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UNIVERSITA’ DI PISA
FACOLTA’ DI FARMACIA
Corso di Laurea Specialistica in Farmacia
Tesi di Laurea
GLUCOSIO E CERVELLO: COME IL NECESSARIO DIVENTA RISCHIO.
Relatori :
Chiar.mo Prof. Antonio Lucacchini
Chiar.mo Prof. Gino Giannaccini
Candidato :
Francesca Bosi
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Agli anni 1980∞2014, a chi li ha accompagnati.
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“La più fresca e più lieve di tutte le silfidi esiste, ma nessuno saprà mai qual’è, perchè nessuna mano l’avrà mai raccolta, nessun velo l’avrà mai toccata, nessuna parola l’avrà mai sfiorata”.
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INTRODUZIONE
Nella seguente trattazione viene esaminato approfonditamente il metabolismo del glucosio in relazione alla sua indispensabile funzione di garante dell’attività cerebrale. E’ noto, infatti, che il cervello dei mammiferi usa come substrato (quasi) esclusivo il glucosio per rifornirsi dell’energia necessaria ad espletare ininterrottamente le sue molteplici funzioni.
Viene quindi fornito, nel dettaglio, il panorama delle implicazioni del metabolismo cerebrale del glucosio focalizzando l’attenzione sulle più recenti scoperte riguardo la bioenergetica della neurotrasmissione, la composizione cellulare della rete metabolica, la regolazione del flusso ematico cerebrale, il controllo del Sistema Nervoso Centrale sull’omeostasi energetica e sul metabolismo periferico del glucosio, con particolare riguardo all’azione dell’ormone insulina ed infine riguardo alla regolazione dell’apoptosi ad opera di enzimi coinvolti nel metabolismo cerebrale del glucosio.
Risultando evidente il coinvolgimento del metabolismo del glucosio in un’ampia varietà di meccanismi cerebrali si è focalizzata l’attenzione sulla possibilità che, talvolta, questi meccanismi indispensabili alla sopravvivenza possano andare incontro a squilibri e condurre a situazioni problematiche.
Lo scopo di questa tesi è proprio quello di analizzare come una molecola apparentemente innocua, o meglio, assolutamente indispensabile alla vita, possa rivelarsi, in determinate condizioni, perfino dannosa e responsabile dell’insorgenza di malattie neurodegenerative se non addirittura di vera e propria “tossicodipendenza”.
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I° METABOLISMO CEREBRALE DEL GLUCOSIO: Alimentazione del cervello
Il cervello dei mammiferi dipende dal glucosio come principale fonte di energia. Nel cervello adulto, i neuroni hanno la più elevata domanda di energia (1) e richiedono un continuo apporto di glucosio dal sangue. Negli esseri umani il cervello costituisce circa il 2% del peso corporeo, ma consuma circa il 20% dell’energia che deriva dal glucosio, costituendo il principale consumatore di glucosio (circa 5,6 mg di glucosio per 100g di tessuto cerebrale al minuto) (2). Il metabolismo del glucosio fornisce il carburante per la funzione fisiologica del cervello attraverso la generazione di ATP, la base per il mantenimento cellulare neuronale e non-neuronale, nonché la generazione di neurotrasmettitori. Per questo, la regolazione precisa del metabolismo del glucosio è fondamentale per la fisiologia del cervello ed alterazioni di esso sottendono diverse malattie sia cerebrali che dell’intero organismo.
Al fine di compredere il ruolo fondamentale del metabolismo del glucosio nella funzione fisiologica e patologica del cervello vengono esaminate la bioenergetica della neurotrasmissione, la composizione cellulare di una rete metabolica, la regolazione del flusso di sangue cerebrale (Cerebral Blood Flow CBF), il modo in cui il metabolismo periferico del glucosio e l’omeostasi di energia sono avvertiti e controllati dal sistema nervoso centrale (Central Nervous System CNS), e la regolazione precisa della sopravvivenza cellulare attraverso enzimi che metabolizzano il glucosio.
Il glucosio è richiesto per fornire i precursori per la sintesi dei neurotrasmettitori ed ATP per alimentare la loro azione e per le richieste di energia del cervello che non sono collegate alla segnalazione. La compartimentazione cellulare del trasporto e del metabolismo del glucosio è intimamente correlata alla regolazione locale del flusso sanguigno e neuroni rilevatori del glucosio regolano l’asse dei nutrienti cervello-corpo. Il metabolismo del glucosio è correlato ai meccanismi di morte cellulare attraverso gli enzimi che metabolizzano il glucosio. Perciò, disfunzioni nei canali di somministrazione e metabolismo del glucosio portano a invalidanti malattie del cervello. Si sottolineano il ruolo polivalente e la complessa regolazione del metabolismo del glucosio nel sistema nervoso centrale (CNS) nonché le conseguenze fisiologiche e patologiche di un metabolismo del glucosio bilanciato o disturbato
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Figura 1: il ruolo del glucosio nella funzionalità cerebrale. A Centri specializzati del cervello, inclusi neuroni POMC ed AgRP ipotalamici, rivelano livelli centrali e periferici di glucosio e regolano il metabolismo del glucosio attraverso il nervo vago così come tramite segnali neuroendocrini. B La fornitura di glucosio al cervello è regolata da accoppiamento neurovascolare e potrebbe essere modulata da meccanismi metabolismo dipendenti e indipendenti. Il glucosio entra nel cervello dal sangue attraverso la BBB grazie al trasportatore GLUT1 e C il glucosio ed altri metaboliti (come Lac) vengono rapidamente distribuiti tramite una rete di cellule cerebrali metabolicamente altamente accoppiate. D Il glucosio fornisce l’energia per la neurotrasmissione e E molti enzimi metabolizzanti il glucosio controllano la sopravvivenza delle cellule.
