UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DELLA TUSCIA DI VITERBO
DIPARTIMENTO DI AGROBIOLOGIA E AGROCHIMICA
CORSO DI DOTTORATO DI RICERCA BIOTECNOLOGIE VEGETALI - XXIII Ciclo
USE OF ENZYMATIC CATALYSIS IN BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS FOR THE VALORISATION OF RENEWABLE RESOURCES
CHIM/06
Coordinatore: Prof. Stefania Masci
Tutor: Prof. Raffaele Saladino
ACKNOWLEDGEMENTS
Alla fine di questo lungo percorso, che si è rivelato molto impegnativo ma anche estremamente appassionante, alcuni sinceri ringraziamenti sono dovuti. Il mio primo pensiero va alla Professoressa Claudia Crestini di Tor Vergata, che è stata la mia vera guida per questi tre anni e si è dimostrata una persona di indubbio spessore scientifico, che mi ha insegnato materialmente il vero significato della parola ricerca, cioè tanto sacrificio, passione ma soprattutto soddisfazione. La ringrazio inoltre anche per il supporto umano e per aver saputo trovare sempre le parole giuste al momento giusto. I suoi ‘non mollare!’ mi sono stati di grandissimo aiuto nei momenti più difficili.
Vorrei ringraziare inoltre il mio tutor, il Professor Raffaele Saladino, per avermi dato fiducia all’inizio di questo percorso e per aver creduto in me fin da subito. Spero in questi anni di essere stata all’altezza delle sue aspettative e, seppur in minima parte, di averlo ripagato.
I would really like to acknowledge Professor Dimitris Argyropoulos of North Carolina State University. The time spent in your laboratory was really precious for me not only for the many think that I learned, but also for the extraordinary human experience. My appreciations.
Parlando dell’esperienza americana vorrei dire mille grazie anche al Dottor Luca Zoia, che mi ha seguito durante quel periodo e che mi ha trasmesso molte delle sue conoscenze. Grazie per la pazienza dimostrata e anche per avermi fatto sentire da subito a casa.
Ringrazio la Professoressa Stefania Masci, coordinatrice di questo corso di dottorato per aver saputo mettere insieme con successo persone con percorsi di studio molto diversi.
A questo punto mi sembra arrivato il momento di ringraziare tutte le mie colleghe di laboratorio, sia a Roma che a Viterbo. Ringrazio Federica e Silvia per avermi sopportato in laboratorio. Grazie per le tante risate e anche per i pranzi (o meglio micro-pranzi o ancora meglio nano-pranzi) finiti ancora prima di cominciare. Vi voglio bene! Ringrazio Melissa, sempre disponibile e gentile con chiunque arrivi nel suo laboratorio. Ringrazio le ragazze dell’ufficio a Tor Vergata: Alina, Catia, Chiara e l’ultima arrivata Dafne. Anche se nel corso del tempo siamo diminuite, nonostante tutto resistiamo perché siamo e rimarremo sempre le migliori di tutto il settore!
Un ringraziamento particolare va alle mie amiche lontane ma vicinissime nel cuore Alma e Fang. Un grazie anche a Laura che ora è in un paese freddo ma che sa lo stesso farmi arrivare il suo calore.
Ultima ma non ultima ringrazio la mia famiglia, i miei genitori, che mi sono sempre stati vicini, appoggiando ogni mia scelta e lasciandomi sempre libera, anche di sbagliare. Grazie per aver saputo prima di me quale era la mia strada.
Ringrazio infine Fabrizio, grazie per esserci sempre, sempre. A questo proposito volevo dirgli una cosa: -6…….non vedo l’ora!
TABLE OF CONTENTS
ABSTRACT 8
RIASSUNTO 18
LIST OF PAPERS 28
References/Bibliografia 311: INTRODUCTION 33
1.1 Principles of Green Chemistry 33 1.2 The role of biocatalysis 35
1.2.1 Advantages and disadvantages of biocatalysts 37
1.3 Laccase 38
1.3.1 Distribution in nature 38 1.3.2 Structural and catalytic properties 38 1.3.3 Laccase in organic synthesis 41
1.4 Peroxidase 42
1.4.1 Horseradish peroxidase: properties and catalytic cycle 43
1.5 Lipoxygenase 45
1.5.1 Lipid peroxidation 45 1.5.2 Lipoxygenase: occurrence and classification 46 1.5.3 LOXs structural and catalytic properties 47
1.6 Enzyme immobilisation 48
1.6.1 Physical methods 50 1.6.2 Chemical methods 51 1.6.3 Layer-‐by-‐layer (LbL) 52 1.6.4 Advances in enzyme immobilisation 53 References 55
2: NATURAL POLYPHENOLS AS SUBSTRATES FOR BIOTECHNOLOGICAL
APPLICATIONS 58
2.2 Phenolic polymers 59
2.2.1 Lignin: general features and ecological aspects 59 2.2.2 Lignin biodegradation 61 2.2.3 Biosynthetic pathway 62 2.2.4 Lignin structure 65 2.2.5 Isolation and characterisation methods 68
