Dipartimento di Scienze Veterinarie
Corso di Laurea Magistrale in Scienze e Tecnologie delle Produzioni Animali
Tesi di Laurea
Effetto dell’addizione di polline biologico essiccato
sullo sviluppo di microrganismi patogeni in latte
Candidato Relatore
Dott. Emanuel Gamò Dott. Filippo Fratini
Correlatore
Dott.ssa Barbara Turchi
Alla mia famiglia, i miei nonni e zio Giacomo.
A Liviana, Mariangela, Mariapia e Pino.
Indice
Riassunto
... 6Introduzione
... 71. Il polline
... 91.1 Origine del polline ... 9
1.2 Germinazione del granulo pollinico... 10
1.3 Le api e la raccolta del polline ... 11
1.4 Raccolta, pulizia e conservazione del polline ... 12
1.5 Composizione chimica ... 14
1.6 Effetti benefici e curativi del polline... 16
1.7 Componenti potenzialmente pericolose del polline ... 18
1.8 Il polline come additivo alimentare ... 18
1.9 La digestione del polline ... 21
1.10 La flora microbica del polline ... 23
1.10.1 La flora lattica del polline ... 27
1.11 L’attività antimicrobica del polline ... 28
2. Il latte
... 322.1 Principali microrganismi patogeni nel latte ... 33
2.1.1 Enterococcus faecalis ... 34
2.1.2 Staphylococcus aureus ... 34
2.1.3 Listeria monocytogenes ... 36
2.1.4 Salmonella spp. ... 38
3. Scopo della tesi ... 40
4.1 Polline d’api ... 41
4.1.1. Analisi microbiologica del polline ... 41
4.2 Valutazione dello sviluppo di microrganismi patogeni in latte addizionato con diverse percentuali di polline... 41
4.2.1 Fase 1: rivitalizzazione dei ceppi batterici ... 41
4.2.2 Fase 2: standardizzazione dell’inoculo batterico e contaminazione sperimentale in latte con diverse percentuali di polline ... 42
4.2.3 Fase 3: diluizioni e semine dei campioni dopo 24 ore di incubazione ... 43
4.2.4 Fase 4: enumerazione dei microrganismi dopo 24 ore di incubazione; diluizioni e semine dei campioni dopo 48 ore di incubazione ... 43
4.2.5 Fase 5: enumerazione dei microrganismi dopo 48 ore di incubazione ... 43
5. Terreni, tempi e condizioni d’incubazione per le analisi
microbiologiche
... 446. Risultati
... 456.1 Profilo microbiologico del polline d’api biologico essiccato ... 45
6.2 Effetto dell’addizione di diverse percentuali di polline (1%, 2%, 4%) sulla crescita microbica in latte mantenuto a temperatura di refrigerazione (24 e 48 ore) ... 46
6.2.1 Enterococcus faecalis ATCC19433... 46
6.2.2 Staphylococcus aureus ATCC6539 ... 48
6.2.3 Listeria monocytogenes ATCC7644 ... 50
6.2.4 Salmonella enterica sv. Thyphimurium ATCC14028 ... 52
6.3 Effetto dell’addizione di diverse percentuali di polline (1%, 2%, 4%) sulla crescita microbica in latte mantenuto a temperatura ottimale di crescita (24 e 48 ore) ... 54
6.3.1 Enterococcus faecalis ATCC19433... 54
6.3.3 Listeria monocytogenes ATCC7644 ... 58 6.3.4 Salmonella enterica sv. Thyphimurium ATCC14028 ... 60
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RIASSUNTO
Titolo della tesi: Effetto dell’addizione di polline biologico essiccato sullo sviluppo di mic rorganismi
patogeni in latte.
Scopo della tesi: valutare l'effetto dell'addizione di diverse percentuali di una sospensione di polline d'api
biologico essiccato sullo sviluppo di alcuni microrganismi patogeni nel latte.
Materiali e metodi: polline biologico essiccato e raccolto dalle api nell’anno di vegetazione 2013 nella
provincia di Lucca è stato addizionato in diverse percentuali (1%, 2%, 4% v/v) a skim milk volontariamente contaminato con ceppi di referenza appartenenti alla ceppoteca del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa (Enterococcus faecalis ATCC 19433, Staphylococcus aureus ATCC 6539, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Salmonella enterica sv. Thyphimurium ATCC 14028). Il profilo microbiologico del polline impiegato è stato valutato. Lo sviluppo dei microrganismi è stato monitorato dopo 24 e 48 ore dall’inoculo nei campioni mantenuti a temperatura di refrigerazione e a temperatura ottimale di crescita.
Risultati e discussioni: il polline utilizzato presentava una CBT mesofila pari a 4,9 log (ufc/g), con cariche
in Enterobacteriaceae e Lactobacillus spp. pari a 3,7 log (ufc/g) e 4,9 log (ufc/g), rispettivamente. Muffe e lieviti presentavano una carica di 5,5 log (ufc/g). Variazioni nelle conte sono state rilevate soprattutto dop o 48 h di incubazione a temperatura ottimale di sviluppo. E. faecalis in latte al 4% di polline ha mostrato cariche inferiori di 1 log (ufc/ml) rispetto a quelle del controllo; S. aureus è diminuito di 2 log (ufc/ml) in latte al 2% e 4% di polline; L. monocytogenes è diminuita di quasi 4 log (ufc/ml), sempre in latte al 4% di polline. Infine, S. enterica ha mostrato ben 6 log (ufc/ml) di diminuzione dopo 48 ore in latte al 4% di polline. A temperatura di refrigerazione non sono state rilevate variazioni. An alisi ulteriori sono necessarie al fine di valutare se le diminuzioni riscontrate siano dovute ai composti antimicrobici nel polline o piuttosto ad un effetto di competizione biologica esercitato dalla microflora presente nel polline.
Parole chiave: polline d’api, attività antimicrobica, latte.
Thesis title: Effect of the addition of dried organic pollen on the growt h of pathogen bacteria in milk.
Aim of the study: to assess the effect of the addition of different percentages of dried organic bee -gathered
pollen loads suspension on the growth of some pathogen bacteria in milk.
Materials and methods: different percentages (1%, 2%, 4% v/v) of dried organic pollen gathered from bees
in vegetation year 2013 in Lucca Province (Tuscany, Italy) were added in delib erately contaminated skim milk. The studied reference strains belonged to the Department of Veterinary Science collection and were Enterococcus faecalis ATCC 19433, Staphylococcus aureus ATCC 6539, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Salmonella enterica sv. Thyphimurium ATCC 14028. Microbiological profile of pollen was evaluated. Growth of microorganisms was monitored after 24 and 48 hours after inoculation in samples incubated at refrigerated condition and at optimal growth temperature.
Results and discussions: pollen employed showed a mesophilic CBT value of 4.9 log (ufc/g),
Enterobacteriaceae and Lactobacillus spp. counts were 3.7 log (ufc/g) and 4.9 log (ufc/g ), respectively. Molds and yeasts count was 5,5 log (ufc/g). Changes in microbial loads were detected especially after 48 h of incubation at optimum temperature. E. faecalis counts in milk with 4% of pollen suspension were 1 log (ufc/ml) lower than those of control sample; S. aureus decreased by 2 log (ufc/ml) in milk with 2% and 4% of pollen; L. monocytogenes decreased by almost 4 log (cfu/ml) in milk at 4% of pollen. Finally, S. enterica showed a decrase of 6 log (ufc/ml) after 48 hours in milk at 4% of pollen. No change was detected for samples stored at refrigeration conditions. Further researches are needed in order to assess whether the observed decreases are due to antimicrobial compounds in pollen or to an effect of biological competition exerted by the microflora present in dried pollen.
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Introduzione
Il valore nutrizionale e terapeutico del polline è noto all’uomo fin dall’antichità; esso veniva già impiegato nell’antico Egitto, dove era definito come “una polvere che dà la vita”, mentre Ippocrate, Plinio il Vecchio e Pitagora, certi delle proprietà curative di questo prodotto, lo somministravano ai loro pazienti (Campos et al., 2010).
