassiti mentre la rimanente quota può verosimilmente riconoscere una eziologia virale (Wallace BJ et al., 1999; Koopmans M et al., 2002).

I virus enterici hanno come caratteristica comune quella di replicarsi nell’intestino umano e sono escreti con le feci per settimane, con concentrazioni fino a 1010 particelle virali per grammo (rotavirus), con valori medi tra 106 (enterovirus) e 108 (HAV) (Feachem et al.1983, Yates et al. 1988, Gerba, 2000). Le modalità di circolazione di questi microrganismi e le vie di contagio per l’uomo sono schematizzate in figura 1.2.1

fig. 1.2.1: Trasmissione dei virus enterici attraverso l’acqua

I virus enterici ritrovati nelle feci comprendono più di 140 tipi (vedi tabella 1.2.1), tra questi principalmente gli enterovirus, i rotavirus, gli adenovirus 40 e 41, i calicivirus umani (norovirus), i virus dell’epatite A ed E, gli astrovirus. (Metcalf T.G.et al. 1995) assumono particolare importanza per la salute pubblica.

DEIEZIONI UMANE E ANIMALI RIFIUTI SOLIDI ACQUE DI SCARICO ACQUE SOTTERRANEE FIUMI E LAGHI OCEANI ED ESTUARI ACQUE DI BALNEAZIONE FRUTTI DI MARE IRRIGAZIONE E FERTILIZZAZIONE COLTIVAZIONI ACQUE POTABILI AEROSOL UOMO ACQUE DI DILAVAMENTO

tab.1.2.1: Virus eliminati con le feci

FAMIGLIA GENERE SPECIE MALATTIE

ASSOCIATE DIMENS IONI (nm) GENOMA Enterovirus Poliovirus Poliomielite paralitica, meningite asettica… 30 ssRNA

Enterovirus Coxackievirus A Meningite asettica,

encefalite 30 ssRNA Enterovirus Coxackievirus B Meningite asettica, endocardite, pericardite acuta 30 ssRNA

Enterovirus Echovirus Meningite asettica,

gastroenterite acuta 30 ssRNA Enterovirus Enterovirus

68-71

Affezioni

respiratorie acute 30 ssRNA Picornaviridae

Hepatovirus HAV Epatite virale A 30 ssRNA

Hepeviridae Hepevirus HEV Epatite virale E 30 ssRNA

Caliciviridae Norovirus, Sapovirus NLV,SLV Diarrea, vomito, gastroenteriti acute epidemiche 31-35 ssRNA Rotavirus Rotavirus Diarrea infantile,

vomito 70 dsRNA

Reoviridae

Orthoreovirus Reovirus Non accertata 75-80 dsRNA

Adenoviridae Mastoadenoviru s Adenovirus Affezioni respiratorie, congiuntivite epidemica, gastroenteriti (tipo 40-41) 60-90 dsDNA

Astroviridae Astrovirus Astrovirus Diarree infantili 28 ssRNA Coronaviridae Coronavirus HCov-229E HCov-OC43 SARS-HCov Affezioni respiratorie, polmonite atipica, gastroenteriti 80-130 ssRNA

Dopo escrezione con le feci e allontanamento tramite i collettori delle acque reflue, i virus enterici presenti, (come dimostrato in vari studi, vedi tab. 1.2.2) possono disperdersi nell’ambiente se i processi di trattamento del liquame non sono capaci di rimuoverli completamente (Block e Schwartzbrod, 1989).

tab.1.2.2 Virus ed acque reflue NAZIONE TIPO DI VIRUS QUANTITA’ DI VIRUS N° (%) CAMPIONI POSITIVI AUTORI

FRANCIA Rotavirus Schwartzbrod

et al., (1983)

U.K. Enterovirus 57500 PFU.L-1 80 % Morris, (1984)

CANADA Enterovirus Reovirus 95 MPNCU.L-1 100 % Payment et al., (1986) SPAGNA Enterovirus Reovirus 267 PFU.L-1 237 FF.L-1 100 % 100 % Bosch et al., (1986) NUOVA ZELANDA Enterovirus Da 50 a 479PFU.L-1 67,5 % Lewis et al., (1986) SPAGNA Rotavirus Da 666 a 95000 FF.L-1 100 % Bosch et al., (1988) USA Enterovirus Da 100 a 242500 PFU.L-1 Dahling et al., (1989)

ITALIA Enterovirus 58 % Carducci et al.,

(1994)

FRANCIA Enterovirus 3.45 PFU.L-1 94,7 % Vilagines et

al., (1997)

ITALIA HAV Genoma 80 % Divizia et al.,

(1998)

SPAGNA HAV Genoma 100 % Espigares et

al., (1999)

NLV 9.104 RPC.L-1

PAESI BASSI _Rotavirus 7.6 x 102 RPC..L-1 Lodder et al., (1999) FRANCIA Astrovirus Da 3x106 a 3x10 GU. L-1 Le Cann et al., (2004) TUNISIA Astrovirus Enterovirus HAV Genoma Genoma Genoma 76 % 50 % 27 % Sdiri et al., (2003)

Solitamente gli impianti di depurazione che mancano di un trattamento terziario riducono la carica virale in maniera insufficiente; i fanghi attivi riducono ad esempio il 95% della carica virale ma molti virus riescono a sopravvivere arrivando alle acque riceventi in concentrazioni che dipendono dalla consistenza della contaminazione iniziale (vedi tab. 1.2.3) e variano da 1-10 PFU per 100 l fino a 100 PFU per litro (M.J.Carter, 2005).