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Base bioenergetica per la neurotrasmissione.
La maggior parte dell’energia nel cervello è consumata per il calcolo neuronale e per l’elaborazione delle informazioni (3); per esempio, la generazione di potenziali d’azione e potenziali postsinaptici generati dopo eventi sinaptici (figura 1D) e il mantenimento di gradienti ionici e potenziale di riposo neuronale (1,4). Significativamente, il glicogeno astrocitico sembra essere direttamente rilevante per l’apprendimento (5). Oltretutto, il lattato glicolitico finale, sembra avere un ruolo nella formazione della memoria a lungo termine (6), nonostante il meccanismo esatto non sia stato ancora stabilito. Aggiunte di lattato (6) alterano lo stato redox intracellulare e il pH a causa del co-trasporto di H+ con il lattato, e i recettori di lattato potrebbero anche svolgere un ruolo di collegamento tra il metabolismo energetico del cervello e la neurotrasmissione (7,8). Comunque, il metabolismo ossidante sia nei neuroni che negli astrociti sembra contribuire agli effetti di memorizzazione duratura dopo l’apprendimento, e il glicogeno può fornire il carbonio per la sintesi del glutammato durante l’apprendimento (5)
E’ stato suggerito che i potenziali d’azione sono stati resi altamente efficienti grazie all’evoluzione (9) e, per questo, molta dell’energia consumata nel cervello è usata per l’attività sinaptica (3,9,10). La corteccia umana da sola richiede approssimativamente 3x1023 ATP/s/m3 (1), e il dispendio di energia per rilasciare una vescicola sinaptica è stimato essere approssimativamente 1,64x105 molecole di ATP (3). In sostanza, il cervello aumenta l’utilizzo di glucosio una volta attivato. (12).
Assorbimento di glucosio nel cervello, nutrimento per i neuroni e gli astrociti
La dipendenza del cervello dal glucosio come carburante obbligatorio, deriva principalmente da dalla barriera ematoencefalica (Blood-Brain-Barrier BBB) e dalla sua permeabilità selettiva per il glucosio nel cervello adulto. Il glucosio non è sostituibile come fonte di energia, ma può essere integrato, come durante un’attività fisica faticosa quando il livelli di lattato nel sangue aumentano (13) o quando i livelli di corpi chetonici nel sangue sono elevati e i livelli di trasportatori di acidi monocarbossilici (MCT) nella BBB sono up-regolati. Poiché l’ingresso di composti neuro attivi (come ad es. glutammato, aspartato, glicina o D-serina) nel cervello è limitato dalla BBB, questi
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composti devono essere sintetizzati a partire dal glucosio all’interno del cervello. La BBB e le sue proprietà di trasporto si differenziano nettamente rispetto a muscoli e fegato, che non hanno giunzioni strette tra le loro cellule endoteliali vascolari ed hanno vari livelli di trasporto per composti differenti, che permettono a questi organi di metabolizzare glucosio, acido monocarbossilico, acidi grassi, aminoacidi, e corpi chetonici.
L’elevto gradiente di concentrazione sangue-cervello guida il trasporto facilitato di glucosio attraverso le membrane endoteliali tramite il trasportatore di glucosio 1 (GLUT1) dentro il fluido extracellulare (figure 1B e 2). Il tasso stabile di concentrazione di glucosio nel tessuto cerebrale è approssimativamente del 20% di quello del plasma arterioso. Poi il GLUT1 media l’assorbimento di glucosio dal fluido extracellulare a dentro a astrociti, oligodendroglia, e microglia, mentre GLUT3, che ha un più alto tasso di trasporto rispetto al GLUT1, facilita l’assorbimento neuronale del glucosio (figure 1C e 2B) (14). La capacità di trasporto del glucosio eccede ampiamente la domanda, e il più alto tasso di trasporto del GLUT3 assicura che i neuroni abbiano una scorta sufficiente di glucosio per variabili livelli di glucosio e diversi stati di attività (15). Nonostante si ritenga comunemente che gli astrociti siano coinvolti nell’assorbimento e nella distribuzione di metaboliti del cervello (3,16,17), il modello prevede che la maggior parte del glucosio diffonda dalle cellule endoteliali attraverso gli spazi tra le ramificazioni che circondano gli astrociti, e attraverso il fluido extracellulare sino a più lontane cellule cerebrali, facilitando il veloce assorbimento nei neuroni mediato dal GLUT3 (14). Comunque, una parte di glucosio potrebbe anche essere assorbita entro le estremità astrocitiche, seguita dalla diffusione secondo i suoi gradienti di concentrazione sino agli altri astrociti collegati tramite interconnessioni cellulari, con rilascio al fluido extracellulare in zone più distanti del capillare (3,16,17).
