Confocal scanner laser evaluation of bactericidal effect of different antibiotic mixtures used for dental pulp regeneration: a preliminary study

ORIGINAL

ARTICLE/ARTICOLO

ORIGINALE

348

CONGRESSO

NAZIONALE

BOLOGNA

2015

VINCITORE

PREMIO

RICCARDO

GARBEROGLIO

Confocal

scanner

laser

evaluation

of

bactericidal

effect

of

different

antibiotic

mixtures

used

for

dental

pulp

regeneration:

a

preliminary

study

Valutazione

con

il

microscopio

confocale

a

scansione

laser

dell’effetto

battericida

di

miscele

antibiotiche

utilizzate

nella

rigenerazione

pulpare:

valutazione

preliminare

Genta

Elisa

*

,

Alovisi

Mario

,

Cuffini

Anna

Maria

,

Mandras

Narcisa

,

Luganini

Anna

,

Roana

Janira

,

Pasqualini

Daminano

,

Scotti

Nicola

,

Berutti

Elio

1

Universita` diTorino,DipartimentodiScienzeChirurgiche,DentalSchool,Endodonzia,Torino,Italy

2_{Universita` diTorino,DipartimentodiSalutePubblicaeMicrobiologia,Torino,Italy} 3

Universita` diTorino,DipartimentodiScienzedellaVitaeBiologiadeiSistemi,Torino,Italy Received24February2016;accepted5April2016

Availableonline19May2016

KEYWORDS antibiotics; Trimixpulp regeneration; confocalscanner; Triclaritro. Abstract

Aim: Evaluatetheantibacterialefficacyanddepthofactionintodentinaltubulesofdifferent antibioticmixturesusedfordentalpulpregeneration(1-9).

Methodology: Cylindricalspecimensofradiculardentine(n=72),sterilizedwithethyleneoxide, havebeeninfectedwithEnterococcusFaecalis(3107_{CFU/mL)for3weeks(10).Specimens}

wererandomly assigned to3experimentalgroups (n=20)pluspositive (n=6) and negative (n=6)controls.

PeerreviewunderresponsibilityofSocieta` ItalianadiEndodonzia.

* Corrispondenza:ViaA.Guglielmi23,LivornoFerraris(VC).Tel.:+3493884875. E-mail:genta.elisa@gmail.com(G.Elisa).

Disponibileonlineall’indirizzowww.sciencedirect.com

ScienceDirect

jo u rn al ho m e p ag e: ww w. el s ev i e r.c o m /l o ca t e/ gi e

http://dx.doi.org/10.1016/j.gien.2016.04.008

1121-4171/ß2016Societa` ItalianadiEndodonzia.ProductionandhostingbyElsevierB.V.ThisisanopenaccessarticleundertheCCBY-NC-ND license(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introduzione

Alcunemiscelediantibioticisonostateproposteperla

disin-fezionecanalareduranteleproceduredirigenerazione

pul-pare.1—9Lamiscelatuttoravalidatadall’AAEe` ilTRIMIX,ede`

compostadaciprofloxacina,metronidazoloeminociclina.13_E’

statapropostadaHoshinoeminociclina.13E’ statapropostada

HoshinoeSatonel19968_{edhadimostratodiessereefficace}

nell’eliminareipatogeniendodonticisiainvitrocheinvivo.

Tuttavia e` riportato che questa miscela possa facilmente

indurre discromia dentinale.7 L’obiettivo di questo studio

preliminareex-vivoe` statoquellodivalutareallaserconfocale

l’efficacia antibatterica della claritromicina insostituzione

dellaminociclina(TRICLARITRO)nelladisinfezionedelsistema

PAROLECHIAVE antibiotici; Trimix; rigenerazionepulpare; microscopioalaser confocale; Triclaritro.