In base alla distanza raggiunta troveremo via via concentrazioni sempre minori di virus ed aumenterà quindi la difficoltà di individuazione.

tab 1.2.3: Concentrazione di virus in varie matrici ambientali

CAMPIONE VIRUS CONCENTRAZIONE

Feci Enterovirus Fino a 1010/g

Liquami Enterovirus 1-106/g

Acque superficiali Enterovirus 0,1-102/L

Acque marine Enterovirus 0,01-102/L

Aerosol da depuratori Enterovirus 0,0047-1/m3

Fanghi da depuratori Enterovirus

Primari: 10->103/100ml Attivi: 100-800/100ml Digeriti anareobic.: 0,2-200/g

I virus enterici non possono replicarsi nell’acqua in quanto sono parassiti endocellulari obbligati, ma vi possono sopravvivere a lungo (Abad et al. 1997; Carducci et al. 1996; Enriquez et al., 1995; Koopmans and Duizer 2004; Payment 1998), grazie alla mancanza di un rivestimento membranoso pericapsidico e alla presenza di un capside proteico virale particolarmente resistente in grado di adsorbirsi a particelle colloidali in sospensione nel mezzo idrico, che li proteggono dai trattamenti di disinfezione. In ambiente marino, ad esempio, la sopravvivenza varia notevolmente in base al tipo di virus ed alla temperatura dell’acqua, andando da pochi giorni (Poliovirus 1 a temperatura ambiente) fino ad 85 giorni (Adenovirus 41 a 15°C) ( Tabella 1.2.4). In tale ambiente si verifica comunque solitamente una riduzione della contaminazione da virus, rispetto ad altri corpi idrici superficiali, che è imputabile, oltre che alla ampia diluizione, ad una serie di fattori

“inattivanti” come temperatura, salinità, luce solare, antagonismo microbico e sostanze tossiche come metalli pesanti eventualmente presenti nelle acque.

tab.1.2.4 Sopravvivenza di alcuni virus in ambiente marino

VIRUS MATRICE SOPRAVVIVENZA TEMPERATURA RIF. BIBLIOG.

Adenovirus

40 Acqua di mare 77g 15°C Schwartzbrod 2003

Adenovirus

41 Acqua di mare 85 g 15°C Schwartzbrod 2003

Calicivirus mammiferi

marini

Acqua di mare >14 g 15°C Smith et al. 1998

Calicivirus

felini Acqua di mare 30 g ≤ 10°C Kadoi et al. 2001

Poliovirus 1 Acqua di mare Sedimenti Solidi sospesi Sedimenti superficiali 6 g 19 g 19 g 19 g 22-25°C 22-25°C 22-25°C 22-25°C Rao et al 1984

Poliovirus 1 Acqua di mare 1-3 g 10 g

28°C

6°C Wait et al. 2001 Parvovirus Acqua di mare 1-3 g

10 g 28°C 6°C Wait et al. 2001 Rotavirus SA11 Acqua di mare Sedimenti Solidi sospesi Sedimenti superficiali 9 g 19 g 19 g 19 g 22-25°C 22-25°C 22-25°C 22-25°C Rao et al 1984

La dose infettante è comunque bassa: generalmente tra 1 e 10 PFU (unità formanti placca) (Leclerc et al., 2002; Ward and Akin., 1984), per cui il rischio d’infezione da virus presenti in acqua risulta molto più alto di quello per i batteri allo stesso livello di esposizione, da 10 a 10000 volte secondo uno studio di Rose e Gerba del 1991.

Oltre alla elevata resistenza ambientale, all’alta concentrazione nelle feci ed alla bassa carica infettante , vi sono altre caratteristiche peculiari che rendono i virus enterici agenti di rischio biologico ambientale:

• Possibilità di causare infezioni asintomatiche • Sviluppo nell’ospite di una immunità di tipo breve • Elevata variabilità genetica

• Presenza di molteplici vie di trasmissione

Studi eseguiti sulle acque di balneazione dimostrano una diffusa presenza virale (tab.1.2.5), soprattutto in superficie piuttosto che in profondità (De Flora et al.1975).

tab 1.2.5: Studi sulla ricerca di virus in acque marine (Griffin 2003)

Virus Luogo % positivi attraverso

PCR o colture cellulari

Concentrazion e virus / 10 L

Referenze Enterovirus Galveston Bay,

Texas

40,0 (colture celllulari) Dato non disponibile

Gerba et al. (1979) Enterovirus Golfo del Texas 59,0 (colture cellulari) 0,1-4,4 Goyal et al.

(1979) Enterovirus Galveston Bay,

Texas

14,0 (colture cellulari) 0,1-10,5 Rao et al (1984) Enterovirus Waikiki, Hawai 8,0 (colture cellulari) <0,1-130.000 Reynolds et

al (1998) AdV, enterovirus,

HAV

Barcelona, Spagna 78,0 (AdV) 33,0 (HAV) 44,0 (enterovirus) (PCR/RT-PCR)

Presenza/assenza Pina et al. (1998)

AdV, Enterovirus Patras, Grecia 90,0 (AdV) 83,4 (Enterovirus) (PCR/RT-PCR) 1,2-6,0 (colture cellulari, enterovirus) Vantarakis et al (1998) Enterovirus, HAV, Norwalk virus Florida keys, California 79,0 (enterovirus) 63,0 (HAV) 11,0 (Norwalk) Presenza/assenza Griffin et al.(1999) Reovirus Catania, Italia 27,0 (colture cellulari) Presenza/assenza Aulicino et

al.(2000) Enterovirus,

Reovirus

Pesaro, Italia 32,6 (enterovirus) 49,3 (reovirus) (colture cellulari)