I tassi locali di utilizzo del glucosio sono determinati da attività funzionali (figura 1D) che consumano ATP e generano ADP, che è un co-sostrato obbligatorio per le reazioni che producono energia. Il glucosio intracellulare è fosforilato da esochinasi I (HKI) per formare glucosio-6-fosfato (Glc-6-P), intrappolando quindi la molecola nella cellula e, perciò, creando un gradiente che porta più glucosio nella cellula (figura 2 A). La dimensione dell’accumulo di glucosio intracellulare è mantenuta come equilibrio netto
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tra le sue capacità di afflusso, efflusso e metabolismo. La Km (costante di saturazione
media) di HKI per il glucosio è bassa (18) e, perciò, l’HKI può operare alla massima velocità finchè il glucosio intracellulare supera approssimativamente gli 0,8-1mmol/L. Glc-6-P (glucosio 6 fosfato) e può incentivare il flusso HKI fino a 20 volte, una capacità che supera grandemente l’aumento, dalla 4 alle 6 volte, del tasso cerebrale metabolico del glucosio (CMRglc) durante le crisi epilettiche e ischemie (19,20). Il Glc-6-P non è
metabolizzato solo per via glicolitica per generare ATP, ma è anche il substrato per la via del pentoso fosfato (PPP – pentos phosphate pathway) che genera NADPH per gestire lo stress ossidativo e per sintetizzare precursori di acido nucleico (figura 2A). Si ritiene che la fosfofruttochinasi sia il principale regolatore della via glicolitica a causa della sua regolazione allosterica da parte di molti metaboliti (ad es. inibizione da ATP, citrato, H+, e attivazione da ADP, AMP, fruttosio-6-fosfato, fruttosio 1, 6, -P2, fruttosio
2, 6, -P2, e ribosio 1,5, -P2) che agiscono di concerto per integrare i flussi delle vie del
ciclo dell’acido glicolitico e tricarbossilico (TCA). Il metabolismo del glucosio è anche la fonte per la biosintesi di altri composti richiesti dal cervello, inclusi carboidrati complessi che sono componenti di glicoproteine e glicolipidi, aminoacidi, donatori di monocarbonio per le reazioni di metilazione, e la fornitura di precursori dei neurotrasmettitori (15,21). Per riassumere, il CMRglc è controllato in ogni cellula dal
livello di produzione di ADP (ad es. domanda/richiesta di ATP), e dalla regolazione di enzimi da metaboliti di controllo del livello.
Negli astrociti, il Glc-6-P è il precursore per il glicogeno, un polimero che comprende residui di glucosio. Il glicogeno è l’unica riserva di energia nel cervello (Figura 2A, B). In un cervello normale, il ricambio di glicogeno avviene a normali livelli di glucosio, coerentemente con il suo ruolo di importante accumulatore di energia locale per gli astrociti, ed è mobilitato dall’attivazione funzionale o da deficit energetici (22,23). Il modello prevede che la glicogenolisi riduca l’utilizzo di glucosio astrocitico mantenendo livelli di Glc-6-P sufficienti a sostenere un’elevata inibizione di HKI, in tal modo risparmiando glucosio per i neuroni (24). In caso di grave ipoglicemia o aglicemia, bassi livelli di glicogenolisi equivalenti a solo una percentuale dei livelli di normale utilizzazione del glucosio, sono sufficienti a protrarre le funzioni neuronali (15,21).
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Per mantenere il flusso glicolitico, il NADH prodotto dalla gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) deve essere ossidato. La rigenerazione del NAD+ può avvenire con due meccanismi: lo shuttle malato-aspartato (MAS) o la reazione della lattato deidrogenasi (LDH). Il MAS è necessario per la generazione di piruvato quale combustibile ossidativo, l’ LDH è associata al rilascio di lattato (figura 2A).
Nella (resting-awake brain) fase di riposo del cervello da svegli la maggior parte del glucosio è completamente ossidata a CO2 ed acqua, e viene consumato un ammontare
quasi stechiometrico di CO2 (es: 6 O2 per glucosio). A causa delle reazioni biosintetiche
e dello scarso efflusso di lattato dal cervello il rapporto di consumo ossigeno:glucosio è in genere approssimativamente 5.5-5.8. In diverse condizioni, che spaziano dall’anestesia profonda allo stato conscio, il grado di ossidazione neuronale del glucosio è approssimativamente proporzionale alla neurotrasmissione glutamatergica, ciò indica che il tasso del principale canale di produzione di energia nei neuroni (il ciclo TCA, figura 2) è direttamente collegato alle richieste di energia associate al flusso attraverso il ciclo glutammato glutamina (figura 2B) (15).