 TRIMIXgroup(ciprofloxacin,metronidazoleandminocycline)  BIMIXgroup(ciprofloxacinandmetronidazole)

 TRICLARITROgroup(ciprofloxacin,metronidazoleandclarithromycin)

Eachexperimentalgroupwasdividedintwosubgroupsexposedtoantibioticpaste formu-lationsaddedtomacrogol(MG)orialuronicacid(HA).After3weeksoexpositiontoantibiotic formulations,allspecimenswereverticallyfracturedandanalyzedwithconfocallaserscanning microscopy(CLSM)andviabilitystaining(Live/DeadBacLightViabilityStain)toquantitatively evaluate the ratio of dead/live bacteria into dentine tubules (11-12). Volume ratioof red fluorescence(Deadbacteria)wascalculatedinthree-dimensionalreconstructions.Differences among groupswereanalyzed withKruskall-Wallisand post-hoc Dunn’stest (P<0,05).Mean penetrationdepthofactionwasrecordedanddifferenceswereanalyzedwithone-wayANOVA andpost-hocBonferroni’stest(P<0,05).

Results: NosignificantdifferencesregardingbactericidaleffectbetweenTRIMIXand TRICLARI-TROwerereported(P>0,05).AllantibioticmixturesconveyedbyHAshowedabetterefficacy comparedwithMG(P<0,05).

TRIMIXpenetrationmeanwashigherthanTRICLARITROandBIMIX(P<0,05),buttherewere nodifferencesbetweenHAandMGsub-groups(P>0,05).

Conclusions: TRICLARITROantibioticmixtureshowedaneffectiveantibacterialactiondeepinto dentinaltubules,withouttheriskoftoothcrownstaining(10).

ß 2016Societa` ItalianadiEndodonzia.ProductionandhostingbyElsevierB.V.Cetarticleest publie´ enOpenAccesssouslicenceCCBY-NC-ND( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)

Riassunto

Obiettivo: Valutarel’efficacia antibattericaela profondita` d’azione dialcunemiscele anti-bioticheutilizzatenelleproceduredirigenerazionepulpare(1-9).

Materialiemetodi: Sonostatiutilizzatideicampionicilindricididentinaradicolare(n=72), sterilizzaticonossidodietileneeinseguito infettaticonE. Faecalis(3107CFU/ml)per3 settimane(10).Icampionisonopoistatisuddivisiinmanieracasualeintregruppi(n=20)con l’aggiuntadicontrollipositivi(n=6)enegativi(n=6).

 GruppoTRIMIX(ciprofloxacina,metronidazoloeminociclina)  GruppoBIMIX(ciprofloxacinaemetronidazolo)

 GruppoTRICLARITRO(ciprofloxacina,metronidazoleeclaritromicina).

Ognigruppoe` statosuddivisoin2ulteriorisottogruppineiqualilemisceleantibiotichesono stateveicolateconmacrogol(MG)oacidoialuronico(HA).Dopo3settimanediesposizionealle miscele antibiotiche, i campioni sono stati fratturati longitudinalmente ed analizzati con microscopioconfocale(CLSM)ecolorazionevitale(Live/DeadBacLightViability)perquantificare laproporzionetrabatterimortievivi(11-12).Idatidiefficaciatramiteproporzionetravolume fluorescenzarossa(batterimorti)efluorescenzatotalesonostatianalizzaticonKruskallWallise post-hoc Dunn’s Test (P<0,05). E’stata misurata la profondita` di penetrazione nei tubuli dentinali edirisultati sonostati analizzati conone-way ANOVAe post-hocBonferroni’s test (P<0,05).

Risultati: Nonsonostateevidenziatedifferenzestatisticamentesignificativenell’effetto bat-tericidatraTRIMIXeTRICLARITRO(P>0.05).TuttelemisceleveicolateconHAhannodimostrato unamaggioreefficaciaantibattericacomparateconquelleveicolateconMG(P<0.05).

LapenetrazionedelTRIMIXe` risultatamaggiorerispettoaTRICLARITROeBIMIX(P<0.05), mentrenonsisonoriscontratedifferenzetraHAeMG.