Presenza/assenza Pianetti et al.(2000) Reovirus Roma, Italia (bocca

del fiume Tevere)

3,0 (colture cellulari) 2,0-5,0 Aulicino et al.(2001) Enterovirus Florida keys,

California

93,0 (RT-PCR) Presenza/assenza Lipp et al (2001) Enterovirus Sarasota Bay,

Florida

25,0 (colture cellulari) 17,0-77,0 (colture cellulari)

Lipp et al (2001) Enterovirus Charlotte Harbor

estuary, Florida

21,9 (colture cellulari) 100-200 Lipp et al (2001)

AdV California, Usa 33,3 (PCR) 8800-75000

(MPN-NestedPCR)

Jiang et al (2001) Reovirus, Fano, Italia 30,0 (RT-PCR) Presenza/assenza Muscillo et

al (2001) Enterovirus Santa Monica Bay,

California

32 (RT-PCR) Presenza/assenza Noble et al (2001)

In Italia ad esempio numerosi studi hanno evidenziato la presenza di reovirus ed enterovirus lungo le coste del mar Adriatico (Muscillo et al., 1996, Muscillo et al., 1997b, Pianetti et al.,.2000), Tirreno (De Vito 1994, Patti, 1996, Aulicino, 2001) e Ionio (Aulicino, 2000). Le acque della Grecia sono state oggetto di due studi successivi (Vantarakis et al., 1998, Vantarakis et al., 2005) che hanno evidenziato la presenza di Adenovirus (28% e 16% rispettivamente) ed Enterovirus (21% e 10%). Indagini condotte in California in tempi successivi hanno mostrato una diffusa presenza virale dovuta soprattutto ad Adenovirus ed Enterovirus, ritrovati sia in acqua marina (Jiang et al., 2001, Noble et al,. 2001, Wetz et al., 2004) che dolce (Jiang et al, 2004 ,Choi et al., 2005) . La presenza di enterovirus è stata evidenziata anche in studi condotti a Barcellona, nel 55% di 24 campioni di acqua marina (Mocè-Llivina et al., 2005), e in Giappone, dove sono risultati positivi attraverso colture cellulari 4 campioni su 6 provenienti da Enoshima Beach (Katayama et al., 2002). Lo stesso studio ha riportato anche la presenza di Norovirus nella baia di Tokyo, con 4 positivi su 8 campioni totali. In Sud Africa uno studio riguardante le acque ricreative del Klip River (Taylor et al., 2001) ha riportato la presenza di astrovirus (21,6%) e virus dell’epatite A (37,3%).

La maggior parte degli studi citati ha evidenziato la mancanza di una correlazione significativa tra la presenza di virus enterici e gli indicatori batterici di inquinamento fecale (vedi tabella 1.2.6), la cui affidabilità nell’indicare un rischio infettivo è già da molti anni messa in discussione. In particolare essi sembrano assai poco utili per indicare un rischio di natura virale. Infatti gli indicatori batterici non hanno una resistenza ambientale paragonabile con quella dei virus enterici, perché vengono inattivati più rapidamente dai trattamenti disinfettanti e quindi l’assenza di tali batteri nell’ambiente non esclude la presenza di un inquinamento virale (Patti et al., 1996).

tab 1.2.6 Indagini microbiologiche su acque ricreative che hanno evidenziato la mancanza di correlazione tra virus enterici e batteri indicatori

REFERENZ E LUOGO DI STUDIO PERIO DO DI STUDIO TIPO DI ACQU A IDENTIFICAZION E VIRALE CORRELAZION E BATTERI-VIRUS Jiang, 2004 California Jul-Aug

2000 Fiume AdV,HAV,Enterovir us - Mocè-Llivina, 2005 Barcelona Jul-Oct 2002 Mare Enterovirus - Katayama, 2002 Tokio bay, Japan Aug 2001, Feb 2002 Mare Enterovirus, NLV - Wetz, 2004 Florida Keys March 2000 Mare Enterovirus - Vantarakis, 2005 South Western Greece May– Aug 2000

Mare Adv, Enterovirus

- Choi, 2005 Los Angeles river (CA) Feb 2002-Feb 2003 Fiume AdV - Noble, 2001 Santa Monica Bay May-Sep 1999 Mare Enterovirus - Jiang, 2001 Southern California Feb-Mar 1999 Mare AdV - Taylor, 2001 South Africa June ’97-May ‘98

1.3 Legislazione sulle acque di balneazione

In applicazione alla Direttiva Europea sulle acque di balneazione del 1976 (76/160/CEE), la normativa italiana, (DPR 470/82), stabilisce che il giudizio di idoneità alla balneazione venga espresso in base alla conformità a valori-limite di una serie di parametri microbiologici e chimico-fisici.

Per verificare la qualità microbiologica delle acque di balneazione, le norme attualmente prevedono la determinazione di parametri indicatori di contaminazione fecale e, per il giudizio di conformità, la rispondenza ai valori limiti stabiliti (tab 1.3.1).

tab. 1.3.1: Limiti microbiologici per le acque di balneazione (D. L. n. 155 del 14/5/1988).