Durante l’attivazione del cervello, la glicolisi è di solito preferibilmente upregolata rispetto al consumo di ossigeno (15), e il rapporto di utilizzo ossigeno:glucosio si abbassa. Poiché questo fenomeno si verifica in soggetti normali e normossici che hanno un apporto di ossigeno in eccesso al cervello, è a volte denominato glicolisi aerobica per distinguerlo dal forte incremento nella glicolisi durante l’ipossia o l’anossia. La stimolazione della glicolisi genera maggiori quantitativi di lattato che non può essere rilasciato solo dal cervello (figura 2), ma può anche avere varie importanti funzioni, tra cui servire come un combustibile ossidativo supplementare per gli astrociti e i neuroni, modulare la segnalazione dello stato di ossidoriduzione metabolico, regolare il flusso sanguigno (15), o fungere da mediatore delle informazioni metaboliche (8)
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Figura 2: Generazione di energia nel cervello e tre modelli del destino del lattato derivato dal metabolismo del glucosio nel cervello. A Maggiori meccanismi del metabolismo del glucosio. L’esochinasi usa ATP per fosforilare il glucosio a glucosio-6-fosfato (Glc-6-P) nella prima tappa, irreversibile, della via glicolitica. Glc-6-P regola l’attività dell’eochinasi tramite inibizione a feedback e costituisce un punto di ramificazione verso alternativi destini metabolici. Glc-6-P può continuare lungo la via glicolitica fino alla generazione di piruvato che può essere usato nei mitocondri per il metabolsmo ossidativo tramite il ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA). Può anche entrare nella via dei pentoso-fosfato (PPP) per generare NADPH per la gestione dello stress ossidativo e per la biosintesi dei precursori degli acidi nucleici e, negli astrociti, il Glc-6-P è il precursore del glicogeno. La maggior parte del carbonio derivato dal glucosio nel PPP rientra nella via glicolitica a valle del Glc-6-P. La glicolisi produce 2 molecole di ATP per ogni molecola di glucosio e l’ossidazione del piruvato tramite l’acetil-Co-A nel ciclo TCA produce circa 30 molecole di ATP per un totale di 32 molecole di ATP. La formazione del piruvato a partire dal glucosio richiede la rigenerazione del NAD+ a partire dal NADH prodotto dalla reazione della gliceraldeide-3-P-deidrogenasi tramita la via MAS. Il NADH non può attraversare la membrana mitocondriale e MAS trasferisce NADH citoplasmatico ai mitocondri, dove viene ossidato tramite la catena di trasporto degli elettroni (ETC). Quando il flusso glicolitico supera quello di MAS o del TCA, o durante condizioni ipossiche e anossiche, il NAD+ viene rigenerato dalla reazione della LDH (lattatodeidrogenasi) che converte il piruvato in lattato. Poichè l’accumulo intracellulare di lattato potrebbe causare la reazione inversa dell’LDH, il lattato deve essere dalla cellula dai trasportatori degli acidi monocarbossilici (MCT). L’uscita di lattato impedisce che il piruvato sia un substrato ossidabile per quelle cellue e limita il rilascio glicolitico di ATP per molecola di glucosio a due. B Tre modelli per il destino del lattato generato nel cervello dal glucosio nato dal sague o per il glicogeno astrocitico. Lo shuttle di lattato da neurone ad astrocita (ANLS) fu proposto sulla base di aumenti nell’utilizzo del glucosio glutamato-indotti e rilascio di lattato da colture di astrociti. Brevemente il modello prevede che l’uptake sodio-dipendente del glutammato dal vallo sinaptico ad opera degli astrociti, generi una richiest di 2 ATP negli astrociti, uno per estrudere Na+ ed uno per convertire il
12 glutammato in glutammina nell’omonimo ciclo. Secondo il modello, questa ATP è generata dalla glicolisi ed è associata al rilascio di lattato dagli astrociti ed al suo assorbimento nei vicini neuroni dove è ossidato. L’accoppiamento metabolico è collegato al ciclo glutammato-glutammina ed è associato alla neurotrasmissione eccitatoria. Così, durante l’attivazione cerebrale, negli astrociti si verificherebbe upregolazione della glicolisi con il lattato derivato dagli astrociti che fornirebbe la maggior parte di carburante per i neuroni. Lo shuttle di lattato dai neuroni agli astrociti (NALS) è basato sulla cinetica del glucosio trasportato dentro le cellule cerebrali in risposta ad un’aumentata richiesta metabolica e su un differente modello di assunzione rispetto all’ANLS. In questo caso il glucosio verrebbe prevalentemente assorbito nei neuroni a seguito della loro maggior richiesta di energia ed al maggiore lavoro di trasporto del recettore GLUT3 rispetto al GLUT1 astrocitico. Si suppone che il lattato sia generato dai neuroni a assorbito dagli astrociti. Il modello di rilascio del lattato è basato sull’incompatibilità tra l’utilizzo totale di glucosio e il metabolismo ossidativo e il rilascio di lattato dal cervello durante l’attivazione.
