miR103 e miR-107 sono coinvolti nella regolazione dell'espressione di CDK5R1/p35 implicato nella migrazione neuronale.

(1)

miR-103 E miR-107 SONO COINVOLTI NELLA REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE DI

CDK5R1/p35 IMPLICATO NELLA MIGRAZIONE NEURONALE

S. Moncini

1

_{, A. Salvi}

2

_{, M.Venturin}

1

_{, A. Nicolin}

3

_{, G. De Petro}

2

_{, S. Barlati}

2

_{, P. Riva}

1

.

1

_{Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche - Università degli Studi di Milano, Milano.}

2

_{Divisione di Biologia e Genetica, Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologie – Università degli Studi di Brescia, Brescia.}

3

_{Dipartimento di Farmacologia, Chemioterapia e Tossicologia Medica - Università degli Studi di Milano, Milano.}

Università degli Studi di Milano

Università degli Studi di Brescia

CONCLUSIONI

Sono stati predetti numerosi siti di legame per differenti

miRNA nel 3’-UTR di CDK5R1.

L’analisi di 5 miRNA tramite Real-Time PCR indica

una correlazione inversa tra l’espressione di p35 e dei miR-103 e miR-107.

L’overespressione dei miR-103 e 107 in cellule

SK-N-BE porta ad una diminuzione dei livelli di p35, mentre la sua down-regolazione porta ad un aumento della proteina.

miR-107 agisce direttamente sul messaggero di

CDK5R1 come un regolatore post-trascrizionale negativo durante la traduzione.

L’overespressione dei miR-103 e 107 riduce la capacita’

di migrazione di cellule SK-N-BE.

E’ stato identificato un sito di legame per miR-103/107

attivo nel 3’UTR di CDK5R1.

BIBLIOGRAPHY

•Moncini S, Bevilacqua A, Venturin M, Fallini C, Ratti A, Nicolin A,

Riva P. The 3' untranslated region of human Cyclin-Dependent Kinase 5 Regulatory subunit 1 contains regulatory elements affecting transcript stability.BMC Mol Biol. 2007 Dec 3;8:111.

Predizione di siti target per microRNA nel 3’-UTR di CDK5R1

Sono stati predetti numerosi siti di legame di microRNA (miRNA) tramite PicTar. Tra i miRNA predetti, sono stati scelti per il successivo studio quelli che presentavano un maggior numero di siti con energia libera di legame <-20 kcal/mol e che risultavano espressi nelle linee cellulari di interesse in uno studio preliminare.

-19.4 1 (0) (1) has-miR-101 -20.7 -23.6 2 (2) (0) has-miR-148b 2 (2) (0) -20.0 -21.4 has-miR-148a -25.0 -15.6 -20.7 3 (2) (0) has-miR-152 -20.3 -23.2 -20.1 -20.5 4 (4) (0) has-miR-183 4 (1) (0) -17.2 -22.5 -15.4 -17.9 has-miR-25 -21.1 -15.8 -22.0 3 (2) (0) has-miR-301 4 (2) (1) -22.4 -18.2 -23.1 -13.8 has-miR-23b -24.4 -18.7 -24.5 -13.8 4 (2) (1) has-miR-23a 3 (2) (0) -20.7 -17.6 -20.0 has-miR-27a -16.1 -21.5 -24.8 -15.9 -21.9 -24.6 6 (4) (0) has-miR-130b 6 (2) (1) -16.1 -22.1 -16.4 -15.4 -19.1 -22.4 has-miR-130a -25.3 -21.2 -22.2 -19.4 -18.2 -23.5 -23.9 -24.5 -24.2 -16.8 10 (7) (2) has-miR-103 11 (7) (3) -25.3 -21.2 -22.2 -19.9 -19.4 -19.4 -24.9 -24.3 -23.5 -24.5 -16.8 has-miR-107 -20.7 -22.6 -18.2 -22.8 4 (3) (1) has-miR-27b 6 (1) (1) -16.9 -18.3 -20.0 -11.3 -17.3 -17.3 has-miR-33 -20.9 -21.0 -20.3 -16.8 -19.4 -23.1 -20.1 -18.6 -19.0 -24.7 -17.9 11 (6) (3) has-miR-15a -19.2 -22.5 -17.6 -18.6 -16.8 -18.2 -19.7 -18.1 -16.3 -17.1 -22.5 -16.1 -16.0 13 (2) (5) has-miR-15b -19.3 -19.1 -18.4 -15.1 -19.5 -23.2 -18.9 -22.8 -17.3 -16.3 10 (2) (5) has-miR-16 12 (2) (4) -16.9 -17.5 -18.6 -18.7 -17.3 -18.6 -20.6 -17.6 -21.1 -16.4 -17.4 -19.0 hsa-miR-195