PARAMETRI VALORI LIMITE FREQ. RILEVAZIONI

Coliformi totali/100ml 2000 Bimensile

Coliformi fecali/100ml 100 Bimensile

Streptococchi fecali/100ml 100 Bimensile

Salmonella/1L 0 *

Oli minerali mg/L <=0,5 Bimensile

Sostanze tensioattive (mg/L) <=0,5 Bimensile

Fenoli (mg/L) <=0,05 Bimensile

% saturazione O2 70-120 Bimensile

Enterovirus pfu/10L 0 **

*ricerca prevista solo nel caso di particolari situazioni che facciano sospettare la loro presenza **la ricerca è lasciata a discrezione delle autorità competenti

Grazie all’attuazione della direttiva la qualità delle acque di balneazione in Europa è aumentata in maniera evidente, raggiungendo livelli di conformità estremamente elevati: oltre il 95% per le acque marine e superiori al 90% per le acque interne.

I controlli delle acque marine costiere sono regolamentati fondamentalmente dalla Legge n° 979 del 31/12/82 che stabilisce criteri e competenze per il monitoraggio e il controllo del mare

(attivando programmi di monitoraggio marino, predisponendo piani di pronto intervento e istituendo riserve marine) e dalla Legge Quadro sulle acque.

Dall’esperienza di Regioni e ARPA sul controllo dei rischi di natura sanitaria correlati alla balneazione, nel corso degli ultimi anni è emerso che l’adozione di un criterio basato esclusivamente sulla valutazione analitica della qualità delle acque può fornire informazioni incomplete per la valutazione dei rischi di esposizione.

La Commissione Europea, dopo aver preso in considerazione studi epidemiologici svolti in altri Paesi europei e uno specifico rapporto dell’OMS (Farnham., 2001), alla fine del 2000 ha presentato una comunicazione (COM (2000) 860 def.) come prima tappa fondamentale del tentativo di aggiornamento della direttiva che, nei due anni successivi è diventata proposta di “Direttiva del Parlamento e del Consiglio relativa alla qualità delle acque di balneazione” (COM (2002) 581 def.) alla quale ha fatto seguito nel 2006 la nuova “Direttiva 2006/7/CE del Parlamento Europeo e del Consiglio relativa alla gestione della qualità delle acque di balneazione e che abroga la direttiva 76/160/CEE”. Tale direttiva è finalizzata a preservare, proteggere e migliorare la qualità dell’ambiente e a proteggere la salute umana e stabilisce disposizioni in materia di:

• Monitoraggio e classificazione delle acque di balneazione • Gestione della qualità delle acque di balneazione

• Informazione al pubblico in merito alla qualità delle acque di balneazione

In questo documento vengono introdotti 2 nuovi parametri microbiologici, enterococchi intestinali (EI) ed Escherichia coli (EC) , che sostituiscono i 19 parametri precedentemente utilizzati in quanto considerati più sensibili e significativi per analizzare il rischio per la salute pubblica durante l’attività di balneazione e gli altri usi ricreativi della risorsa idrica. Attraverso questi nuovi parametri si valuta la qualità dell’acqua di balneazione come “eccellente”, “buona” o “sufficiente”(vedi tab.1.3.2) .

tab. 1.3.2: Limiti microbiologici per le acque di balneazione (Direttiva 2006/7/CE)

Attraverso la classificazione si attribuisce un giudizio di qualità ambientale in senso lato alle acque di balneazione siano esse non conformi (classe “scarsa”) o conformi (classe buona) e si introduce una ulteriore suddivisione tra le conformi, con il rispetto dei limiti di riferimento (100 ufc/100 ml per EI e 250 ufc/100ml per EC) per una maggiore tutela sanitaria (classe “eccellente”).

La classificazione non si limita ad una diversa espressione formale, ma si concretizza in una serie di adeguamenti temporali (come frequenza dei prelievi e aggiornamento delle fonti relative al profilo della spiaggia) e gestionali (predisposizione di piani e misure per ridurre/eliminare l’inquinamento, individuazione delle cause e dei fattori di rischio, realizzazione di interventi, informazione dei cittadini, ecc) che possono essere estremamente onerosi dal punto di vista economico, politico e sociale. Questo tipo di approccio alla gestione della balneazione è sicuramente innovativo in materia di normativa sanitaria, andando nella direzione di una valutazione complessiva dell’ambiente, inteso non solo riguardo alle componenti chimiche, fisiche e chimiche degli ecosistemi, ma anche le attività umane (sia in termini di pressione antropica che come azioni mitigatorie e di risanamento) e la tutela della salute.

1.4 Il progetto Virobathe

Tra le disposizioni finali di questa direttiva è prevista la stesura da parte della Commissione, entro il 2008, di una relazione che tenga conto tra l’altro degli “sviluppi scientifici, analitici ed epidemiologici relativi ai parametri riguardanti la qualità delle acque di balneazione, anche in relazione ai virus” al fine di un riesame ed eventuale implementazione della direttiva stessa.

Da molti anni infatti si discute sulla reale affidabilità degli indicatori batterici di inquinamento fecale per indicare un rischio infettivo: in particolare essi sembrano assai poco utili per indicare un rischio di natura virale. Lo sviluppo degli standard microbiologici è stato infatti basato sulla concezione che gli organismi batterici fossero i migliori indicatori della contaminazione fecale delle acque e quindi anche della eventuale presenza di patogeni enterici, ma molti studi negli anni hanno riportato come visto in precedenza l’individuazione di virus enterici in acque i cui standard microbiologici rispettavano le normative vigenti e quindi considerate balneabili.

Alla luce degli studi sopracitati e delle disposizioni della direttiva europea sulle acque di balneazione si è resa necessaria un’indagine riguardo la possibilità dell’utilizzo di virus umani come indicatori della qualità delle acque ad uso ricreativo e del rischio per la salute pubblica e il successo di questo nuovo approccio dipende dalla scelta di specie virali adatte alla valutazione del rischio e dallo sviluppo e dalla standardizzazione di tecniche adatte ad una applicazione routinaria attraverso la quale si renda possibile un monitoraggio costante delle acque di balneazione.