Gli astrociti hanno la più grande e veloce caspacità di uptake di lattato dal fluido extracellulare e di dispersione del lattato attraverso le gap-junction tra astrociti rispetto all’uptake neuronale di lattato e allo shuttling di lattato ai neuroni. Gli astrociti possono scaricare lattato nel fluido perivascolare per efflusso dalla membrana.
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Interazioni metaboliche tra astrociti e neuroni, e shuttling del lattato
Sia i neuroni (14,25,26), che gli astrociti (17,27) sono stati descritti come i principali consumatori di glucosio. I contributi cellulari all’utilizzo complessivo di glucosio sono stati un problema controverso per decenni perché l’attuale tecnologia non dispone di un’adeguata risoluzione spaziotemporale per quantificare l’attività metabolica nelle singole cellule in vivo. Due concezioni in conflitto descrivono il prevalente destino cellulare del glucosio durante l’attivazione del cervello e propongono differenti direzioni e misure dello shuttling del lattato tra i neuroni e gli astrociti. Un terzo modello è ricavato dalla dimostrazione di un significativo rilascio di lattato dal cervello, indipendentemente dal tipo di cellula di origine (figura 2B) (15,16).
Lo shuttling di lattato da astrocita a neurone (ANLS, figura 2B) richiede che la neurotrasmissione glutamatergica stimoli la produzione di lattato che svolge il ruolo di importante carburante neuronale durante l’attivazione (27). Comunque, questa teoria rimane controversa perché il glutammato non stimola la glicolisi nella maggior parte delle preparazioni di astrociti, l’origine cellulare del lattato in vivo è sconosciuta, la significativa ossidazione del lattato nei neuroni non è stata dimostrata durante l’attivazione del cervello, e gli studi che supportano questo modello (27) sono stati contestati (15,21). Inoltre, lo stesso neurotrasmettitore glutammato potrebbe supportare direttamente l’energia degli astrociti perisinaptici, perché il trasportatore gliale di glutammato-aspartato (GLAST) forma un complesso macromolecolare che collega l’utilizzazione del glutammato alla sua ossidazione (28) che può fornire ATP per soddisfare la domanda energetica astrocitica. L’ossidazione del glutammato nel luogo del suo utilizzo elimina la necessità di una glicolisi per generare ATP e ANLS (29). Le teorie secondo cui il lattato derivato dal glicogeno sarebbe necessario in quanto base bioenergetica per la consolidazione della memoria neuronale (6,30), e che il lattato derivato dal glucosio dagli oligodendrocita sia necessario per supportare gli assoni (31,32) richiedono una prova sperimentale diretta della misura e del contributo dello shuttling del lattato rispetto ad altre fonti di energia.
Lo shuttling di lattato da neurone ad astrocita (NALS, figura 2B), si basa su assunti differenti rispetto a quelli relativi all’ANLS e tiene conto della cinetica dei trasportatori di glucosio nei neuorni e negli astrociti. Il modello NALS prevede un utilizzo
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predominante di glucosio neuronale durante l’attivazione, con trasferimento di lattato agli astrociti, in modo tale che la direzione del flusso metabolico sia contestuale (14,25). Gli astrociti hanno un ruolo chiave nell’assorbimento di lattato dal fluido extracellulare e nella dispersione di lattato agli astrociti attraverso la comunicazione tra gli spazi giunzionali; questi processi avvengono a ritmi che sono dalle due alle quattro volte più veloci rispetto all’assorbimento del lattato da parte dei neuroni o al trasferimento astrocitico di lattato ai neuroni (16). Perciò, gli astrociti sono pronti ad assorbire lattato dal fluido interstiziale e rilasciare lattato dai terminali al fluido perivascolare per lo scarico nel sistema di drenaggio linfatico e nel sangue venoso (15,16). L’utilizzo totale di glucosio eccede notevolmente il metabolismo ossidativo del glucosio, con rilascio di notevoli quantità di lattato rilasciato dal cervello attivato (figura 2B) (15,21).