Nonostante queste testimonianze il polline iniziò ad essere utilizzato per l’alimentazione umana solo dopo la seconda guerra mondiale, cioè non appena furono inventate le trappole per la sua raccolta (Campos et al., 2008).
Oggi la produzione mondiale di polline è di circa 1500 tonnellate l’anno e la Spagna è il maggior produttore di questo prodotto, seguita dalla Cina, dall’Australia e dall’Argentina (Pan, 2011-2013).
Al polline sono state attribuite e riconosciute molte proprietà curative e nutrizionali. Infatti, questo prodotto presenta un buon contenuto di proteine, vitamine, aminoacidi e minerali (Bogdanov, 2011). Tra le attività di maggiore rilievo che vengono riconosciute al polline vi sono l’azione stimolante nei confronti del sistema immunitario, l’attività antiossidante, l’attività anticancerogena, in modo particolare sul tumore alla prostata, e l’attività terapeutica contro le prostatiti ed i disturbi urinari (Turner et al., 2004; Contessi, 2004; Duglos et al., 2003; Linskens e Jorde, 1997).
Un’ulteriore attività riconosciuta al polline è quella antimicrobica nei confronti di alcuni microrganismi patogeni e alternanti. Tale azione è attribuibile principalmente ai composti fenolici che esso contiene. In proposito, sono stati descritti diversi metodi per l’estrazione delle molecole antimicrobiche dal polline (estrazione mediante impiego di metanolo ed etanolo) al fine di testarne l’attività nei confronti di diversi germi.
Le innumerevoli proprietà positive del polline hanno prospettato quindi il suo utilizzo quale additivo alimentare. In bibliografia sono già presenti alcuni studi “pilota” nei quali il polline è stato impiegato per la produzione di birra e biscotti. Tuttavia, sono stati avanzati alcuni dubbi per quanto riguarda la digeribilità del polline.
L’utilizzo di estratti di polline potrebbe costituire, tuttavia, un problema per l’industria alimentare, al contrario l’utilizzo diretto di polline tal quale, potrebbe rappresentare
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un’alternativa valida dal punto di vista applicativo e garantire al contempo un maggiore apporto di composti nutraceutici e nutrizionali (Fratini et al., 2014; Solgajová et al., 2014a; Solgajová et al., 2014b; Campos et al., 2010).
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare lo sviluppo di alcuni microrganismi patogeni in latte addizionato con diverse percentuali di polline biologico (1%, 2%, 4%) tal quale, senza alterare quindi la composizione chimico- fisica dei composti in esso presenti, al fine di verificare un’eventuale azione antimicrobica. I microrganismi sono stati inoculati nei campioni ed incubati sia a temperatura di refrigerazione, che a temperatura ottimale di crescita per 24 e 48 ore.
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1. Il polline
Il polline d’api è il risultato dell’agglutinazione dei pollini del fiore, realizzato dal lavoro delle api mellifere con il nettare (e/o miele), sostanze salivari, mandibolari e ipofaringeali, raccolto dalle api all’ingresso dell’alveare (Campos et al., 2008).
Il polline d’api rappresenta l’insieme dei gametofiti maschili immaturi ed è composto da tre cellule aploidi, una andrà a formare il tubetto pollinico (prolungamento a forma di tubo con la funzione di trasporto dei gameti maschili dalla stigma fino all’ovulo), mentre le altre due saranno coinvolte direttamente nel processo riproduttivo (Pasqua et al., 2010).
La sua forma, così come le sue dimensioni sono variabili. Infatti, lo possiamo trovare in forma sferica, poliedrica, allungata e vermiforme; mentre le dimensioni variano da 2,5 µm in Myosotis spp., a 250 µm in Mirabilis spp. (Masueth, 2006).
Il colore (fig. 1) varia in funzione delle specie vegetali e può essere giallo, rossiccio, azzurrognolo, brunastro o bianco e nero (Contessi, 2004).
Figura 1: colore di alcuni granuli di polline (www.beeolab.eu)
1.1 Origine del polline
Il polline si origina nei sacchi pollinici (microsporangi), porzioni fertili degli stami (microsporofilli) (Masueth, 2006).
Durante la meiosi si forma una membrana divisoria e successivamente a ogni divisione ha origine il polline per formazione succedanea (Monocotiledoni) o simultanea (Dicotiledoni) (Contessi, 2004).
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2006).
Il granulo pollinico è protetto da una doppia membrana una interna, di natura celluloso-pectica che prende il nome di intina, e una esterna costituita da politerpeni che prende il nome di esina (Contessi, 2004).
La superficie esterna dei granuli di polline è costituita da sculture elaborate caratteristiche per ogni specie, che ci permettono di identificare la pianta che ha prodotto uno specifico polline in base alla morfologia di queste sculture presenti sul granulo (Pasqua et al., 2010).
1.2 Germinazione del granulo pollinico
Il granulo pollinico nelle Angiosperme risulta binucleato nella germinazione, in seguito alla divisione del nucleo. Questa divisione porta alla formazione di un nucleo più grande rappresentante la cellula vegetativa dalla quale si formerà il tubo pollinico; il nucleo più piccolo rappresenta la cellula generativa, la quale si divide a sua volta in due nuclei che costituiscono i due gameti maschili ovvero gli spermi (Contessi, 2004).
Nelle Angiosperme il gametofito maschile è ridotto perché è costituito da tre nuclei dei quali solo quello vegetativo rappresenta la fase aplofitica (Pasqua et al., 2010).
Durante la germinazione il contenuto del granulo pollinico si presenta rigonfiato per l’assunzione di acqua e fuoriesce da uno dei pori germinativi sottoforma di tubo il quale si accresce dopo aver assorbito le sostanze dai tessuti dello stilo (Pasqua et al., 2010).
Questa protuberanza rappresenta la cellula vegetativa. Il nucleo di questa si trova sull’apice del tubetto ed è seguito da due nuclei spermatici.
Il tubetto strisciando sulla superficie del canale stilare raggiunge l’ovulo dove avviene la doppia fecondazione.
Nelle Gimnosperme il granulo germina nel liquido secreto dall’ovulo, raccolto nella regione micropilare ed è già pluricellulare. La cellula vegetativa dalla parte superiore del granulo sviluppa il tubetto. I nuclei spermatici che si trovano nel liquido raggiungono le oosfere, in alcune specie tramite le ciglia, e compiono la fecondazione (Frediani, 2000). Il processo di germinazione del granulo pollinico è schematizzato in fig. 2.
11 Figura 2: processo di germinazione del granulo pollinico
(www.omodeo.anisn.it)
1.3 Le api e la raccolta del polline
Il polline dai fiori delle piante viene raccolto dalle api bottinatrici (fig. 3), che per fare questo utilizzano molte parti del loro corpo in modo particolare le tre paia di zampe, provviste di spazzole, e la peluria che è presente sul loro corpo. Tramite queste caratteristiche di cui sono dotate, le api mentre prelevano il nettare per produrre il miele, si cospargono di polline e spostandosi da un fiore ad un altro e tramite vari movimenti delle zampe spostano il polline sulla parte addominale del corpo. La fase successiva consiste nella formazione di piccole palline che sono impastate con il nettare prelevato precedentemente. Una volta formate, queste palline di polline, sempre tramite il movimento delle zampe, vengono poi accumulate nella parte esterna delle zampe posteriori comunemente chiamate cestelle del polline. Una volta completato il carico di polline le bottinatrici tornano verso l’alveare e collocano il polline in celle, lo cospargono di miele e lo comprimo con il capo (Contessi, 2010).
12 Figura 3: immagine di un ape impegnata nella raccolta del polline (www.apiterapia.it)
1.4 Raccolta, pulizia e conservazione del polline
Per ottenere pallottoline di polline di ottima qualità le tecnologie di raccolta, purificazione e conservazione rappresentano fasi fondamentali. Gli apicoltori raccolgono le pallottoline di polline dalle api con l’ausilio di speciali trappole (Keller et al., 2005 a e b).