L’Unione Europea ha quindi deciso di finanziare un progetto denominato “Methods for the concentration and detection of adenoviruses and noroviruses in european bathing waters with reference to the revision of the bathing water directive 76/160/EEC” che coinvolge 16 laboratori di 9 stati membri dell’unione. (vedi Fig.1.4.1).

Questo progetto utilizza i progressi nelle tecnologie scientifiche di ricerca virale, che forniscono l’opportunità per un grande miglioramento della rilevazione di microrganismi presenti nell’acqua e la conseguente riduzione dei rischi per la salute associati con l’uso “ricreativo” di acque inquinate.

fig. 1.4.1 Istituzioni coinvolte nel progetto europeo “Virobathe”

UWA= University of Wales, Aberystwyth CSL= Central Science Lab. HPA= Health Protection Agency SGL=State General Laboratory RIVM=Rijksinstituut

voorVolksgezondheid en Milieu UBA= German Environmental Agency NVR= National Veterinary Research

Instituite UB= University of Barcelona

LGA=Regierungsprasidium Stuttgart Landesgesundheitsamt

UHP= University Henri Poincare’ Nancy UP= Univeristy of Porto PIS= Università di Pisa RTV=Università di Tor Vergata ISS= Istituto Superiore. Sanità ENV= Environmental Agency,

UWA

PIS

S

CSL

RIVM

RTV

UHP

ENV

UB

NVR

I

LGA

UBA

ISS

UP

SGL

HPA

I principali obiettivi di questo progetto sono:

Migliorare le tecniche di rilevazione di norovirus e adenovirus presenti nelle acque

Fornire dati di sorveglianza sui virus bersaglio in acque di balneazione dell’Unione Europea,
Diffondere le tecnologie ai laboratori non partecipanti

Aumentare la fiducia nel monitoraggio della qualità delle acque di balneazione europee

Le specie virali scelte per questo progetto sono, come possiamo vedere, Adenovirus e Norovirus: il primo è infatti considerato un possibile candidato ad indicatore virale di inquinamento fecale, mentre il secondo rappresenta il patogeno virale più frequentemente associato ad episodi epidemici dovuti ad acque di balneazione.

1.4.1 Adenovirus

Gli adenovirus sono stati scoperti e isolati nel 1953 osservando l’effetto citopatico da essi provocato in colture di adenoidi umane (da cui il nome del virus). Adenovirus è un virus a Dna lineare a doppio filamento e presenta un capside di simmetria icosaedrica formato da 252 capsomeri poligonali (240 esoni costituiscono le facce e i lati di triangoli equilateri e 12 pentoni costituiscono i vertici)

Sono privi di pericapside. Al microscopio elettronico misurano un diametro variabile da 60 a 90 nm. Se ne conoscono almeno 51 sierotipi , compresi in almeno 6 sottogruppi (da A ad F), che sono stati identificati come patogeni per l’uomo (tab. 1.4.1.1)

Tab. 1.4.1.1 Classificazione sierotipica degli adenovirus umani (Jiang, 2006) Sottogruppo

(Specie)

Sierotipo Sito di infezione

A 12, 18, 31 Tratto gastrointestinale

B 3, 7, 16, 21, 50 (B1) Polmoni, vie urinarie

C 1, 2, 5, 6 Vie respiratorie superiori

D 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 22,

23, 24, 26, 27, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51

Occhi, tratto gastrointestinale

E 4 Vie respiratorie

F 40,41 Tratto Gastrointestinale

Le patologie da adenovirus colpiscono principalmente:

• il tratto respiratorio (farinigiti, malattie respiratorie acute e polmoniti) • l’apparato visivo (congiuntiviti, cheratocongiuntiviti

• l’apparato gastrointestinale

Soltanto gli adenovirus di tipo 40 e 41 sono capaci di causare sindromi gastrointestinali (Enriquez et al., 1995) e sono responsabili di gastroenteriti soprattutto nei bambini, dove sono secondi solo a rotavirus (Crabtree et al., 1997) e solo negli Stati Uniti sono responsabili del 5-20% dei ricoveri ospedalieri, di bambini sotto i 2 anni, per diarrea. Studi condotti in Australia

analizzando oltre 5000 campioni fecali durante il periodo 1981-1996 hanno indicato adenovirus responsabile del 3-9% dei casi ospedalieri di gastroenteriti. Anche in questo caso la maggior parte dei casi ha riguardato bambini; adenovirus 41 è risultato responsabile del 40-80 % dei casi citati, mentre meno del 20% ha riguardato adenovirus 40 (Grimwood et al., 1995). Molti individui sono infettati prima di raggiungere i 20 anni di età. Mentre solamente il 20% dei bambini sotto i 6 mesi mostra anticorpi per adenovirus, entro l’età di 3 anni si ha presenza di anticorpi almeno nel 50% dei soggetti.(M.J.Carter, 2005). Le infezioni da adenovirus possono occorrere durante tutto l’anno e il periodo di incubazione del virus è generalmente minore di 10 giorni (Foy, 1997, Gaydos, 1999) ma può arrivare anche a 24 giorni (Hunter, 1998)

La trasmissione include la via oro-fecale e l’inalazione di aerosols; dopo infezioni acute, alcuni sierotipi (adenovirus 1, 2, 5) vengono escreti per lunghi periodi in feci, urine e secrezioni respiratorie delle persone infette contribuendo alla diffusione endemica del virus ai gruppi suscettibili.