L’uso del lattato come carburante supplementare varia in relazione alla sua disponibilità e allo stato fisiologico del soggetto. In soggetti sedentari, il livello di lattato del cervello eccede quello del sangue, facilitando l’efflusso di lattato dalle regioni cerebrali attivate al sangue. Per contro, un’intensa attività fisica aumenta la glicolisi nei muscoli e i livelli di lattato nel sangue, capovolgendo la direzione del gradiente di lattato dal sangue al cervello ed irrorando di lattato l’intero cervello. A queste condizioni, il lattato viene ossidato nel cervello in quantitativi che crescono con il livello di lattato ematico. Comunque, l’ossidazione di lattato nel cervello sotto sforzo accompagna l’aumento di CMRglc e il rilascio di lattato derivante dal cervello nel sangue
(33) suggerendo che esistano tragitti separati per l’efflusso e l’influsso di lattato. Per questo, un livello accresciuto di lattato nel sangue rappresenta uno stato fisiologico di risparmio di glucosio in cui l’uso di un carburante ossidativo supplementare aiuta a mantenere la disponibilità di glucosio per la via glicolitica e dei pentoso-fosfato che provvedono a funzioni fondamentali del cervello.
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Regolazione del flusso ematico cerebrale (CBF) e metabolismo del glucosio
In condizioni di riposo, il CBF locale è più alto nelle regioni del cervello che hanno il più alto metabolismo locale del glucosio. Tutte le regioni del cervello sono sempre metabolicamente attive, ma c’è una grande eterogeneità tra le varie strutture del cervello. Durante l’attivazione funzionale, l’aumento nel CBF locale di solito va in parallelo all’aumento di CMRglc mentre l’aumento nel metabolismo dell’ossigeno è
minore (34).
Questa stretta correlazione tra CBF e CMRglc (e, in minor misura, il tasso cerebrale
metabolico di ossigeno, CMRO2) richiede meccanismi altamente dinamici e finemente
regolati per adattare l’erogazione locale di glucosio e ossigeno e la rimozione di biossido di carbonio attraverso il sangue sino all’effettiva domanda delle regioni cerebrali attive. L’ipotesi “metabolica” tradizionale dell’accoppiamento neurovascolare (35), mediata da prodotti metabolici vasoattivi come lattato, CO2/H+, o adenosina, è
stata recentemente sostituita dall’ipotesi “neuronale”, al momento favorita. La quale suggerisce che la domanda di energia neuronale è comunicata al sistema vascolare (direttamente o indirettamente dagli astrociti) all’interno dell’unità neuro vascolare in modo anticipato (feed-forward) da neurotrasmettitori vasoattivi o prodotti di segnalazione sinaptica, e che la vasodilatazione si verifica indipendentemente dalla segnalazione causata dal metabolismo del glucosio (figura 1B). La proposta regolazione precontrollata è una base affidabile per un rapido adattamento del flusso sanguigno regionale al livello locale di attività neuronale, evitando così rischiosi abbassamenti nelle concentrazioni di glucosio e ossigeno, che potrebbero verificarsi durante una regolazione esclusivamente metabolica. Comunque, studi recenti suggeriscono che cambiamenti nel rapporto lattato:piruvato e, perciò, nel rapporto cistolitico NADH:NAD+ (36) o una maggiore produzione di lattato (37,38) siano almeno parzialmente responsabili della vasodilatazione durante l’attivazione neuronale. Perciò, l’accoppiamento neurovascolare regolato da una segnalazione precontrollata può essere integrato o modulato da meccanismi dipendenti dal metabolismo (39).
Studi sperimentali mostrano che è improbabile che i meccanismi diretti di rilevamento del glucosio siano coinvolti nella regolazione indotta del CBF. Nemmeno l’iperglicemia o un’ipoglicemia da lieve a moderata cambiano significativamente le risposte del flusso
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sanguigno all’attivazione funzionale (40,41). In aggiunta, durante l’ipoglicemia acuta, l’abbassamento del CBF aumenta significativamente solo quando il glucosio del sangue e del cervello viene sensibilmente ridotto (42).
Le conseguenze di un adattamento compromesso del flusso cerebrale sanguigno (CBF) al CMRglc (tasso cerebrale metabolico del glucosio), sono oggetto di accurata ricerca.
Una riduzione artificiale della risposta del CBF durante l’attivazione funzionale non ha avuto impatto su un’attività neuronale provocata in una condizione sperimentale acuta (43). Comunque, si presume che l’ipoperfusione globale cronica del cervello potrebbe non essere solo una conseguenza, ma anche una causa primaria della neurodegenerazione vascolare nella demenza e nel morbo di Alzheimer (AD) (44). Per questo motivo, una precisa regolazione CBF-CMRglc-CMRo2 è indispensabile per la salute
del cervello.
Metabolismo del glucosio e regolazione della morte cellulare
Il metabolismo del glucosio è evolutivamente legato alla regolazione della morte cellulare (45) (Figure 1E e 3A), e questo legame è rigorosamente controllato in forma analoga in molti tipi di cellule, il che fa pensare ad un ruolo universale di vie coregolate metabolica e apoptotica.
I neuroni e le cellule tumorali sono tra i tipi di cellule che si basano quasi esclusivamente sul metabolismo del glucosio per la generazione dell’energia, e dati recenti suggeriscono che queste cellule usino meccanismi simili per adattarsi alla deprivazione del substrato e per promuovere la sopravvivenza (46,47).