Esistono diversi modelli di trappole ma tutte funzionanti con lo stesso principio ossia quello di far passare le api attraverso una griglia, verticale o orizzontale con fori calibrati che permettono il passaggio delle stesse, ma che provocano anche il distacco di una certa percentuale di palline di polline, raccolto nelle cestelle delle zampe posteriori. I fori della griglia possono essere circolari, esagonali, quadrati o a stella (Contessi, 2004).
I vari modelli di trappola si dividono in: trappola di entrata, posta davanti all’apertura di volo abituale; trappola inferiore, posta sul fondo dell’arnia e trappola da soffitta, inserita al posto della soffitta sul nido o sul melario. Tra le varie trappole esistenti abbiamo inoltre la trappola “pigliapolline” Fedrizzi e Metalori, queste ultime prendono il nome dai rispettivi inventori. La trappola Fedrizzi differisce dagli altri modelli perché presenta una griglia orizzontale all’interno dell’arnia con la quale fa corpo unico. La trappola Metalori (fig. 4) invece è composta da tre parti: la mascherina removibile all’entrata di volo, il fondo a griglia e un ampio cassettino di raccolta, ventilato e più difficilmente soggetto alle intemperie (Giusti, 2009).
13 Figura 4: trappola “pigliapolline” Metalori (www.apitalia.net)
La percentuale di palline di polline realmente trattenuto da una trappola è variabile. L’efficienza di una trappola in una colonia può mutare dal 3 al 25% nel corso del periodo vegetativo (Campos et al., 2010).
Il polline d’api fresco contiene circa 20-30 g di acqua per 100 g. Questo elevato tasso di umidità fa si che il polline sia un terreno colturale perfetto per lo sviluppo di microrganismi quali batteri e funghi. Per prevenire l’insorgenza di questo problema e per preservare la qualità microbiologica del polline, non appena questo viene raccolto dalla trappola, deve essere immediatamente posto in un congelatore (Moosbeckhofer e Ulz, 1996).
Un metodo di congelamento per il polline fresco o pulito è la conservazione in azoto liquido sino al momento del consumo. Questa tecnica permette di preservare tutte le proprietà biologiche e nutrizionali essenziali correlate con gli effetti benefici del polline (Percie du Sert, 1998;Percie du Sert, 2002; Wang et al., 2007).
Ricerche effettuate sul profilo microbiologico di polline congelato mostrano che in esso la quantità di muffe, lieviti e batteri presenti rimane stabile anche dopo 48 ore dallo scongelamento (Giusti et al., 2011).
Un ulteriore metodo di conservazione del polline è l’essiccazione mediante aria calda in un essiccatoio (fig. 5). Una condizione importante è che la temperatura non superi i 40 °C e il tempo di essiccazione sia il più breve possibile per evitare perdite di composti volatili (Collin et al., 1995).
Recenti ricerche hanno dimostrato che il contenuto di vitamina A, E, C, nel polline essiccato a temperature di 42 °C e 32 °C diminuisce in media del 31% in entrambe le condizioni di essiccazione (Szcesna et al., 1995; Oliveira, 2006).
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Una volta essiccate le pallottoline di polline devono essere poste in contenitori di vetro con chiusura ermetica e conservate in un luogo asciutto a temperatura ambiente (Pistoia, 1997).
Figura 5: essiccatrice del polline (www.apitalia.net)
1.5 Composizione chimica
La composizione chimica delle pallottoline di polline d’api non è standard, ma varia in funzione delle condizioni ambientali e della flora circostante l’alveare (Contessi, 2004). In linea generale, le componenti delle pallottoline di polline d’api sono rappresentate da carboidrati (dal 15 % al 53 %), proteine (dal 10% al 40 %), fibra grezza (dallo 0,3 % al 20 %), lipidi (dal 1 % al 10%) (Bogdanov, 2011).
Il polline contiene inoltre vitamine quali provitamina A, vitamina E (tocoferolo), niacina, tiamina, acido folico e biotina, nonché quantità relativamente elevate di polifenoli e di flavonoidi, che sono presenti nel polline sotto forma di glicosidi (Stanley e Linskens, 1974; Solberg e Remedios, 1980; Markham e Campos, 1996).
I flavonoidi sono composti vegetali secondari che hanno diverse attività fisiologiche e farmacologiche per l’uomo e le api stesse. Tra le diverse attività abbiamo quella antiossidante, antinvecchiamento, anti-cancerogena, antiaterosclerotica ed antinfiammatoria. Offrono inoltre una protezione indiretta per l’organismo attraverso l’attivazione dei sistemi di difesa endogeni e la modulazione dei diversi processi fisiologici (Han et al., 2007). In uno studio è stato osservato che questi composti variavano nel polline tra i 1293 e gli 8243 mg/100 g, in un altro, tra i 530 e i 3258 mg/100 g (Campos et al., 2003; Leja et al., 2007).
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Un altro gruppo di composti contenuti nel polline sono i fitosteroli. Tra le varie bio-attività dei fitosteroli, la più importante è la loro capacità di abbassare il livello di colesterolo nel sangue dell’uomo attraverso la parziale inibizione dell’assorbimento di colesterolo nel tratto intestinale, anche se ancora non sono chiari i meccanismi d’azione. I fitosteroli svolgono ulteriormente un’ attività anti-infiammatoria che viene promossa principalmente dal beta-sitosterolo, e agiscono come stimolante del sistema immunitario (Trautwein e Demonty, 2007).
Recentemente lo studio della composizione del polline è stato ampiamente approfondito (Campos et al., 2008). Quello che risulta evidente è la grande variazione tra valori minimi e massimi dei diversi componenti. Questo è probabilmente dovuto alle numerose varietà di fonti floreali da cui ha origine il polline, infatti è noto che le composizione del polline delle diverse specie varia in relazione alla loro tipologia botanica (Stanley e Linskens, 1974; Campos et al., 1997).
L’apporto nutrizionale derivante dall’ingestione di un cucchiaino di polline (15 g) è stato confrontato con il fabbisogno quotidiano (RDI) dei diversi nutrienti.
I dati, riportati in Tabella 1, mostrano che in molti casi l’apporto dei principali componenti nutrizionali attraverso il polline è relativamente basso. A seconda della fonte botanica del polline, l’apporto di fibra alimentare e di proteine può comunque essere importante per raggiungere valori pari al 20% del fabbisogno quotidiano (RDI).
Sono stati esaminati 15 g di polline d’api spagnolo ed è stato dimostrato che questi riuscivano a coprire il fabbisogno di amminoacidi nel corpo (Peris, 1984; Nagai et al., 2007).
16 Tabella 1: Composizione del polline (Campos et al., 2008) e Raccomandazione Di Riferimento (RDI) per le dosi giornaliere medie (Deutsche Gesellschaft für Ernährung, 2000). Componenti principali g in 100 g % RDI per 15 g di polline RDI (g/giorni) Carboidrati (fruttosio, glucosio, saccarosio, fibre) 13-55 1.4-4.6 320 Fibra grezza 0.3-20 0.3-18 30 Proteine 10-40 5.4-22 50 Lipidi 1-13 0.1-4 80
Vitamine mg in 100 g % RDI per 15 g di polline RDI (g/giorni) Acido ascorbico (C) 7-56 2-15 100 Beta-carotene (provitamina A) 1-20 30-600 0.9 Tocoferolo (vitamina E) 4-32 8-66 13 Niacina (B3) 4-11 7-20 15 Piridossina (B6) 0.2-0.7 4-13 1.4 Tiamina (B1) 0.6-1.3 15-32 1.1 Riboflamina (B2) 0.6-2 12-42 1.3 Acido pantotenico 0.5-2 2-9 6 Acido folico 0.3-1 20-67 0.4 Biotina (H) 0.05-0.07 30-42 0.045 Minerali Potassio (K) 400-2000 5-27 2000 Fosforo (P) 80-600 2-16 1000 Calcio (Ca) 20-300 0.5-7 1100 Magnesio (Mg) 20-300 2-23 350 Zinco (Zn) 3-25 10-79 8.5 Manganese (Mn) 2-11 15-85 3.5 Ferro (Fe) 1.1-17 2-37 12.5 Rame (Cu) 0.2-1.6 4-36 1.2
1.6 Effetti benefici e curativi del polline
I primi a credere negli effetti benefici del polline sulla salute dell’uomo e a somministrarlo ai loro pazienti furono Ippocrate, Pitagora e Plinio il Vecchio (Campos et al., 2010). Le qualità benefiche del polline erano conosciute sin dai tempi più antichi anche nella medicina tradizionale cinese. Oggi in medicina il polline viene utilizzato come supplemento nutrizionale. Il suo impiego è previsto in condizioni di stress e di affaticamento dell’organismo, per prevenire la febbre da fieno e le reazioni allergiche al
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polline stesso, il raffreddore e la tosse; e ancora per prevenire l’insufficienza venosa, le emorroidi e l’ipertensione (Contessi, 2004).