Oltre agli adenovirus che infettano il tratto intestinale dell’ospite, anche altri tipi di adenovirus, come ad esempio adenovirus 5, che rappresenta l’11% dei casi clinici non gastrointestinali riportati alla World Health Organization, è spesso ritrovato in ambienti acquatici (Tani et al,. 1995, Lee et al., 2002) a dimostrazione del fatto che anche i ceppi respiratori vengono escreti con le feci (Fong and Lipp, 2005) sebbene in numero minore rispetto agli adenovirus enterici 40 e 41, che raggiungono concentrazioni di circa 106- 108 per ml.

Gli adenovirus sono stati isolati frequentemente nei liquami grezzi (Puig et al., 1994, Pina et al., 1998) ; uno studio su impianti di trattamento di liquami svoltosi in Norvegia al fine di valutare la efficacia dei trattamenti stessi ha individuato adenovirus nel 96% dei campioni in entrata e nel 94% dei campioni in uscita (Myrmel et al., 2006), dato indicativo della resistenza del virus stesso ai trattamenti di depurazione. Questo virus nei liquami si presenta costantemente in concentrazioni maggiori rispetto ad enterovirus (Irving and Smith, 1981, Krikelis et al., 1985) e si è mostrato maggiormente resistente sia dei poliovirus che del virus dell’epatite A in acqua di rubinetto e

marina. Ad esempio, adenovirus è almeno 60 volte più resistente alla radiazione ultravioletta rispetto ai virus enterici ad RNA (Meng and Gerba, 1996, Gerba, 2002) e sopravvive da 3 a 5 volte più a lungo dei poliovirus in acqua marina, con 99 giorni necessari ad una riduzione 2-log di infettività (Enriquez et al., 1995).

La maggior resistenza mostrata dagli adenovirus enterici potrebbe essere associata alla natura del loro DNA a doppia elica, che anche se danneggiato potrebbe essere comunque riparato dai sistemi di riparazione del DNA della cellula ospite infettata (Bernstein e Bernstein, 1991).

Negli ultimi anni (grazie all’avvento delle tecniche molecolari) gli adenovirus sono stati ritrovati in varie matrici idriche come fiumi, acque costiere, piscine e acque destinate al consumo umano (vedi tab.1.4.1.2) e sono stati inseriti dalla United States Environmental Protection Agency nella lista dei possibili contaminanti delle acque destinate al consumo umano. Le loro caratteristiche di elevata resistenza ambientale e diffusione in matrici idriche li rendono più adatti a ricoprire il ruolo di possibili indicatori di inquinamento virale fecale , rispetto ai virus ad RNA come gli enterovirus, e il virus dell’epatite A (Pina et al., 1998).

Oltre al loro possibile impiego come indicatore di contaminazione virale umana di tipo fecale, non bisogna trascurare l’importanza degli adenovirus nel provocare infezioni e malattie legate alla balneazione in acque contaminate. Sono infatti numerosi i casi di epidemie associate ad acque ricreative causate da adenovirus di tipo 7 (Caldwell, 1974, Turner, 1987), di tipo 4 (D’angelo, 1979) e 3 (Martone, 1980).

tab.1.4.1.2 Adenovirus in acque dolci e costiere ( Jiang, 2006) Luogo Matrice Metodo di rilevamento % di campioni positivi Concentrazione di virus/1 l Rifer. Bibliografico Giappone Acqua dolce Colture cellulari - 0-25 PFU Tani et al.1992,1995 Grecia Acque costiere Nested PCR 28 % Pres/ass Vantarakis 1998 Australia Acque dolci, marine Colture cellulari 12% (dolci) 9-24%(mare) Pres-Ass Grohmann et al.1993 Spagna Acqua dolce Nested PCR

100% Pres-Ass Puig et al,1994 Barcellona Acque

costiere Nested PCR 78% Pres/ass Pina et al. 1998

USA Acque dolci ICC-Nested PCR 48% Pres/ass Chapron et al, 2000 Sud Corea Acque

dolci

RT-multiplex

nested PCR 83% Pres/ass Cho et al, 2000

California Acque costiere

Nested PCR

33% Pres/ass Jiang et al. 2001 Nuova

Zelanda

Acque dolci

Nested PCR

67% Pres/ass Greening et al,

2002 Germania Acque

dolci

Nested-PCR

20% Pres/ass Pusch et al.2005 Sud Corea Acque

dolci

Colture cellulari, Nested

RT PCR

32% Pres/ass Lee et al.2004

USA Acque

costiere

Nested-PCR

37% Pres/ass Fong et al.2005

Sud Corea Acque dolci Colture cellulari, ICC-PCR 15,9% (colture cellulari) 30% (ICC-PCR)

Pres/ass Lee et al.2005

Giappone Acque dolci QPCR 45% Pres/ass Haramoto et al.2005 Malibu,

Calif. acque dolci

QPCR

16% >104 copie Choi and Jiang 2005

1.4.2 Norovirus

Il genere Norovirus, assieme agli altri 3 generi Lagovirus, Vesivirus e Sapovirus appartiene alla famiglia dei Caliciviridae, virus piccoli e privi d’involucro (rivestimento) di circa 27-35 nm di forma rotondeggiante leggermente allungata morfologicamente simile ai parvovirus, con capside icosaedrico.(vedi fig. 1.4.2.1)

fig. 1.4.2.1 Norovirus, struttura tridimensionale

Il genoma è costituito da un singolo filamento poliadelinato a polarità positiva, composto approssimativamente da 7,3 (Virus di Manchester) a 7,6 (Virus Norwalk) kb.