E’ stato dimostrato che l’esochinasi II (HKII), un’ isoforma HK del cervello regolato dall’ipossia, controlla la sopravvivenza neuronale in base allo stato metabolico (46) (Figure 1E e 3). L’HKII restringe o inibisce l’apoptosi in una varietà di differenti tipi di cellule a seconda che sia legato ai mitocondri (46,48) ed in base alla disponibilità di glucosio (46). Inoltre, la capacità dellHKII di fosforilare il glucosio è coinvolta nel rilevamento dello stato metabolico della cellula (figura 3). In aggiunta, l’HKII esercita la sua funzione antiapotpotica attraverso un’interazione molecolare con la fosfoproteina PEA15/PED (46). L’HKII protegge le cellule neuronali dalla morte dopo ipossia (46), ed in presenza di stress ossidativo (49). Comunque, l’HKII aumenta la morte delle cellule
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neuronali in caso di privazione di glucosio, funzionando in tal modo come interruttore molecolare che regola la sopravvivenza neuronale in base allo stato metabolico. Significativamente, la capacità dell’HKII di fosforilare il glucosio e la sua interazione con il PEA15 mediano entrambi questo effetto (46) (figura 3B,C).
La regolazione controllata del metabolismo del glucosio protegge sia i neuroni che le cellule tumorali dall’apoptosi tramite meccanismi collegati (46,47), sottolineando l’importanza universale di rilevare lo stato metabolico di una cellula. In entrambi i tipi di cellule, l’HKII protegge dalla morte cellulare in condizioni ipossiche (46), e l’incremento dell’attività della via dei pentoso-fosfato (PPP) fornisce l’ambiente ridotto per l’inibizione dell’apoptosi citocromo-c mediata, in tal modo prevenendo un danno cellulare da stress ossidativo (47). Inoltre, l’inibizione di PPP dopo l’attivazione sperimentale selettiva della glicolisi e la contemporanea privazione di NADPH innesca l’apoptosi nei neuroni (50). L’aumento di attività HKII su interazione con TIGAR (51), ricorda l’aumentata capacità dell’HKII di inibire l’apoptosi neuronale quando è legata a PEA15 (46) (figura 3B,C).
Infine è stato dimostrato che anche altri enzimi della cascata glicolitica, incluso il GAPDH, inibiscono la morte cellulare in certe condizioni (52). Comunque si è anche suggerito che il GAPDH medi l’apoptosi neuronale dopo danni al DNA (53). Perciò gli enzimi glicolitici possono regolare la morte cellulare in modo dipendente dal contesto, esercitando effetti sia pro che anti apoptotici
Il controllo dell’apoptosi da parte di enzimi metabolizzanti di glucosio non sembra essere una strada a senso unico. Ad esempio, il membro BAD della famiglia Bcl-2 interagisce con il GK (anche conosciuto come esochinasi IV) nel fegato e nelle cellule β pancreatiche per modulare l’apoptosi in reazione a variazioni nel livello di glucosio (54).
Comunque, al momento non si sa se il GK abbia un ruolo nella regolazione della possibilità di sopravvivenza neuronale in base allo stato metabolico in selezionate popolazioni neuronali glucosio-sensibili. Inoltre Bclxl , un membro antiapototico della
famiglia Bcl-2, aumenta l’efficienza metabolica dei neuroni diminuendo la perdita protonica all’interno del F1Fo-ATPasi e sopra la membrana mitocondriale interna
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Il disturbo del metabolismo è strettamente legato ai meccanismi di morte cellulare e all’autofagia (57). Infatti, il GAPDH, come molti altri fattori nelle cascate apoptotiche, regola l’autofagia (57). In ogni caso, rimane da stabilire se questi meccanismi implichino un rilevamento disfunzionale del glucosio da parte di enzimi glicolitici o se siano coregolati da vie apoptotiche e/o autofagiche (ad es. da parte della famiglia Bcl-2). Perciò, si pensa che una segnalazione disturbata da parte di queste vie sia la base patofisiologia per una varietà di malattie.
Figura 3: connessione tra metabolismo del glucosio e morte cellulare. A diversi livelli di intesezione tra morte cellulare e metabolismo del glucosio. B,C L’espressione di esochinasi II (HKII) nei neuroni è upregolata da condizioni ipossiche. Con PEA15, essa regola la “viabilità neuronale” a seconda dello stato metabolico. HKII e PEA15 interagiscono e si legano al mitocondrio tramite il canale anione dipendente (VDAC) che attraversa la membrana mitocondriale esterna. Durante l’ipossia HKII protegge le cellule dalla morte, mentre durante deprivazione di glucosio, e l’interaziona conPEA15 viene meno, HKII promuove la morte cellulare. TIGAR aumenta l’attività glicolitica di HKII.
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Il controllo centrale sul metabolismo periferico del glucosio.
