INDICE
RIASSUNTO ... 1
ABSTRACT ... 4
CAPITOLO 1: INTRODUZIONE ... 7
1.1 I tumori ereditari ... 7
1.1.1 Tumore ereditario della mammella e dell’ovaio... 8
1.1.2 Sindrome di Lynch ... 14
1.1.3 Appartenenza del tumore della mammella allo spettro fenotipico della sindrome di Lynch di tipo II ... 17
1.2 Mantenimento dell’integrità genomica nei tumori ... 19
1.3 Meccanismi di riparazione del DNA ... 19
1.3.1 Ricombinazione omologa ... 21
1.3.2 Giunzione delle estremità non omologhe ... 23
1.3.3 Mismatch repair ... 24
1.4 BRCA1 ... 28
1.4.1 Il gene e la proteina ... 29
1.4.2 Le mutazioni di BRCA1 ... 30
1.4.3 Varianti di significato incerto ... 32
1.4.4 Espressione cellulare e regolazione ... 36
1.4.5 Funzioni di BRCA1 ... 37
1.5 MSH2 ... 41
CAPITOLO 2: SCOPO DELLA TESI ... 46
CAPITOLO 3: MATERIALI E METODI ... 48
3.1 Selezione dei pazienti ... 48
3.2 Estrazione del DNA ... 49
3.3 PCR ... 51
3.4 Purificazione dei prodotti di PCR ... 53
3.5 Sequenziamento ... 54
3.6 MLPA ... 55
3.7 Immunoistochimica ... 58
3.8 Ceppi di Saccharomyces cerevisiae ... 58
3.8.1 Ceppo RS112 ... 58
3.8.2 Ceppo RSY6 ... 59
3.8.3 Ceppo RSY6msh2∆ ... 59
3.9 Plasmide pYES2 ... 60
3.10 Mutagenesi sito specifica ... 61
3.11 Preparazione del DNA plasmidico ... 65
3.12 Terreni di coltura ... 65
3.13 Trasformazione di Saccharomyces cerevisiae ... 67
3.14 Saggio di ricombinazione intra ed intercromosomica ... 68
3.15 Saggio di ricombinazione omologa e reversione ... 69
3.16 Western Blot ... 70
3.16.1 Estrazione delle proteine ... 70
3.16.2 Quantificazione delle proteine ... 71
3.16.4 Blotting ... 74
3.16.5 Rivelazione ... 74
CAPITOLO 4: RISULTATI ... 75
4.1 Analisi mutazionale, dei grandi riarrangiamenti e dell’espressione proteica di MSH2 in carcinomi mammari e/o ovarici di pazienti carrier di VUS del gene BRCA1 ... 75
4.1.1 Analisi mutazionale del gene MSH2 ... 76
4.1.2 Analisi dei riarrangiamenti del gene MSH2 ... 82
4.1.3 Analisi dell’espressione proteica di MSH2 ... 84
4.2 Analisi mutazionale e dei riarrangiamenti del gene MSH2 in pazienti affetti da tumore della mammella e del colon e/o dell’endometrio e/o altri tumori con storia familiare di carcinoma mammario e/o ovarico e wild type per i geni BRCA1 e BRCA2 ... 85
4.2.1 Storia personale e familiare dei pazienti ... 86
4.2.2 Analisi mutazionale del gene MSH2 ... 91
4.2.3 Analisi dei riarrangiamenti di MSH2 ... 93
4.3 Effetto dell’espressione delle varianti missenso di BRCA1 sulla ricombinazione intra ed intercromosomica nel ceppo RS112 di Saccharomyces cerevisiae ... 94
4.4 Effetto dell’espressione delle varianti missenso di BRCA1 sulla ricombinazione intracromosomica e sulla mutazione nei ceppi RSY6 e RSY6msh2∆ di Saccharomyces cerevisiae ... 96
4.5 Espressione di BRCA1 nei ceppi RS112, RSY6 e RSY6msh2∆ ... 99
CAPITOLO 5: DISCUSSIONE ... 101