Free energies (kcal/mol) # of sites microRNA R 1 R 1Δ S 1 _R2 R 2Δ S 2/ 3 R 3 R 3Δ S 4 R 3 R 4Δ S 5/ 6 R 4 R 4Δ S 7 R 4 R 4Δ S 8 R 5 R 5Δ S 9 R 6 R 6Δ S 10 R7 R 7Δ S 11 0 20 40 60 80 100 120 n o rm al is ed lu ci fe ra se a ct iv it y (% ) CDK5R1 mRNA 3’-UTR S1 S2/3 S4 S5/6 S7 S8 S9 S10 S11 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 * * A B 0 20 40 60 80 100 120

no UTR UTR UTRΔS1 UTRΔS8

% n o rm al is ed lu ci fe ra se a ct iv it y * 0 20 40 60 80 100 120 140 R1 R4 % n or m al is ed lu ci fe ra se a ct iv ity lipo miR-34a miR-103 miR-107 C D * * 0 20 40 60 80 100 120

lipofectam ine pre-m iR-103 pre-m iR-107

% n or m al is ed lu ci fe ra se a ct iv ity pgl4.71P-UTR 1 2 3 4 5 6 140 120 100 80 60 40 20 0 1. SKNBE 48h 2. Lipofectamine 48h 3. 50 nM pre-miR-107 48h 4. 100 nM pre-miR-107 48h 5. 50 nM pre-miR-103 48h 6. 100 nM pre-miR-103 48h p35 GAPDH - 3 5 kDa - 38 kDa 1 2 3 4 5 6 p35 GAPDH - 3 5 k Da - 38 kDa 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1. SKNBE 48h 2. Lipofectamine 48h 3. 50 nM anti-miR-107 48h 4. 100 nM anti-miR-107 48h 5. 50 nM anti-miR-103 48h 6. 100 nM anti-miR-103 48h 100 80 60 40 20 0

Identificazione di una correlazione inversa di espressione

tra p35 e miRNA

Una Real-Time PCR su 5 miRNA maturi ha mostrato una correlazione inversa di espressione tra p35 e i miR-103 e miR-107, che potrebbe indicare un possibile effetto negativo di questi miRNA sull’espressione di CDK5R1.

miR-103 e 107 sono paraloghi e differiscono nella loro

sequenza matura per una sola base, per questo legano gli

stessi siti nel 3’UTR di CDK5R1.

Sono espressi ubiquitariamente ma ad alti livelli nel

cervello. cervello. 0 20 40 60 80 100 120 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 60 70 SK-N-BE SH-S Y5Y HEK-293 DU-14 5 MC F-7 N or m al is ed g en e ex pr es si on 0 200 400 600 800 1000 miR-103 miR-107 miR-15a miR-16 miR-195 miR-34a 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 p3 5 no rm al is ed p35 β-actin 0 20 40 60 80 100 0 0,5 1 p35 m iR -1 03 0 2 4 6 8 0 0,5 1 p35 m iR -1 07 0 10 20 30 0 0,5 1 p35 m iR -1 95 0 10 20 30 0 0,5 1 p35 m iR -1 5a 0 500 1000 0 0,5 1 p35 m iR -1 6 0 20 40 60 0 0,5 1 p35 m iR -3 4a r = - 0,48 r = - 0,71 r = - 0,40 r = - 0,75 r = - 0,80 r = 0,66

Molecole precursori dei miR-103 e 107 (pre-miR-103 and pre-miR-107) o i loro inibitori (anti-miR-103 e anti-miR-107) sono state trasfettate a diverse concentrazioni (50nM e 100nM) in cellule di neuroblastoma SK-N-BE per valutarne l’effetto sulla proteina endogena p35. Dopo 48h dalla trasfezione i precursori portano ad una riduzione

significativa di p35

(normalizzazione su

GAPDH), mentre un

aumento dei livelli della

proteina e’ stato

osservato dopo

trasfezione degli

inibitori. Questi dati

suggeriscono un effetto

dei miR-103 e 107

sull’espressione di

CDK5R1 in cellule SK-N-BE.

E’ stata inoltre verificata

una diminuzione dei

livelli dell’mRNA di

CDK5R1 dopo

trasfezione con pre-miR-107

Tramite PicTar sono stati predetti 11 possibili siti di legame per i miR-103 e 107 all’interno del 3’-UTR. Di questi, 2 coppie di siti (S2 e S3, S5 e S6) sono parzialmente sovrapposti e quindi vengono trattati com un unico sito (S2/3 e S5/6). Il 3’-UTR è stato suddiviso in 7 regioni (chiamate da R1 a R7), ognuna contenente uno o due siti di legame (figura A). Ogni frammento è stato clonato nel plasmide luciferasico pGL4.71P e inoltre sono stati generati i rispettivi costrutti in cui la regione di legame è stata deleta. I costrutti sono stati trasfettati in cellule SK-N-BE per studiare l’attività dei miRNA endogeni su ogni sito di legame. La comparazione tra i costrutti wild-type e quelli deleti mostra un significativo aumento dei livelli di attività luciferasica (p<0.05) dopo la delezione di S1 e S8 suggerendo un loro contributo nella down-modulazione del gene reporter (figura B).