Conclusioni: LamiscelaantibioticaTRICLARITROhamostratoun’effettivaefficaciabattericida neitubulidentinali,senzailrischiodidiscolorazionedentale.

ß2016Societa` ItalianadiEndodonzia.ProductionandhostingbyElsevierB.V.Thisisanopen accessarticleundertheCCBY-NC-NDlicense(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/ 4.0/).

canalare.Inoltree` statavalutatal’influenzadell’acido

ialur-onico (HA) o del macrogol (MG) come veicolanti dei mix

antibioticitestati.

Materiali

e

metodi

Settantaduedentimonoradicolaticonapicecompletamente

formato sonostati sezionati orizzontalmente1mm sottola

giunzione amelocementizia.I campioni cilindricidi dentina

radicolarecosı` ottenuti(n=72)(Fig.1)sonostatisterilizzati

conossido di etileneedinfettati conEnterococcus faecalis

(ATCC29212)conunatorbidita` di3107_{CFU/mlinterrenodi}

coltura(BHI,Oxoid,Milan,Italy)esuccessivamenteincubatia

378C per 3 settimane.12 I campioni sono stati suddivisi in

manieracasualeintregruppi(n=20campioniinognigruppo)

confrontatipoiconungruppodicontrollodicampionipositivi

(n=6) eduno di campioni negativi (n=6). In ogni gruppo

i campioni sono stati esposti ad una delle tre diverse

miscele antibiotichetestate:gruppoTRIMIX(ciprofloxacina,

metronidazolo e minociclina), gruppo BIMIX (ciprofloxacina

e metronidazolo) e gruppo TRICLARITRO (ciprofloxacina,

metronidazoleeclaritromicina).Ognigruppoe` statosuddiviso

induesottogruppineiqualiicampionisonostatiespostialle

misceleantibioticheveicolateconmacrogol(MG)oconacido

ialuronico(HA).Dopotresettimaneacontattocongli

anti-biotici,i campionisonostati accuratamente sciacquaticon

soluzionesalinaalfinedirimuoverecompletamentelapasta

antibioticadalcanale.Ognicampionee` statopoiespostoalla

colorazionevitale(Live/DeadBacLightViability

Stain-Molecu-lar probes, Eugene, OR) e dopo esser stato ulteriormente

fratturato (Fig. 2),10 peresporre una superficie di dentina

intonsa,e` statoanalizzatoconilmicroscopioalaserconfocale

(OlympusIX70).11_{Leimmaginiottenutesonostaterielaborate}

con il programma ImageJ (National Institute of Health,

Bethesda,MD)(Fig.3).Idatidiefficaciatramiteproporzione

trafluorescenza rossa(batteri morti)sufluorescenzatotale

verde(batterivivi)erossaedipenetrazioneneitubuli

denti-nalisonostatianalizzaticonANOVAeconKruskallWallise

post-hocDunn’sTest(P<0,05).

Risultati

Idatiriguardantilaprofondita` dipenetrazioneel’efficacia

antibattericaneivarigruppisonoriportatiinTab.1.

Confrontotramisceleantibiotiche

Entita` dipenetrazione

Ledifferenzerelativeall’entita` dipenetrazionetrale

mis-celeantibiotichesonostateanalizzatemedianteiltestAnova

esonorisultate statisticamentesignificative(P<0,05).La

miscelaantibioticaTRIMIXhadimostratounapenetrazione

piu` inprofondita` rispettoallealtreduemisceleantibiotiche.

Ledifferenzenellapenetrazionesonostatevalutateanche

conunacomparazione dellemiscele a coppieedanche in

questocasosonostateriscontratedifferenzestatisticamente

significativenell’entita` dipenetrazionetralamiscelaTRIMIX

elealtreduemiscele,comeriportatoinTab.2.

Figura2 Icampionisonostatisezionativerticalmenteedulteriormentefratturaticonl’ausiliodiunbisturiperesporreunaquotadi dentinaintonsaperl’analisiCLSM.