E’ stato dimostrato anche che il polline somministrato alle donne in gravidanza o in allattamento sia in grado di contribuire allo sviluppo mammario e alla produzione di latte (Frediani, 2000).
Un altro effetto benefico del polline è l’azione antiossidante grazie alla presenza dei flavonoidi e degli altri componenti vegetali che lo caratterizzano. Questi vanno a contrastare l’azione dei radicali liberi e rallentano di conseguenza i processi d’invecchiamento cellulare (Linskens e Jorde, 1997).
Il rallentamento del processo di formazione dei radicali liberi rappresenta un meccanismo molto importante dal momento che lo stress ossidativo può contribuire allo sviluppo di malattie croniche e degenerative, come il cancro, malattie autoimmuni, cataratte, malattie cardiovascolari e neurodegenerative (Pham-Huy et al., 2008).
Dai risultati di uno studio condotto è possibile affermare che il potere antiossidante del polline può diminuire fino al 50% in un anno se conservato a temperatura ambiente dopo l’essiccazione (Campos et al., 2003).
L’attività più importante del polline dal punto di vista curativo è senz’altro la sua azione benefica nei confronti della prostatite e dei disturbi urinari. In modo particolare il polline viene usato nel trattamento delle prostatiti croniche di III categoria, dette non batteriche, associate all’infiammazione della prostata o dell’apparato urinario e per le quali l’uso di antibiotici non risulta essere efficace (Duclos et al., 2003).
Alcuni studi hanno poi dimostrato un’attività anticancerogena del polline soprattutto per quanto riguarda il tumore alla prostata. Infatti, è stato visto come il polline agisca da stimolante del sistema immunitario permettendo una maggiore attività da parte delle difese immunitarie nei confronti dei tumori (Turner et al., 2004).
18 1.7 Componenti potenzialmente pericolose del polline
Il polline oltre ad avere un elevato numero di effetti positivi sulla salute umana, grazie alla presenza di numerosi componenti benefiche, potrebbe presentare anche alcune componenti potenzialmente pericolose. Infatti, in polline di Echium vulgare, E.
plantagineum, Senecio jacobea, S. ovatus e Eupatorium cannabinum sono state trovate
tracce di alcaloidi pirrolizidinici epatotossici (Boppre et al., 2008).
Nell’Europa del nord questi tipi di polline non sono tra i principali granuli raccolti dalle api, mentre nell’Europa meridionale le piante E. vulgare ed E. plantagineum sono molto diffuse e vengono raccolte dalle api in elevate quantità (Campos et al., 1994; Serra Bonvehí, 1997).
Il polline dovrebbe inoltre essere controllato in modo da garantire l’assenza di eventuali contaminanti dannosi per la salute dell’uomo (Bogdanov, 2006).
Un ulteriore problema è rappresentato dai metalli pesanti e dai pesticidi. Infatti è necessario che il polline venga raccolto ad almeno 3 Km di distanza dalle eventuali fonti di contaminazione, come ad esempio strade particolarmente trafficate e aree agricole dove sono impiegati pesticidi (Szczesna et al., 1993; Jablonski et al., 1995; Leita, 1996; Fleche
et a.l, 1997; Kubik et al., 1999; Conti e Botrè, 2001).
Il contenuto di metalli pesanti nel polline non deve superare determinati limiti che sono per il piombo 0,5 mg/Kg; per il cadmio 0,1 mg/Kg; per il mercurio 0,03 mg/Kg; per l’arsenico 0,5 mg/Kg (Campos et al., 2008).
Inoltre deve essere valutata anche la possibilità di sviluppo di micotossine nel polline in seguito alla proliferazione di muffe, che potrebbero rappresentare un ulteriore pericolo (Medina et al., 2004).
1.8 Il polline come additivo alimentare
Il polline d’api è considerato un alimento, ma a causa delle quantità ridotte che vengono consumate è più spesso considerato come un alimento funzionale o un additivo (Campos et
al., 2008).
Tuttavia in alcuni Paesi come il Brasile, la Bulgaria, la Polonia e la Svizzera, il polline è considerato come un prodotto per l’alimentazione umana con una normativa specifica a
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livello nazionale (Brazil Ministério Da Saúde Agência Nacional De Vigilância Sanitária Legislação Visalegis. Instrução normativa n. 3, de 19 de janeiro de 2001; Bulgarian standard 2567111-91; PN-R-78893 “Obnóza pylkowe”- Polish legislation for bee-pollen;
Swiss Food Manual: Pollen Bienenprodukte, BAG- Swiss Federal Office for Public Health).
Un altro Paese dove il polline è considerato un prodotto per l’alimentazione umana è l’Argentina. Il suo consumo è previsto dall’articolo 785 del Codice Alimentare Argentino (Codigo Alimentario Argentino).
Nello specifico vengono riportati in questo articolo:
- Composizione
Umidità (controllata mediante essiccazione sotto vuoto a 45 mm Hg, 65°C) max. 8 %;
Ceneri (sostanza secca a 600 °C) max. 4 %;
Proteine (determinate con il metodo Kjeldahl N x 6,25) 15-28 %;
pH 4-6;
Carboidrati totali 45-55 %. - Caratteristiche microbiologiche
Microrganismi aerobi non patogeni max. 150 x 10³ ufc/g;
Funghi max. 10² ufc/g;
Assenza di microrganismi patogeni.
L’articolo 785 specifica inoltre che il polline deve essere posto in contenitori in plastica trasparenti o in vetro da 250 g in modo da poterne osservare il contenuto; questi ultimi devono avere la chiusura ermetica in modo tale da non permettere l’umidificazione del prodotto.
Inadatto al consumo è il polline che presenta una o più delle seguenti caratteristiche:
Anomalie nelle caratteristiche organolettiche;
20 Anomalie nell’osservazione al microscopio;
Composizione chimica diversa da quella citata precedentemente;
Cariche microbiche superiori ai limiti prestabiliti;
Presenza di insetti o delle loro larve;
Presenza di residui antiparassitari;
Presenza di conservanti.
Sulla confezione del polline deve essere presente un’etichetta sulla quale devono essere riportati il giorno, il mese e l’anno di confezionamento.
Inoltre deve essere segnalato che:
Il consumo di polline può causare reazioni allergiche;
Il polline deve essere conservato in un luogo fresco e asciutto;
Il polline deve essere consumato entro 180 giorni dalla data di confezionamento. In Italia, ad oggi, per il polline non è presente nessuna normativa specifica che ne determini eventuali parametri qualitativi, di conseguenza in linea generale ci si attiene alle disposizioni del Regolamento (CE) n.178/2002 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 28 gennaio 2002, che stabilisce i principi ed i requisiti generali della legislazione alimentare, istituisce l'Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare e fissa procedure nel campo della sicurezza alimentare.
Il regolamento 178/2002 assicura la qualità degli alimenti destinati al consumo umano e dei mangimi, garantendo così la libera circolazione di alimenti sani e sicuri nel mercato interno.
Il polline può essere reperibile in commercio, anche come ingrediente di integratori alimentari, in questo caso ci si attiene al D.L n.169/2004 che regolamenta la produzione e commercializzazione degli integratori alimentari, prevedendo un’autorizzazione da parte del Ministero della Salute per gli stabilimenti di produzione e l’approvazione dell’etichetta prima della vendita.