Solamente i due generi Sapovirus e Norovirus sono in grado di infettare l’uomo.

Il genoma dei calicivirus è organizzato tipicamente in due o tre aree maggiori ORF (Open Reading Frames) che sono diversamente organizzate nei Norovirus e nei Sapovirus e che li caratterizzano genomicamente. L’analisi della sequenza dei calicivirus isolati in diverse epidemie e in diverse località hanno permesso di dividere i Norovirus in due genogruppi principali e più di 15 genotipi.

Nel genogruppo 1 (GI) vengono classificati, tra gli altri, il Norwalk virus (che è il prototipo del genotipo GI-1), il Southampton Virus (GI-2), il Desert Shield virus (GI-3) e il virus Valletta (GI-4). Del genotipo 2 (GII) fanno parte tra gli altri gli Hawai virus (GII-1), i Snow Montain virus e il virus Melksham (GII-2), il virus Mexico (GII-3) e il virus Grimsby (GII-4).

Norovirus è stato isolato per la prima volta in seguito ad una epidemia di gastroenterite nella città di Norwalk, in Ohio (Alder e Zickl, 1969). Sebbene i campioni fecali fossero stati prelevati nel 1968, i virus furono identificati chiaramente solo nel 1972 in seguito all’uso di anticorpi specifici (Kapikian et al., 1972)..

I Norovirus (precedentemente noti come Norwalk-virus o SRSV) hanno distribuzione cosmopolita e possono essere considerati i principali agenti di malattie gastroenteriche infettive virali nei paesi industrializzati, dove potrebbero essere responsabili del 68-80% delle gastroenteriti (Fankhauser et al., 2002); i CDC stessi stimano che siano almeno 23 milioni ogni anno negli Stati Uniti i casi di gastroenteriti acute dovute a questi virus, che ad esempio solo in Minnesota si sono dimostrati responsabili della quasi totalità delle infezioni alimentari, essendo stati individuati come agenti eziologici nel 96% dei 90 focolai epidemici di natura virale occorsi tra il Gennaio 1996 e il Luglio 1997 (Deneen et al., 2000).

I sistemi di sorveglianza europei indicano i Norovirus come i responsabili di circa il 50% dei casi di gastroenteriti riportati in Inghilterra e in Galles (Dedman et al., 1998); dati del genere provengono anche da Finlandia (Lew et al., 1994), Svezia (Hedlund et al, .2000), Olanda (Koopmans, 2001), Germania (Schreier et al., 2000) e Giapppone (Inouye et al., 2000) a dimostrazione della sua diffusione mondiale.

Soprattutto i genogruppi GGI e GGII sono agenti frequenti di infezioni maggiormente negli anni successivi all’infanzia, a differenza dei rotavirus, ma anche tra i bambini le infezioni da norovirus stanno assumendo sempre maggiore importanza, come dimostra uno studio a coorte prospettica in cui bambini finlandesi sono stati seguiti dall’età di 2 mesi fino ai 2 anni; su 783 campioni di feci raccolti durante la fase acuta di gastroenterite il 20% è risultato positivo per Norovirus (Pang et al., 1999). Secondo altri studi invece la percentuale di bambini in possesso di anticorpi testimonianti una precedente infezione è bassa, mentre cresce rapidamente tra i giovani e mediamente il 60% degli adulti presenta anticorpi.Le infezioni si manifestano tutto l’anno,ma con un andamento stagionale in rapido cambiamento; inizialmente vennero classificate come “malattie

invernali da vomito” proprio per la loro caratteristica di evidenziarsi in maggior misura durante i mesi più freddi dell’anno, successivamente confermata da numerosi studi epidemiologici (20, Mounts et al., 2000; Reisdorf., 2004). Va però rilevato che uno studio recente ha evidenziato un aumento dei casi di gastroenteriti da norovirus nel regno unito durante i mesi primaverili ed estivi.

Tale differenza di picco epidemico sembra dovuta alla diffusione di una nuova variante del genogruppo GII-4(18) che oltre ad avere un picco epidemico diverso sembra possedere un potere di virulenza superiore ai ceppi precedentemente circolanti in europa. Inoltre recenti dati dell’Eurosorveglianza riportano un aumento del numero di casi di gastroenterite da Norovirus nel periodo Ottobre-Novembre 2006 in Germania, Regno Unito, Danimarca ed altri paesi europei (vedi tab. 1.4.2.1)

I Norovirus sono altamente contagiosi ma solitamente non provocano infezioni gravi: la malattia insorge improvvisamente con vomito, diarrea e crampi addominali, disidratandosi se i fluidi persi non vengono sostituiti, ma normalmente la maggior parte delle persone si ristabilisce entro uno o due giorni e non conserva effetti indesiderati a lungo termine.

Tali virus sono escreti attraverso le feci ed il vomito e si trasmettono principalmente attraverso la via oro-fecale, ma possono essere trasmessi anche attraverso il contatto da persona a persona (Baron et al., 1982, Caceres et al., 1998) o in maniera indiretta, tramite superfici contaminate o per trasmissione aerea degli aerosol prodotti durante la fase di vomito; i focolai epidemici si verificano più spesso in presenza di gruppi folti di persone in un’area ristretta, come case di cura, ristoranti, eventi organizzati e a bordo di navi da crociera.