Figura1 preparazione del campione: sezione 1mm apical-menteallaCEJedeliminazionedelterzoapicaledellaradiceper crearesezionididentinadiformacilindricadialtezza4mm.

Efficaciaantibatterica

Ledifferenzenell’efficaciaantibatterica (Deadratio)sono

stateanalizzatecomparandolapercentualedifluorescenza

rossaconlafluorescenzatotaleverdeerossa.Irisultatisono

statianalizzatimedianteilKruskal-Wallistest.Ildeadratio

dellemisceleTRIMIXeTRICLARITROnone` risultato

statisti-camentesignificativotra loro (P=0,502),ma

significativa-mentemaggiorerispettoaBIMIX(Tab.3)(P<0,05).

Confrontotraveicolanti

Entita` dipenetrazione

Lapenetrazionedellemisceleantibiotichee` statavalutata

anchecomparandoiduediversiveicolanti:acidoialuronico

(HA)emacrogol(MG).Nonsonostateriscontratedifferenze

nell’entita` dipenetrazionetraiduediversiveicolantinella

miscelaTRICLARITRO(p=0.28)cosı` comenellemiscele

TRI-MIX(p=0.019)eBIMIX(p=0.36)(Tab.4).

Efficaciabattericida

Idatiriguardantil’efficaciabattericidasonostatianalizzatie

sono state riscontrate differenzestatisticamente

significa-tiveintuttiigruppi.LamiscelaTRICLARITROveicolatacon

acidoialuronicoha mostrato unamiglioreefficacia

batter-icidacomparataconlastessamiscelaveicolataconmacrogol

(p=0.013),cosı` come lamiscelaTRIMIX(p=0.019)eBIMIX

(p=0.012)veicolateconacidoialuronico(Tab.5).

Figura3 leimmaginimostranoleacquisizionialconfocaledeicampionitrattaticonTRICLARITROHA.A)batterivivi(coloraticon Syto9);B)batterimorti(coloraticonPI);C)acquisizioniMERGE(ImageJsoftware).

Tabella1 Riassuntodei datidipenetrazioneedefficacia antibattericaneidiversigruppi.

GRUPPI PENETRAZIONE MEDIA(mm) FLUORESCENZA ROSSA/TOTALE FLUORESCENZA VERDEEROSSA(%) BIMIXHA 202,37 48% BIMIXMG 168,8 45% TRICLARITROHA 268,25 64% TRICLARITROMG 246,01 51% TRIMIXHA 424,81 59% TRIMIXMG 766,54 51%

Tabella2 confrontodelledifferenzedipenetrazionetrale diversemisceleantibiotiche.

CONFRONTO DIFFERENZA q PVALUE TRIMIXvsBIMIX 385,69 6,990 P<0,001 TRIMIXvsTRICLARITRO 315,88 5,572 P<0,01 BIMIXvsTRICLARITRO -69,812 1,231 P>0,05

Tabella3 confrontodelledifferenzediefficacia antibat-tericatralediversemisceleantibiotiche.

CONFRONTO DIFFERENZA PVALUE

TRIMIXvsTRICLARITRO 0.02 P>0.05 TRIMIXETRICLARITROvsBIMIX 0.5 P<0.05

Tabella5 confrontodelledifferenze diefficacia antibat-tericatralediversemisceleantibiotiche.

CONFRONTO DIFFERENZA PVALUE

TRIMIXHAVSTRIMIXMG 0.09 0.019 TRICLARITROHAVS

TRICLARITROMG

0.12 0.013

BIMIXHAVSBIMIXMG 0.15 0.0125 Tabella4 confrontodelledifferenzedipenetrazionetrai diversiveicolanti.