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alimentare devono essere presenti le seguenti indicazioni:
Denominazione di vendita;
Quantità netta o nominale;
Termine minimo di conservazione;
Nome e indirizzo dell’operatore del settore alimentare;
Sede dello stabilimento di confezionamento;
Lotto;
Indicazioni per la conservazione, ad esempio (polline congelato).
Se invece viene commercializzato come integratore alimentare l’etichetta deve indicare:
Nome commerciale;
Quantità netta o nominale;
Elenco e le quantità degli ingredienti presenti;
Nome e l’indirizzo dell’operatore del settore alimentare;
Sede dello stabilimento di confezionamento;
Lotto;
Indicazioni per la conservazione;
Istruzioni per l’uso;
Data di scadenza;
Dose giornaliera raccomandata con un’avvertenza a non eccedere;
Avvertenza: “gli integratori non vanno intesi come sostituti di una dieta variata”, obbligatoria per gli integratori contenenti sostanze nutritive o ad effetto nutritivo;
Avvertenza: “tenere fuori dalla portata dei bambini al di sotto dei tre anni”;
Effetto nutritivo e fisiologico attribuito al prodotto sulla base dei suoi costituenti. 1.9 La digestione del polline
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negli animali. In uno studio è stata dimostrata la capacità dell’uomo di digerire il polline o di digerirlo parzialmente, di conseguenza una parte del suo contenuto risulta essere biodisponibile. E’ stato visto inoltre che se il polline viene posto per un po’ di tempo in acqua o in un altro liquido, la sua digeribilità aumenta. Mentre per quanto riguarda il consumo di polline da parte degli animali in alcuni esperimenti è stato dimostrato che il polline non ha mantenuto la sua composizione dopo aver lasciato il tratto digerente. Questo suggerisce l’ipotesi che il contenuto nutrizionale del polline venga liberato dai succhi gastrici negli animali (Jorde e Linskens, 1974; Schmidt e Schmidt, 1984; Franchi et al., 1997; Roulston e Cane, 2000).
Uno studio recente ha invece evidenziato dei limiti nei monogastrici a digerire il polline. E’ stato ipotizzato che questa condizione fosse dovuta alla microstruttura che ricopre il granulo di polline che risulta essere molto resistente (Tekeli et al., 2010).
Uno studio svolto in Slovacchia ha avuto come obiettivo quello di valutare l’effetto di estratti in etanolo di polline d’api sulla microflora gastrointestinale di polli somministrando agli stessi, per 7 settimane, 6 quantitativi differenti di polline attraverso l’alimentazione (0-5-15-25-35 e 45 g/Kg di mangime). La flora intestinale dei polli era costituita principalmente da enterococchi, lattobacilli e Enterobacteriaceae. Un numero elevato di Enterococchi, riconducibili soprattutto a Enterococcus faecalis, è stato trovato nel gruppo sperimentale alimentato con l’aggiunta di 15 g di polline. Le cariche rilevate si aggiravano intorno a 8,85 Ufc/g. Mentre il numero più alto di lattobacilli è stato riscontrato nel gruppo sperimentale alimentato con 35 g di polline per Kg di mangime. Le Enterobacteriaceae erano presenti nel gruppo di controllo con cariche medie di 8,43 Ufc/g. Inoltre sono stati identificati diverse specie per ogni famiglia batterica considerata: per quanto riguarda le
Enterobacteriaceae sono stati identificati Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella oxytoca; Lactobacillus acidophilus, L. crispatus, L. fermentum e L. salivarius per quanto
riguarda le Lactobacillaceae e Enterococcus avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E.
faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae e E. malodoratus per quanto riguarda le Enterococcaceae. Dai risultati riportati si può notare come l’addizione alla dieta di diverse
concentrazioni di polline abbia portato all’aumento del numero di lattobacilli e enterococchi nel cieco dei polli testati. Di conseguenza questi Autori hanno ipotizzato che
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il polline d’api potesse essere usato come additivo per mangimi con potenziale attività prebiotica nella dieta del pollo (Kačániová et al., 2013).
Già in un precedente studio condotto su polli alimentati con polline era stato notato che gli animali avevano avuto un migliore sviluppo dell’intestino tenue, dei villi del duodeno, del digiuno e dell’ileo. Anche questi risultati suggeriscono quindi che il polline può contribuire allo sviluppo precoce dell’apparato digerente e che quindi può essere digerito dai polli (Wang et al., 2007).
Tekeli et al. nel 2010 considerando questi risultati hanno addirittura proposto la messa a punto di un prodotto fermentato a base di polline con funzione sia probiotica (per l’attività dei batteri lattici), che prebiotica (dovuta all’attività del polline).
1.10 La flora microbica del polline
Il polline rappresenta un substrato ideale per lo sviluppo di batteri Gram positivi e Gram negativi, muffe e lieviti (Pitta e Markaki, 2010).
Numerosi microrganismi, aerobi ed anaerobi, sono stati isolati in uno studio sulla flora microbica del polline, quali Staphylococcus aureus, coliformi e un numero elevato di muffe. Sono stati isolati inoltre microrganismi patogeni responsabili di intossicazioni alimentari come ad esempio Clostridium perfringens e Bacillus cereus (Kunene et al., 1999; Miwa et al., 1999; Belhadj et al., 2010; Belhadj et al., 2012; Odey et al., 2013). In uno studio svolto in Algeria sulla qualità microbiologica del polline commercializzato, sono stati presi in esame 15 campioni di cui 13 acquistati dai mercati locali e altri 2 forniti dagli apicoltori. Ciò che alla fine è stato riscontrato dopo aver effettuato numerose prove microbiologiche, è stata la presenza di numerosi microrganismi, alcuni dei quali molto pericolosi per la salute umana, tra cui Staphylococcus aureus, isolato in 14 campioni con cariche fino a 8,32 log Ufc/g, Salmonella spp., isolata in 7 campioni e Listeria spp. isolata in 10 campioni. Inoltre i campioni di polline contenevano germi patogeni appartenenti alla famiglie delle Enterobacteriaceae tra cui: Shigella spp., Proteus mirabilis, Citrobacter
diversus, Klebsiella spp., Escherichia coli, Providencia spp. ed Enterobacter cloacae.
Oltre a questi microrganismi è stato riscontrato un numero elevato di muffe quali
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spp., Monila sitophilia, Rhisomucor pusillus e Mucor hiemalis. In conclusione questo
studio ha evidenziato una scarsa qualità dal punto di visto microbiologico del polline, che tuttavia è commercializzato (Belhadj et al., 2014).
Per evitare che il polline non adatto microbiologicamente al consumo possa finire in commercio e causare danni ai consumatori, in uno studio è stato proposto di creare uno standard relativo alle caratteristiche qualitative del polline in linea con le norme dell’Unione Europea che seguono, per quanto riguarda i criteri di igiene e sicurezza, i metodi A.O.A.C (tabella 2) (Campos et al., 2008).
Tabella 2: Parametri qualitativi proposti per il polline d’api destinato alla commercializzazione.
Analisi microbiologica Limiti
Salmonella assente
Staphylococcus aureus assente
Enterobacteriaceae Max. 100 Ufc/g Escherichia coli assente
Microrganismi aerobi <100000 Ufc/g Muffe e lieviti <50000 Ufc/g
Contaminanti Pesticidi organoclorurati <MRL* Pesticidi organofosfati <MRL Piretroidi <MRL Aflatossina B1 Max. 2 g/kg Aflatossina B1 + B2 + G1 + G2 Max. 4 g /kg Cloramfenicolo (PAC) assente Metaboliti di nitrofurani assente Sulfamidici assente Metalli pesanti Piombo max 0,5 mg/kg Mercurio max 0,01 mg/kg Cadmio max 0,03 mg/kg Radioattività (Cs-134 e Cs-137) <600 Bq/kg * deve essere inferiore ai parametri stabiliti per il miele
Un lavoro sul polline e sul pane d’api, conservati nel tempo e tutti provenienti dalla stessa specie vegetale, ha dimostrato che il polline non appena viene raccolto dall’ape cambia sia dal punto di vista biochimico, che microbiologico (Gilliam, 1979; Standifer et al., 1980). Funghi (muffe e lieviti) e Bacillus spp. sono i microrganismi predominanti nel polline e nel pane d’api, infatti su un totale di 391 ceppi microbici, isolati dal polline e dal pane d’api, il 55% nel polline e l’85% nel pane d’api erano rappresentati da funghi (Gilliam, 1997).