Per verificare l’interazione dei miR-103 e miR-107 direttamente con il 3’-UTR di CDK5R1, cellule SK-N-BE sono state

cotrasfettate con un costrutto

contenente l’intero 3’-UTR a valle del

gene della luciferasi di Renilla

(pGL4.71P-UTR) e con 100nM

pre-miR-103 or pre-miR-107. La

cotrasfezione con i precursori porta ad

una diminuzione dell’attività

luciferasica rispetto al non trattato,

suggerendo un’azione diretta su

CDK5R1 mediante il legame con il suo 3’-UTR.

miR-103 e miR-107 interagiscono con il 3’-UTR di

CDK5R1 attraverso il legame con il sito1

miR-103 e miR-107 modulano l’espressione di CDK5R1 in

cellule SK-N-BE

S1 e S8 sono stati anche deleti dal plasmide pGL4.71P-UTR, ma in questo caso solo S1 ha mostrato un aumento di attività luciferasica (figura C). I costrutti R1, contenente S1, e R4, contenente S8, sono stati anche cotrasfettati con i pre-miR-103 e pre-miR-107. Pre-miR-34a e’ stato usato come controllo in quanto non presenta siti di legame nel 3’-UTR di CDK5R1.

l’attività luciferasica di R1 diminuisce

significativamente dopo trasfezione con miR-103 o miR-107, mentre il costrutto R4 non varia. Questi dati suggeriscono un’azione di regolazione su CDK5R1 dei miR-103 e 107 tramite il legame col sito S1.

* * * 120 100 80 60 40 20 0 T0h T8h T24h SKNBE Lipofectamine 100 nM miR107 50 nM miR107 50 nM miR103 100 nM miR103 M ig ra zi o n e ce llu la re ( % )

p35 svolge un ruolo fondamentale nella migrazione neuronale. Per questo motivo è stata valutata la capacità dei miRNA di interferire con la capacità di migrazione di cellule SK-N-BE. La capacità di migrazione di cellule trasfettate con pre-miR-103 e pre-miR-107 viene significativamente ridotta.

miR-103 e miR-107 riducono la capacità di

migrazione di cellule SK-N-BE.

T24h T8h Lipofectamine 100 nM miR107 50 nM miR107 50 nM miR103 100 nM miR103 SKNBE SKNBE Lipofectamine 100 nM miR107 50 nM miR107 50 nM miR103 100 nM miR103 Lipofectamine 100 nM miR107 50 nM miR107 50 nM miR103 100 nM miR103 SKNBE Magnification 20x T0h Pre-miR-107 e ant-miR-107 sono stati trasfettati in cellule

SK-N-BE. Dopo 48h i complessi mRNA/polisomi sono stati separati per centrifugazione su gradiente di saccarosio, dividendo cosí I polisomi che contengono la frazione di mRNA tradotto efficientemente, dalla frazione subpolisomale che contiene I trascritti non tradotti (mRNAs liberi, RBPs, subunità ribosomali, monosomi). Dopo trasfezione con pre-miRNA-107 si osserva uno spostamento del trascritto di CDK5R1 dalla frazione polisomale a quella subpolisomale, indicando che il miR-107 agisce direttamente come un regolatore post-trascrizionale negativo durante la traduzione. Al contrario la trasfezione con l’anti-miR-107 muove l’mRNA verso la frazione polisomale, indicando un aumento della traduzione.

Real-Time PCR sull’mRNA di CDK5R1 nelle

frazioni polisomali e subpolisomali

Il clonaggio del 3'-UTR di CDK5R1 a valle del gene della luciferasi causa una diminuzione dell’attività luciferasica in quattro linee cellulari trasfettate. Sono state identificate delle regioni del 3'-UTR che riducono l’espressione del gene reporter, alle volte in modo linea-specifico. I dati suggeriscono la presenza di elementi regolatori sia destabilizzanti che stabilizzanti. Questa e’ la prima evidenza di un coinvolgimento del 3'-UTR nella modulazione dell’espressione di CDK5R1. La fine modulazione dell’espressione di CDK5R1 mediata dal suo 3'-UTR potrebbe avere un ruolo cruciale nello sviluppo e nel funzionamento del sistema nervoso centrale, con potenziali implicazioni in malattie neurodegenerative e disordini cognitivi

(Moncini et al., 2007).

CDS

3’UTR

5’ 3’

927 bp 2725 bp

Gene CDK5R1

CDK5R1 (Cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit 1) codifica per p35, un attivatore dalla chinasi ciclino-dipendente 5 (CDK5), la cui attività svolge un ruolo centrale durante lo sviluppo e il funzionamento del SNC. CDK5R1 è stato implicato in patologie neurodegenerative con Alzheimer, Parkinson e Huntington e nella slerosi laterale amiotrofica.

Background

1

2

3

4 ₅

6

7

* 66% _55% 71% 34% _45% 29% 0 20 40 60 80 100 120

lipo pre-miR-107 anti-miR-107

subpolysomal polysomal