CONFRONTO DIFFERENZA PVALUE TRIMIXHAvsTRIMIXMG 254,68 P=0.119 TRICLARITROHAvs

TRICLARITROMG

50,79 P=0.285 BIMIXHAvsBIMIXMG 42,38 P=0.361

Discussione

e

Conclusioni

Lostudiodanoieffettuatosiponeincontinuazionediquello

gia` effettuatoda Mandrasetal.9 eche hatestatoin vitro

l’efficacia di quattro miscele antibiotiche: TRIMIX, BIMIX,

TRIFOSFO E TRICLARITRO. Pertanto lo scopo e` di valutare

sel’applicazionediclaritromicinanellamiscelaantibioticaal

postodellaminociclinapossaavereun’efficaciaparagonabile

nelladisinfezionecanalareenellaprofondita` dipenetrazione

nei tubulidentinalieliminandol’effetto indesideratodella

discromiadentale.

Lametodicadiosservazioneutilizzatainquestostudiosi

basa su un modello tridimensionale in vitro per valutare

quantitativamente la presenza dei batteri all’interno dei

tubulidentinalidopoladisinfezionetramiteilmicroscopio

a laser confocale (CLSM). Il metodo CLSM richiede una

preparazione dei campioni relativamente semplice ed e`

considerata piu` accurata rispetto a quella della coltura

batterica.Ladistribuzionedeibatterielaloro vitalita` puo`

essere quantificata sia verticalmente sia orizzontalmente

all’internodellaradiceeperognicampionepossonoessere

analizzatediversesezioni.10—11Lafluorescenzarossa,

corris-pondente aibatteri morti, e` statavalutata sulleimmagini

ottenuteconlascansioneCLSM.L’efficaciaantibattericae`

stataottenutarapportando lafluorescenzarossaalla

fluor-escenzatotaleverdeerossa.

Irisultatihannodimostratounafluorescenzarossa

mag-giore,e dunqueunamaggioreazione antibatterica,per le

miscele TRIMIX e TRICLARITRO. Questo effetto puo` essere

riconducibileadunamaggioreefficaciadellemisceleditre

antibiotici(TAP)rispettoaquelledidue(DAP).14In

partico-larelapastaantibioticaTRICLARITROhamostrato

un’effet-tivaefficaciaantibattericainprofondita` neitubulidentinali.

Le miscele antibiotiche veicolate con acido ialuronico

hannomostratoun’efficaciaantibattericamaggiorerispetto

a quelle veicolate con macrogol, probabilmente a causa

dell’effettoreservoirsvoltodall’acidoialuronicoche

perm-etteunrilasciopiu` gradualedell’antibiotico.Inconclusione

lanuova miscelaTRICLARITROHArappresentadunqueuna

validaalternativarispettoalla miscelatradizionale TRIMIX

MG nel protocollo di terapiarigenerativa, facilitandone le

procedurecliniche.

Rilevanza

clinica

Laproblematicaclinicamaggioredellamiscelatradizionale

TRIMIXe` ladiscromiadentinaleindottadallapresenzadella

minociclinanellaformulazionedell’antibiotico.Nonostante

alcuniautoriabbianopropostoaccorgimentiperridurretale

effetto collaterale, questo non viene eliminato (15). La

peculiarita` dellamiscelasperimentaleTRICLARITROe` invece

quella di non avere l’effetto collaterale della discromia

dentalepoiche´ laminociclinavienesostituitadalmacrolide

claritromicina.

Irisultatidellostudiodanoicondottohannomostratouna

effettiva efficacia battericida della miscela TRICLARITRO,

paragonabile a quella dellamiscela TRIMIX, eliminando la

problematicadelladiscromiadentale.Larilevanzaclinicadi

questorisultato e` quella dipoter usufruire, nel protocollo

rigenerativo, di unamiscela antibiotica ad elevato potere

battericidaeliminandoneilprincipaleeffettocollaterale.

Conflitti

di

interesse

Nell’esecuzione e nei risultati del lavoro non sono stati

riscontraticonflittidiinteresse.

Ringraziamenti

Undoveroso ringraziamentovaatuttiidipartimenti

inter-venuti nella realizzazione di questostudio. Un altro

ring-raziamentovaalDott.PietroCostamagna,Lecturerpressoil

RepartodiEndodonziadellaDentalSchooldiTorino,perilsuo

preziosoaiutonellasperimentazione.

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