Numerose epidemie da norovirus sono state associate anche al consumo di alimenti contaminati, soprattutto frutti di mare come mitili (Sugieda et al., 1996; Prato et al., 2004), ed ostriche (Berg et al., 2000; Le Guyader et al., 2006), nonché alla contaminazione di acque destinate al consumo umano (Maunula et al., 2005; Godoy et al., 2006).

Tab.1.4.2.1 Dati dell’Eurosorveglianza sull’aumento dei casi di gastroenterite da Norovirus in Europa nel periodo Ottobre/Novembre 2006 (www.eurosurveillance.org/ew/2006/061214.asp)

data via email network Database FBVE (Food Borne Viruses Europe

Network) Numero di casi riportati in

Ottobre e Novembre in seguito a richiesta via mail

Fonte delle informazioni Casi in Ott. e Nov. nel database FBVE Nazione Aumento del numero di casi da NoV in Ottobre e/o Novembre ? 2006 2005 2004 lab database nazional e database nazionale di sorveglianz a 200 6 200 5 200 4 Più recenti informazion i genetiche nel database Bionumeric s Genotipi/variant i trovate in Ott. e Nov.

Germania Si 604 casi 184 casi 514 casi No Si 134 139 0 Nov 2006

4 G II.4 dei quali una variante 2006 b e 3 varianti 2006a, e 4 altri genotipi Danimarc a Si 249 campioni lab 38 campioni lab 222 campioni lab

Si No 0 2 2 Sep 2006 2 II.4, entrambi

varianti 2006a1

Spagna No 2 casi 6 casi 12 casi 1 3 4 Oct 2006 1 II.4, variante

2006°

Finlandia Si ~ 120

casi ~ 10 casi ~ 10 casi Si No 0 2 0 Sep 2006

Francia No 3 casi 1 caso 2 casi Si No 7 1 2 Oct 2006

2 II.4, varianti 2006a , 1 altro genotipo Inghilterr a e Galles Si 768 episodi epidemic i e circa 756 campioni lab 83 episodi epidemic i 281 campioni lab 374 episodi epidemic i e 682 campioni lab Si Si 11 54 69 May 2006 43 G II.4 odei quali 20 2006a, 11 2006b e 12 non a non b; 15 non G II.41*

Ungheria Si 81 casi 17 casi 24 casi Si 21 3 14 Nov 2006

7 G II.4 dei quali 5 varianti 2006b e 2 2006a

Irlanda Si 7 casi 0 casi 22 casi No Si 11 5 40 Oct 2006

1 G II.4 variante 2006a, 1 altro genotipo

Italia sconosciuto 1 0 2 Aug 2006

Olanda Si 36 casi 5 casi 68 casi Si 36 3 54 Nov 2006

26 G II.4 of which 19 2006a and 7 2006b

Norvegia Si ~ 160

casi ~ 65 casi ~ 35 casi Si No 1 7 0

Svezia Si ~ 400 casi ~ 50 casi ~ 350 casi Si No 1 2 0 Oct 2006 1 G II.4, variant 2006°

Slovenia Si 7 casi 6 casi 5 casi Si No 0 5 1 Sep 2006

La capacità di dare luogo ad infezioni clinicamente rilevanti in tutti i gruppi di età e di trasmettersi con diverse modalità, così come l’elevata diversità genetica e l’incapacità di sviluppare nell’uomo una immunità di tipo duraturo fanno si che Norovirus rappresenti un importante problema di sanità pubblica in tutto il mondo.

Negli anni si sono verificate numerose epidemie da Norovirus associate ad acque ricreative: la prima documentata è avvenuta nel Giugno 1977 in una piscina (Kappus, 1982) frequentata da studenti ed insegnanti di una scuola elementare in Ohio; Norwalk virus è stato identificato nell’acqua e attraverso la presenza di anticorpi corrispondenti nel siero di 103 studenti che accusavano vomito (86%) e dolori addominali (70%); tramite la somministrazione di questionari è stato possibile dimostrare che il 70% dei soggetti ammalati aveva nuotato nella piscina il giorno 1 giugno e il 55% il giorno successivo. Nel periodo 1971- 2000 Norovirus è risultato responsabile del 4% dei focolai epidemici occorsi negli Stati Uniti ed associati ad acque ricreative, mentre nel solo biennio 2001-2002 la percentuale è risultata del 10% (Craun et al., 2005). Questo aumento repentino è dovuto soprattutto al miglioramento delle tecniche di rilevamento e dimostra la precedente sottostima dell’importanza di Norovirus come agente eziologico di gastroenteriti legate ad acque destinate ad uso ricreativo.

Nel biennio 2003-2004 Norovirus ha causato il 16,7% dei casi di gastroenteriti associate ad acque ricreative, causando 5 focolai epidemici per un totale di 300 persone infette; di questi casi, uno ha coinvolto, nel Marzo 2004, 140 persone contagiate in seguito ad una gara regionale di nuoto svoltasi in una piscina comunale nello stato dell’Idaho. Un altro focolaio epidemico si è verificato in una scuola elementare dove durante le ore ludiche sono stati utilizzati degli scivoli ad acqua: i bambini si sono infettati dopo che uno di essi, già malato con diarrea, ha utilizzato gli scivoli. La trasmissione secondaria ai familiari ha portato a 42 il numero totale di casi.

La frequenza di epidemie da Norovirus associate ad acque ricreative mette in luce la necessità di un’attenta valutazione dell’occorrenza di tali virus nelle acque stesse attraverso lo sviluppo di tecniche che rendano possibile il monitoraggio ambientale ai fini della prevenzione e del

miglioramento della qualità dell’acqua adibita all’uso ricreativo nonché della salute della popolazione utente