Caratterizzazione genotipica e sierologica di Listeria monocytogenes isolata da alimenti e ambienti di lavorazione

22 July 2021

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Caratterizzazione genotipica e sierologica di Listeria monocytogenes isolata da alimenti e ambienti di lavorazione

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CAR,ATTER.IZZAZXONE

CENOTXPICA

E SIEROI-OGIC

A D\ LISTERT,A

MONOCYTOGENES

ISOI,ATA.

DA ALIMENTI E AMBIENTI DX

LAVORAZIONE

GENOTYPIC CHARACTERIZATION OF LISTEruA MONOCYTOGENES

ISOLATED FROM FOODSAND FOOD ENVIRONMENTS

Conter M., Di Ciccio P. r, Zanardi E., D'Orio V r, Ghidini S., Vergara A. r, Ianieri A Dipartimento di Produzioni Animali, Biotecnologie Vererinarie, Qualità e Sicurezza degli

Alimenti, Università degli Studi di Palma

rDipartimento di Scienze degli Alimenti. Università degli Studi di Teramo

Summary. Fifty-one strains of Listena nxonocytogenes previously isolated from foods and food environments were serotyped and three new multiplex PCRs were used to detect the maln virulence genes. These results were analyzed statistically in order to unders|and if correlations exist between the presence ofvirulence genes, serotype and food. The majority ofthe strains belonging to serot5'?e l/2a and all the strains belonging to serotype 4b were isolated from fish or fish environment. On the contrary, the majorify of the strains belonging to serotype 1/2b aú all the shains belonging to serotlpe l/2c were isolated from meat and meat environment. All tested stains showed the presence of all virulence genes, suggesting that all the strains could be virulent. Îhe actA Eer,e showed a potymorphism that could be related to a different level ofstrain pathogenicity, but this asPect should be furtber inv€stigated by in vivo or in viho tests. Statistical analysis showed a corelation between food matrix, serotype and one ofthe two forms ofacl gene. In parlicular, fish matrix was related to the foîm of acÍA gene of 268 bp and to the serotype 4b, fiequently isolated from cases of human illness.

Key words: ,,J/eria tnonocytogenes; genotypic characterization, multiplex PCR, virulence factors, serot)?e.

INTRODUZIONE

Listeria monocytogenes è un microîganismo patogeno per l'uomo e gli animali, associato ad alimenti di origine animale (1, 2). L'incidenza della patologia nell'uomo è generalmente bassa, ma a causa della severità della malattia e dell'alto tasso di mortalità, negli ultimi anni si sta rivolgendo una grande attenzione allo srudio delle sue propdetà di virulenza (3, 4). L'incidenza della malattia dipende da numerosi fattori, compresi, la dose infettante e 10 stato immunitario dell'ospite (3,4). Inoltre, è stata ampiamente dimostrata la variabilità nella virulenza a seconda dei ceppi in causa (5, 6). La virulenza di L. monocytogenes è dovuta all'espressione di numerosi geni responsabili della penetrazione all'intemo delle cellule, della proliferazione e della diffirsione da cellula a cellula. La comprensione e la valutazione del rischio posto da questo patogeno richiede, quindi, il rilevamento e l'identificazione di questi geni accanto ad alhe caratteristiche dei ceppi quali, ad esempio, il sierotipo di

apparteîenza. Dei tredici sierotipi identificati, infatti, solamente 3 (l/2a,ll2b e 4b) sono associati con la maggior parte dei casi clinici nell'uomo, mentre il sierotipo 4b è quello piÌr frequentemente isolato da focolai epidemici (7, 8). L applicazione di tecniche molecolad e, in particolare, della reazione polimerasica a catena (PCR) permette di ottenere questi dati in tempi rapidi e dduce i costi delle analisi (9).

3 l J

Nel presente lavoro sono ripoÉatì i risultati della caratlerizzaz'tone

genotlplca e si.-iogi.u ai ceppi di I. nlonocytogenes isolatr da alim-enti dì origine lttrca e surna e dai relativi ambienti di tuuotu'ió"tlLa prima è- stata effettuata mediante lo sviluppo di tre nuove PCR multiplex che consentono l'identificazione di genere' dì specìe

e la ;;;;;;t;;"" dehnizìone dei princilaii.geni associati alla,'"irulenza lnfine è stata analizzatala corelazione tra caratteristichi geneticl.re' matrice e sierotipo'

sierotipizzazione usando Listeria Antisera .) in aócordo con le istruzioni fomite dal ó mediante ìl kit "High Pure PCR Template