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Sembra dunque che le api mellifere inoculino nel polline microrganismi specifici durante la raccolta e mentre questo viene trasportato verso la colonia.
Esempi di microrganismi introdotti dalle api sono: il lievito Trioza magnoliae, muffe
Aureobasidium pullulans, Rhizopus nicricans, Penicillium corylophilum e P. crustosum, e
batteri appartenenti al genere Bacillus. La maggior parte dei microrganismi isolati dalle palline di polline e pane d’api vengono isolati anche nella colonia, in modo particolare nell’intestino delle api operaie adulte (Gilliam, 1979; Standifer et al., 1980; Gilliam e Prest, 1987; Gilliam et al., 1988 e 1989).
L’introduzione di questi microrganismi porta quindi ad una sostituzione dei microrganismi presenti nel polline floreale con quelli presenti nell’intestino delle api stesse. Questa sostituzione causa una diminuzione di batteri, cocchi Gram-positivi, corinebatteri e bacilli Gram-negativi, presenti in una percentuale del 49% nel polline floreale, del 28% nelle palline di polline e in percentuale minore (4%) nel pane d’api (Gilliam, 1997).
L’unica specie del genere Bacillus isolata nel polline floreale è B. subtilis, che sembra aumentare successivamente nelle palline di polline e nel pane d’api immagazzinato nelle celle a pettine per una settimana (Gilliam, 1979).
Dalle palline di polline oltre a Bacillus subtilis sono stati isolati anche B. circulans, B.
licheniformis, B. megaterium, B. pumilus e un ceppo atipico di B. subtilis. Il Bacillus spp.
comprende solo il 2% dei microrganismi presenti nel polline floreale, ma aumenta del 20% nelle palline di polline, per rimanere successivamente stabile intorno all’11% nel pane d’api (Gilliam, 1997).
La maggior parte delle muffe isolate appartengono ai generi Penicillium, Aspergillus e
Mucorales (Gilliam et al., 1989).
Per quanto riguarda i lieviti la maggiore presenza di questi microrganismi si ha nel polline floreale dove predominano Cryptococcus albidus, Kloeckera apiculata e Candida
guilliermondii var. guilliermondii nel polline floreale; C. g. var. guilliermondii e Trioza magnoliae nelle palline di polline; e T. magnoliae nel pane d’api (Gilliam, 1997).
Sono state effettuate inoltre delle ricerche in Portogallo per valutare la composizione microbiologica del polline portoghese. I microrganismi studiati sono stati mesofili aerobi, muffe, lieviti, coliformi fecali, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. e
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Clostridi solfito riduttori. I risultati ottenuti sono stati ottimi se confrontati ad esempio con altri test microbiologici condotti su polline brasiliano e argentino; infatti solo nel 60% dei campioni sono state isolate muffe e lieviti, mentre i microrganismi aerobi sono stati isolati nel 40 % dei campioni con cariche che variavano da 7,6 x 10² a 2,8 x 10³ Ufc/g. Per quanto riguarda i germi di interesse igienico-sanitario e per la sicurezza alimentare, coliformi fecali, E. coli, S. aureus, Clostridi solfito riduttori e Salmonella spp., non è stata riscontrata nessuna positività (Estevinho et al., 2012).
In una ricerca su polline brasiliano invece muffe e lieviti sono stati isolati nel 100 % dei campioni analizzati, con una presenza superiore a 104 Ufc/g, molto più elevata rispetto a quella rilevata nel polline portoghese (Hervatin, 2009).
Coronel et al., (2004) hanno riscontrato in 23 campioni di polline argentino la presenza di coliformi fecali, oltre che ad una contaminazione da parte di muffe e lieviti, identificando circa 20 specie che rendevano il polline un alimento pericoloso per il consumo. Tra le specie identificate vi erano: Aspergillus flavus, Alternaria alternata, Fusarium graminearum,Penicillium citrinum, P.funiculosum.
E’ stato stimato come lo sviluppo di microrganismi aerobi, muffe e lieviti sia strettamente correlato al pH e all’aw (Estevinho et al., 2012).
E’ stato riportato che il valore di aw ottimale per muffe e lieviti è pari a 0,61; a 0,86 per
Clostridium spp. e a 0,93 per Staphylococcus aureus e Bacillus spp. (Jay, 2007).
Il polline portoghese presentava valori di pH che variavano da 4,33 a 6,33, mentre l’aw presentava valori tra 0,32 e 0,55. Muffe e lieviti sono in grado di crescere con valori di pH >4,96, ma la moltiplicazione era inibita dall’aw troppo bassa. Questi risultati indicano quanto l’aw influisca sulla qualità microbiologica del polline, caratteristica di primaria importanza poiché l’aumento di microrganismi nel polline può essere causa di danni alla salute umana (Estevinho et al., 2012).
Inoltre i 3 generi microbici Lactobacillus, Saccharomyces e Pseudomonas sono
fondamentali durante la conservazione del polline. Lactobacillus spp. porta alla produzione di acido lattico con conseguente acidificazione dello stesso, che si conclude in 15 giorni, anche se la carica microbica di questi microrganismi rimane stazionaria per diversi mesi nel polline. Il ruolo diPseudomonas e diSaccharomyces non è ad oggi ben chiaro. Si pensa
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che Pseudomonas probabilmente contribuisca a creare le condizioni di anaerobiosi
richieste da Lactobacillus spp. e alla degradazione delle pareti dei granuli pollinici. Pseudomonas spp. sviluppa infatti velocemente non appena il polline viene depositato
dalle api nelle celle, ma già dopo 2-3 giorni la sua presenza non è più riscontrata (Pain e Maugenet, 1966).
Per quanto riguarda invece i lieviti, inizialmente sono presenti in numero ridotto, ma aumentano e rimangono in cariche più elevate degli altri microrganismi dopo la fermentazione. Per comprendere il ruolo che questi microrganismi potessero avere è stata effettuata una prova che ha previsto la contaminazione sperimentale di polline sterilizzato mediante raggi gamma con Lactobacillus spp. Ciò che ne è scaturito è stato il fatto che una pura fermentazione lattica porta ad un prodotto poco appetibile e di scarso valore nutrizionale per le api. Di conseguenza i lieviti svolgono un ruolo importante per una corretta fermentazione del polline (Pain e Maugenet, 1966).
Inoltre i sistemi enzimatici coinvolti nella fermentazione del polline sono simili a quelli dei lieviti (Okunoki, 1943).
1.10.1 La flora lattica del polline
Di recente è stata messa in evidenza una elevata presenza di batteri lattici (LAB) nello stomaco delle api mellifere (Apis mellifera). In uno studio svolto in Svezia si è andato a ricercare la presenza dei LAB in polline e pane d’api svedese. I batteri isolati da questi prodotti sono stati poi identificati utilizzando l’analisi del gene 16S rRNA. Dei 12 generi differenti di LAB, 8 erano presenti nel polline, di questi 6 appartenevano al genere
Lactobacillus e 2 al genere Bifidobacterium. Sono state poi isolate 2 specie appartenenti
alla famiglia delle Pasteurellaceae. Mentre per quanto riguarda il pane d’api sono stati isolati 9 ceppi di LAB, tutti appartenenti al genere Lactobacillus (Vásquez e Olofsson,
2009).