2.2.5.1 NMR spectroscopy 71 2.2.5.2 GPC 74
2.2.6 Lignin as bioresource 76 2.2.7 Melanin: general properties and biosynthetic pathway 78
2.2.5.1 Characterisation studies 80 2.2.5.2 Melanin degradation and melanogenesis control 82
References 84
3:
IMMOBILISED
ENZYMES
FOR
LIGNIN
OXIDATIVE
FUNCTIONALISATION: LACCASE 87
3.1 Introduction 87 3.2 Results and discussion 88
3.2.1 Immobilised laccases 88 3.2.1.1 Preparation cLbL-‐laccase 88
3.2.1.2 Preparation of microencapsulated laccase (mLbL-‐laccase) 90
3.2.2 Catalyst recycle 92 3.2.3 Lignin oxidation with laccase and immobilised laccases 93 3.2.4 31P NMR charaterisation of lignin after treatment with laccase and
immobilised laccases 95
3.3 Conclusion 99 3.4 Experimental 100
3.4.1 Lignin isolation 100 3.4.2 Enzyme immobilisation 100
3.4.2.1 Immobilisation of laccase on alumina pellets and coating with polyelectrolyte layer 100 3.4.2.2 Laccase microencapsulation 101
3.4.3 Enzyme activity assay 102 3.4.4 Laccase treatment of lignin 102 3.4.5 Quantitative 31P NMR 103
References 104
4:
IMMOBILISED
ENZYMES
FOR
LIGNIN
OXIDATIVE
FUNCTIONALISATION: HRP 106
4.1 Introduction 106 4.2 Results and discussion 107
4.2.1 Preparation of immobilised HRP 107 4.2.2 Catalyst recycle 108 4.2.3 Lignin oxidation with native and and immobilised HRP 109 4.2.4 31P NMR characterisation of lignin after treatment with native and
immobilised laccases 110 4.2.5 GPC analysis of lignin after treatment with native HRP and coated HRP particles 112
4.3 Conclusion 113 4.4 Experimental 114
4.4.1 Isolation of residual kraft lignin and milled wood lignin 114 4.4.2 Enzyme immobilisation 114 4.4.3 Enzyme activity assay 115
4.4.3 Enzymatic treatment of lignin 115
4.4.5 Quantitative 31P NMR 116 4.4.6 GPC analysis of lignin 116 References 118
5: NMR SPIN TRAPPING AT SERVICE OF LACCASE-‐CATALYZED
REACTIONS 119
5.1 Introduction 119 5.2 Results and discussion 121 5.3 Conclusion 126
5.4.1 Synthesis of DIPPMPO 127 5.4.2 Laccase purification and enzymatic assay 128 5.4.3 Mediators oxidation by laccase 128 5.4.4 BNTO radicals generation 129 5.4.5 Substrates oxidation by laccase 129 5.4.6 31 P NMR spectra 129
References 130
6: The USE OF NMR SPIN TRAPPING IN THE STUDY OF LIPOXYGENASE-‐
CATALYZED REACTIONS 131
6.1 Introduction 131 6.2 Results and discussion 132
6.2.1 Identification of lipid-‐derived radical adducts 132 6.2.2 Quantification of radical adducts 136
6.3 Conclusion 142 6.4 Experimental 142
6.4.1 Synthesis of DIPPMPO 142 6.4.2 Enzymatic assay 143 6.4.3 Linoleic acid oxidation by lipoxygenase 143 6.4.4 LOX reactions analysis 144 6.4.5 31 P NMR spectra 144
References 145
7: USE OF LIGNOCELLULOSIC BIOMASSES FOR BIOETHANOL
PRODUCTION: IMPROVING THE ENZYMATIC HYDROLISYS 146
7.1 Introduction 146 7.2 Results and discussion 148
7.2.1 Composition of various steam pretreated substrates 148
7.2.2 Cellulose conversion 148 7.2.3 Protein adsorption during hydrolysis 150 7.2.4 Free FP activity in the hydrolysis supernatants 151
7.2.6 Lignin structure analysis 155 7.2.7 Mechanism of PEG effect on enzyme adsorption 158
7.3 Conclusion 158 7.4 Experimental 159
7.4.1 Substrates and enzymes 159 7.4.2 Enzymatic hydrolysis 159 7.4.3 Preparation of supernatant 160
7.4.4 Enzyme activities and protein contents 160 7.4.5 Determination of protein adsorption and free residual enzyme
activities 160 7.4.6 Analysis 161
7.4.7 Pyrolysis gas chromatography/mass spectrometry (Py-‐GC/MS) 161
7.4.8 31 P NMR lignin analysis 161
7.4.9 HPLC 162 7.4.10 Statistical analysis 162
References 163
8: UNDERSTANDING THE MELANIN CHEMICAL STRUCTURE AND
THE REACTION WITH LACCASE 165
8.1 Introduction 165 8.2 Results and discussion 166
8.2.1 Melanin UV-‐Vis characterisation 166 8.2.2 Phosphitylation reactions and quantitative 31P NMR of melanin model
compounds 167 8.2.3 Quantitative solution 31P NMR of melanins 176
8.2.4 On the melanins molecular structure as revealed from quantitative 31P NMR 178
8.2.5 Melanin oxidation with laccase 179
8.3 Conclusion 180 8.4 Experimental 182
8.4.3 Preparation of enzymatic melanins 182 8.4.4 Preparation of chemical melanins 183 8.4.5 Synthesis of ionic liquid 183 8.4.6 NMR solution preparation 183 8.4.7 Model compounds phosphitylation 183 8.4.8 Melanin phosphitylation 184 8.4.9 NMR spectroscopy 184 8.4.10 Enzyme activity assay 185 8.4.11 Enzymatic treatments 185 References 186