cicli di 94"C Per 80 sec, 55'C 90 sec e minuti. La seconda amplifrcazione per il

ver. 13.0 (Chicago, Illinois)' RISULTATI

J I J

t prodotti dell'amplificazione di tutti i geni considerati erano presenti in tutti i ceppi, ad esclusione del ceppo AfCC l9l 14 (4a) che non mostrava la presenza dei frammentì relativi a iap eaplcl. Inoltre, tutti i prodotti dell'amplificazione erano delle dimensioni attese (tabella 1). E da notare che I'amplificazione del gene acîA, uno dei principali geni responsabili della virulenza, che media la motilità intra- e intercellulare (3) ha dato amplifrcati di due diverse dimensioni. 1176,5% degli isolati, compresi i ceppì di riferimento ATCC 7644, 15313, 19111 e 19115, mostrava un prodotto di 385 pb, mentre il rcstante 23,5yo, compresi i ceppi di riferimento ATCC 19114 e NCTC

1 1994, mostrava un prodotto di 268 pb. DISCUSSIONE

L'analisi delle corrispondenze multiple (MCA) ha permesso di rilevare una correlazione tra il sierotipo e la matrice. In questo studio, infatti, emerge la netta predominanza del sìerotipo ll2a che, nella maggioranza dei casi, viene isolato da ambienti e prodotti ittici e, meno frequentemente, anche dalle carni e dai relativi ambienti di lavorazione. Il sierotipo 4b, sebbene sia quello meno frequente, viene, inoltre, isolato esclusivamente da ambienti e prodotti ittici. Infine, è netta l'associazione tra i sierotipi l/2b e Il2c ele cami e i relativi ambienti di lavorazione. Questi dati sono in accordo con quanto dportato da altri autori (12, 13,14)

Relativamente alle multiplex PCR, considerando che i geni di virulenza presi in esame sono stati rilevati in tutti i ceppi isolati, non è stato possibile poter associare questo dato né al sierotipo, né alla fonte del ceppo. In effetti, alcuni ricercatori hanno riievato la presenza dei geni responsabih della virulenza in ceppi isolati da patologia nell'uomo (i1, 15) e da alimenti (16,17). Nonostante la scarsità di studi presenti ìn letteratura, i ceppi isolati da alimenti presentavano, rispetto a quelli umani, una variabilità più marcata nella presenza di tali geni. A tale proposito rimane da approfondire se effettivamente i ceppi non presentassero i geni oppure se i protocolli urtllizzafi non ne consentissero l'amplificazione, anche a causa del polimorfismo dimostrato per alcuni di essi (6, 18).

I primer utilizzati per l'amplifrcazione di actA hanno permesso di evidenziare il polimorfismo presente per questo gene. Wiedmann et al., (6) riportano che le diverse

forme di actA potrebbero essere associate a una diversa virulenza dei ceppi, anche se questo aspetto andrebbe testato con metodi in vitro o ìn vivo' Nel nostro studio, la

îorma di actA di 268 pb è stata più spesso isolata da ceppi provenienti da ambienti e prodotti ittici e non è mai stata isolata da ceppi di origine carnea. Inolhe, I'MCA rivela che la forma di actA di 268 pb è altamente correlata con il sierotipo 4b che, come ampiamente riportato in letteratura, risulta essere il sierotipo più frequentemente isolato da casi di malattia nell'uomo (7, 8). Franciosaet al., (15) non avevano rilevato nessuna correlazione tra sierotipo e una delle due forme di actA, ttllavia, in questo studio, erano stati considerati 27 ceppi esclusivamente di origine clinica e di due soli sierotipi (ll2a e 4b).

In conclusione, risulta evidente la correlazione tra la maÍice da cui il ceppo viene isolato ed il sierotipo. In particolare emerge che i sierotìpi ll2a e 4b sono legati soprattutto all'ambiente ittico, menhe è maggiore I'associazione tra i sierotipi 1/2b e

ImmunitY

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Tabella l: Sequenze dei primer utilizzati.

Gene Sequenze (5'-3') Dimensioni

bersaglio dell'amplificato (pb)

hM

CAG CAG CCG CCG TAA TAC CTC CAT AAA GGT GAC CCT CCT AAG ACC CCA ATC GAA AAG CGC TTG CAA CTG CTC CCT AGC AGG TCT AAC CGC AC TCG CTA ATT TCG TTA TGC CC AAA GCA CCA TTT CAT CCC AG ACA TAG CCT TCT TTG GTC GG GAC GAA AAT CCC CAA CTG AA CTAGCG AAG GTG CTG TTT CC CGA GCA A,.rAúd\ CAG CAA CGA TA CCG CCG ACA TCT TTT AAT GT GGG AAA TTT GAC ACA GCG TT ATT TTC GGG TAC TCC CCT TT 9 3 8 702 255 146 268 o 385 192 261

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