Come accennato precedentemente si è constatato come i lattobacilli partecipino alle trasformazioni biochimiche che avvengono durante la fermentazione del polline contenuto nelle celle. Si tratta di un processo analogo a quello dell’insilamento del foraggio verde. Effettivamente pare che un azione batterica aerobica duri circa 12 ore. Questo periodo è
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seguito da un accumulo di microrganismi produttori di acido lattico con conseguente aumento dell’acidità fino al raggiungimento di un pH di circa 4. In secondo ordine si ha lo sviluppo delle muffe che utilizzano l’acido lattico e rendono il pane d’api ad alta digeribilità per l’insetto (Chevtchik, 1950; Pain e Maugenet, 1966).
1.11 L’attività antimicrobica del polline
Numerosi studi sono stati condotti per valutare l’attività antimicrobica del polline e dei suoi componenti. In uno studio sul polline proveniente dall’albero Eucalyptus globulus e dalle piante Ranunculus sardous e Ulex europeans ad esempio sono stati individuati diversi flavonoidi. Il flavonoide erbacetina, derivante dal polline delle piante Ranunculus sardous
e Ulex europeans ha mostrato una marcata attività antimicrobica contro Pseudomonas aeruginosa. Il polline di Eucalyptus globulus, ricco di quercetina, invece non ha mostrato
nessuna attività antimicrobica (Campos, 1997; Campos et al., 1998).
Un altro studio sull’attività antimicrobica è stato effettuato su campioni di polline provenienti da Spagna e Portogallo. Sono stati testati 8 campioni: il campione A di cui non è stata specificata la provenienza; i campioni B, C, D e G acquistati in Portogallo e i campioni E, F, H acquistati in Spagna. I microrganismi testati sono: Staphylococcus aureus ATCC 6538ᵀᴹ e S. aureus ESA 159; Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442ᵀᴹ eP. aeruginosa ESA 22; Escherichia coli ATCC 25922ᵀᴹ e E. coli ESA 37; Candida glabrata
ATCC 66032ᵀᴹ e C. glabrata ESA 123. Il campione H ha presentato la maggiore attività antimicrobica. Il microrganismo più sensibile è risultato lo stafilococco, sia il ceppo S.
aureus ATCC 6538ᵀᴹ che il ceppo S. aureus ESA 159, sensibili soprattutto al campione di
polline H, seguiti da P. aeruginosa ATCC 15442ᵀᴹ e P. aeruginosa ESA 22 che hanno presentato anch’essi una maggiore sensibilità verso il campione H. E. coli ATCC 25922ᵀᴹ e E. coli ESA 37 sono risultati essere i ceppi più resistenti a tutti i campioni di polline testati. Per quanto riguarda C. glabrata ATCC 66032ᵀᴹ e C. glabrata ESA 123, il campione di polline con maggiore azione inibitoria è risultato essere il campione E (Pascoal et al., 2014).
Sempre in Portogallo è stata effettuata un’ulteriore ricerca sull’attività antimicrobica del polline. Questa volta sono stati esaminati 5 pollini provenienti da 5 parchi nazionali
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portoghesi ed i microrganismi esaminati sono stati sia Gram positivi, nello specifico
Staphylococcus aureus e Bacillus cereus, che Gram negativi, Escherichia coli e Salmonella enterica ser. Typhi. Tutti e 5 i campioni di polline hanno dimostrato attività antimicrobica
su tutti i microrganismi testati. Il migliore risultato è stato ottenuto nei confronti dei Gram positivi, per i quali l’attività antimicrobica è stata osservata anche in presenza di concentrazioni basse di polline. Mentre per i Gram negativi l’attività antimicrobica è stata osservata utilizzando concentrazioni di polline più alte (Morais et al., 2011).
Basim et al., nel 2006 hanno svolto uno studio relativo all’attività antimicrobica di estratti di polline d’api, attraverso metanolo puro, raccolto in Turchia contro 13 specie di batteri patogeni per le piante, quali Agrobacterium tumefaciens, A. vitis, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Erwinia amylovora, E. carotovora pv. carotovora, Pseudomonas corrugata, P. savastanoi pv. savastanoi, P. syringae pv. phaseolicola, P. syringae pv. syringae, P. syringae pv. tomato, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas ampestris pv. campestris e X. axonopodis pv. vesicatoria. I risultati hanno mostrato che gli
estratti di polline impiegati oltre ad avere un’azione inibitoria verso tutti i batteri testati hanno le potenzialità per diventare un protettore delle sementi perché è noto che alcuni di questi batteri patogeni si trasmettono tramite i semi.
Un altro studio è stato svolto in Turchia per valutare l’attività antimicrobica del polline utilizzando estratti di polline allo 0,02% e al 2,5% di metanolo. I microrganismi testati sono stati batteri, muffe e lieviti. Nello specifico Bacillus cereus, B. subtilis, Escherichia
coli, Salmonella enterica sv. Thyphimurium, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes. Saccharomyces cerevisiae, Candida rugosa, Aspergillus niger e Rhizopus oryzae. In questo caso, al contrario della
ricerca citata precedentemente, non è stata rilevata nessuna attività antimicrobica nei confronti di nessuno dei microrganismi testati sia per quanto riguarda l’estratto di polline allo 0,02% di metanolo che al 2,5% di metanolo (Erkmen et al., 2008).
E’ stato riportato inoltre che nessuno dei campioni di polline ha avuto effetto antimicotico contro Candida albicans e S. cerevisiae (Gür et al., 2001).
In uno studio condotto da Özcan et al., nel 2003 è stata addirittura evidenziata un’attività di promozione della crescita di estratti di polline al 2% di metanolo nei confronti di
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Alternaria alternata e Fusarium oxysporium.
Anche in Brasile è stata testata l’attività antimicrobica di estratti di polline, ottenuti con concentrazioni di etanolo dal 40% al 90%, provenienti dallo stato di Alagoas e dallo stato di Paraná. I microrganismi presi in esame sono stati Staphylococcus aureus ATCC 25923;
Bacillus cereus e B. subtilis ATCC 21332; Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442; Klebsiella spp.. Dai risultati ottenuti è emerso che l’estratto di polline al 60%, proveniente
dallo stato di Paraná, era in grado di inibire B. subtilis (sensibile anche all’estratto di polline al 40-50-70% di etanolo), P. aeruginosa, Klebsiella spp. Staphylococcus aureus e
B. cereus non hanno mostrato sensibilità verso nessuno degli estratti di polline a cui sono
stati sottoposti. Inoltre è stato constatato che l’estratto di polline al 90% aveva una maggiore azione contro Klebsiella spp. Di contro l’estratto di polline, al 50 e 60%, proveniente dalla stato di Alagoas è riuscito ad inibire B. cereus, B. subtilis e Klebsiella spp. (Carpes et al., 2007).
E’ stato inoltre osservato che composti idrofobici del polline di natura sconosciuta, presentavano attività antimicrobica verso streptococchi β emolitici (Tichy e Novak, 2000). Anche in Grecia sono stati testati estratti di polline e flavonoidi per verificare un’eventuale attività antimicrobica nei confronti di 6 ceppi batterici, Gram positivi e Gram negativi, e 3 funghi patogeni per l’uomo. Per quanto riguarda i Gram positivi sono stati testati
Staphylococcus aureus ATCC 25923 e S. epidermidis ATCC 12228. Mentre per i Gram
negativi sono stati testati Escherichia coli ATCC 25922; Enterobacter cloacae ATCC 13047; Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 227853. Infine per i funghi sono stati considerati Candida albicans ATCC 10231; C. tropicalis ATCC 13801 e C. glabrata ATCC 28838. I risultati hanno mostrato che l’estratto in diclorometano ha mostrato un’attività antimicrobica debole, mentre quelli in metanolo e gli estratti acquosi hanno dimostrato una buona attività antibatterica soprattutto nei confronti dei Gram positivi, tuttavia hanno mostrato un’attività antifungina debole. Risultati positivi sono stati ottenuti anche dai flavonoidi testati che hanno mostrato anch’essi un’attività antimicrobica verso i Gram positivi. E. coli invece si è rilevato il batterio più resistente tra tutti quelli testati (Graikou et al., 2011).
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antimicrobica di estratti polline, propoli e cera d’api contro alcuni microrganismi patogeni, muffe e lieviti. Gli estratti di polline sono stati ottenuti con il 99,9% e con il 70% di metanolo e con il 96 % e 70% di etanolo. I batteri utilizzati sono stati Gram positivi tra cui Listeria monocytogenes Ccm 4699 e Staphylococcus aureus Ccm 3953 e Gram negativi, in particolare Escherichia coli Ccm 3988; Salmonella enterica Ccm 4420 e
Pseudomonas aeruginosa Ccm 1960. Per quanto riguarda i funghi sono stati testati Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger; mentre per i lieviti sono stati
testati 7 ceppi tra cui Candida krusei, Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Geotrichum candidum, Rhodotorula mucilaginosa. Dopo
48 ore Escherichia coli Ccm 3988 è risultato essere il più sensibile all’estratto di polline in
metanolo al 99,9% seguito, da Staphylococcus aureus Ccm 3953, Salmonella enterica Ccm 4420, Pseudomonas aeruginosa Ccm 1960, Listeria monocytogenes Ccm 4699. E. coli è risultato sensibile anche all’estratto di etanolo al 96%, insieme a S. aureus, e al 70%. Per quanto riguarda le muffe Aspergillus fumigatus si è rilevato il più sensibile al 99,9%,
seguito da Aspergillus niger e Aspergillus flavus. A. niger è risultato il più sensibile
all’estratto di polline in metanolo al 70%, mentre A. fumigatus all’estratto di polline al 70%
di etanolo. Tra i funghi, Candida albicans ha mostrato la maggiore sensibilità all’estratto di
polline in metanolo al 99,9%, Candida glabrata all’estratto di polline al 70% di metanolo,
Candida krusei all’estratto di polline in etanolo al 96% e Rhodotorula mucilaginosa
all’estratto di polline al 70% in etanolo (Kakaniova et al., 2012).
Un’ulteriore ricerca è stata svolta in Slovacchia da Fatrcová-Šramková et al., nel 2013 per testare l’attività antimicrobica di estratti di polline uniflorale di colza, papavero e girasole, contro alcuni batteri patogeni per l’uomo ossia Listeria monocytogenes CCM 4699;
Pseudomonas aeruginosa CCM 1960; Staphylococcus aureus CCM 3953; Salmonella enterica CCM 4420 e Escherichia coli CCM 3988. Il microrganismo più sensibile
all’estratto di polline di papavero in etanolo al 70% dopo 24 ore è stato Staphylococcus
aureus CCM 3953, mentre lo stesso polline estratto in metanolo al 70% ha mostrato attività
antimicrobica nei confronti di Listeria monocytogenes CCM 4699, Salmonella enterica
CCM 4420 e Escherichia coli CCM 3988. L’estratto di polline di colza in etanolo al 70% ha mostrato una buona azione antimicrobica verso Listeria monocytogenes CCM 4699 e
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Pseudomonas aeruginosa CCM 1960 dopo 24 ore e dopo 48 ore in metanolo al 70% su Salmonella enterica CCM 4420. La migliore attività antimicrobica è stata riscontrata
nell’estratto di polline di girasole che (al 70 % di metanolo) presentava dopo 48 ore un’azione antimicrobica su Listeria monocytogenes CCM 4699; inoltre lo stesso estratto di polline (al 70 % di etanolo) presentava tale azione dopo 24 e 48 ore su Salmonella enterica CCM 4420.
2. Il latte
Il “latte alimentare” viene definito come il prodotto ottenuto dalla mungitura regolare, ininterrotta e completa, della mammella di animali in buono stato di salute e nutrizionale stando alla definizione del Regio Decreto 9/5/1929 n.994. Questa descrizione è stata successivamente semplificata definendo il latte come il prodotto della mungitura di una o più vacche dal Reg. CE 18/12/1997 n. 2597, il quale prevede inoltre che il latte potrà essere prodotto anche da femmine di altre specie animali purchè appartenenti ad allevamenti sottoposti a regolari controlli dai servizi veterinari (Colavita, 2008).
Essendo il latte prodotto anche da altre specie animali ha una composizione molto variabile. In tabella 3 è riportata la composizione indicativa del latte bovino (Mucchetti e Neviani, 2006).
Tabella 3: composizione indicativa del latte bovino (%).
Latte bovino
Min % Medio % Max %
Acqua 87
Lattosio 4,4 4,8 5,0
Ceneri 0,6 0,7 0,8
Proteine 2,8 3,3 3,8
Grasso 3,3 4,0 4,7
Nel nostro Paese sono disponibili in commercio diverse varietà di latte di cui le principali sono: latte a rapido consumo il quale a sua volta è categorizzato in:
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ghiandola mammaria di animali che non sia stato sottoposto a temperatura di 40 °C o a un trattamento con effetto equivalente;
Latte pastorizzato;
Latte pastorizzato fresco;
Latte pastorizzato fresco di alta qualità;
Latte pastorizzato microfiltrato;
Latte alto pastorizzato;
altre varietà di latte sono: latte a lunga conservazione UHT (Ultra High Temperature); latti speciali:
a scambio indiretto di calore;
a scambio diretto per iniezione di vapore;
a scambio diretto per infusione nel vapore;
sterilizzato in bottiglia;
e latte di altre specie animali: latte di capra UHT (Mucchetti e Neviani, 2006).
2.1 Principali microrganismi patogeni nel latte
Il latte ha una composizione chimica che rappresenta un ottimo terreno di coltura per lo sviluppo di microrganismi patogeni. Per questo motivo è molto importante prevenire o cercare di ridurre eventuali contaminazioni in tutte le fasi produzione di questo prodotto, cioè dall’allevamento fino alla vendita, attraverso l’applicazione di azioni preventive che garantiscano qualità e sicurezza del prodotto per evitare possibili danni alla salute del consumatore (Mucchetti e Neviani, 2006).
Tra i microrganismi patogeni che possono essere veicolati dal latte troviamo:
Salmonella spp.; Staphylococcus aureus; Listeria monocytogenes; Enterococcus spp.; Mycobacterium tubercolosis e M. bovis; Brucella spp.; Campylobacter spp.; Escherichia coli; Yersinia enterocolitica; Streptococchi β- emolitici; (Mucchetti e Neviani, 2006).
Tra questi quelli che hanno interessato la parte sperimentale del presente lavoro di tesi sono stati: Enterococcus faecalis; Staphylococcus aureus; Listeria monocytogenes;
34 2.1.1 Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis è la specie coinvolta nell’80 % delle infezioni enterococciche; questi
microrganismi vivono comunemente nell’intestino e nelle feci di animali e uomo; è un batterio Gram positivo, immobile, anaerobio facoltativo, omofermentante, cresce a temperatura compresa tra 10 e 45 °C disposto in catenelle corte o a coppie (fig. 6). Alcuni di essi sono mobili per la presenza di piccoli flagelli. Prima erano meglio conosciuti come streptocchi del gruppo D di Lancefield (Mucchetti e Neviani, 2006; Farina e Scatozza, 1998).
Figura 6: immagine al microscopio a scansione di Enterococcus faecalis (www.bacteriainphotos.com)
2.1.2 Staphylococcus aureus
Il Genere Staphylococcus è rappresentato da microrganismi di forma sferica (fig.7), Gram positivi, immobili, aerobi facoltativi (Colavita, 2008).
Sono microrganismi mesofili, la cui temperatura di crescita si aggira intorno ai 25- 40 °C, anche se la temperatura ideale di sviluppo è compresa tra 30 e 37 °C con un pH tra 7,0 e 7,5; sono alotolleranti in quanto riescono a sopravvivere a percentuali di NaCl del 7,5 % (Jay et al., 2009).
All’interno del genere Staphylococcus abbiamo una suddivisione in 2 gruppi in base alla produzione dell’enzima coagulasi: Stafilococchi Coagulasi Positivi (SCP) e Stafilococchi Coagulasi Negativi (SCN) (Colavita, 2008).
Questi microrganismi si posso ritrovare nella carne, nel latte, nel formaggio ed alcuni possono essere patogeni per l’uomo e per gli animali come appunto Staphylococcus aureus