Considerato che il cervello fa affidamento su apporti nutrienti esogeni, non sorprende il fatto che possa aumentare questi nutrienti, in particolare il glucosio, regolando l’omesostasi sitemica e l’assunzione di cibo (58,59) (figura 1A). Reti neuronali specializzate nel nucleo ipotalamico arcuato e nel romboencefalo integrano e regolano l’omeostasi energetica e i livelli di glucosio, e segnalano alla periferia tramite una rete neuronale dedicata (58,60). Infatti, il rilevamento centrale di glucosio e la regolazione periferica del metabolismo del glucosio sono strettamente connessi (61). In aggiunta alla loro azione periferica, ormoni (58-60), tra cui l’insulina e un peptide-1 simile al glucagone (GLP-1) (62,63), mediano l’assorbimento periferico di glucosio attraverso cascate di segnalazione neuronale. Oltretutto, i recettori cerebrali di insulina (64) e altri ricettori e trasportatori metabolici, come ad esempio i trasportatori di glucosio (65,66), mediano la segnalazione metabolica nel cervello. Nell’ipotalamo, la proopiomelanocortina (POMC) (67), l’ormone concentrante melanina (MCH) (68), e i neuroni neuropeptide Y (NPY)/peptide correlato alla proteina Agouti (AgRp) rilevano i
livelli periferici di glucosio e regolano il metabolismo energetico in modo antagonistico (58). Una manutenzione neuronale difettosa in queste cellule ha gravi conseguenze per il metabolismo periferico. Un’autofagia difettosa nei neuroni POMC (57) può portare a disfunzioni metaboliche croniche a vita, quali intolleranza periferica al glucosio ed obesità (69,70). Un’autofagia compromessa nei neuroni AgRp rilevatori di glucosio
porta a magrezza e ridotta assunzione di cibo (71). Curiosamente, la glucochinasi (GK) si esprime in popolazioni neuronali selezionate nelle formazioni ipotalamiche sensibili al di glucosio (72), e un complesso proteico contenente GK e Bcl-2 antagonista della morte cellulare (BAD) potrebbe regolare il rilevamento periferico e centrale di glucosio. Oltre agli ormoni e ai nutrienti, segnali metabolici sia afferenti che efferenti collegano i nuclei rombo encefalici e il tratto gastrointestinale attraverso il nervo vago (60). Perciò, una complessa interazione tra il cervello, in particolare l’ipotalamo, e i sistemi periferici controlla l’ apporto di glucosio al cervello (58,60), l’assorbimento e l’utilizzo (71) periferico di nutrienti (58,60), e altresì l’alimentazione. In particolare, la regolazione dell’omeostasi energetica tramite il cervello non si limita al metabolismo del glucosio, ma include anche molti importanti sistemi di produzione di energia con stretti
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collegamenti tra questi sistemi (58,60,71,72). I meccanismi di interazione cervello-corpo nella regolazione del metabolismo del glucosio sono stati recentemente esaminati più dettagliatamente. (58,59).
II°MECCANISMI DI AZIONE DELL’INSULINA NEL CERVELLO
L’insulina, un ormone pancreatico, è meglio conosciuto per i suoi effetti periferici sul metabolismo di glucosio, grassi e proteine, ma recentemente è stata posta attenzione anche sull’azione dell’insulina a livello cerebrale e sui correlati disagi neurodegenerativi. L’insulina presente nel sistema nervoso centrale è un regolatore del metabolismo del glucosio centrale, tuttavia questa glucoregolazione non è la funzione principale dell’insulina nel cervello. Il cervello è conosciuto per essere specificamente vulnerabile ai prodotti ossidativi relativi agli altri organi e alterazioni nella segnalazione insulino-dipendente nel cervello possono causare o promuovere malattie neurodegenerative che invalidano e riducono la qualità della vita. L’insulina del cervello (Brain Insulin), il recettore dell’insulina e i meccanismi di segnalazione substrato-mediati del recettore dell’insulina giocano ruoli importanti nella regolazione del metabolismo periferico, nel comportamento alimentare,nella memoria e nel mantenimento delle funzioni neurali quali la crescita neuronale e il differenziamento, la neuro modulazione e la neuro protezione.
Insulina:
L’insulina è un ormone peptidico del peso molecolare di 5,8 kDa secreto dalle cellule beta del pancreas endocrino (73). È composta da due catene peptidiche collegate tra loro da ponti disolfuro (74). L’insulina è stata identificata negli anni ’20 per essere il maggiore ormone ipoglicemico, in grado di ripristinare i normali livelli di glucosio nel sangue attraverso il suo effetto sul metabolismo del glucosio in fegato, muscolo scheletrico e tessuto adiposo (75). Tuttavia, l’insulina pancreatica appena secreta esercita effetti ormonali diretti sul fegato, mentre il remainder entra nel più grande volume plasmatico sistemico (76). La secrezione di insulina è soggetta a controllo da parte di nutrienti, fattori ormonali, neurali e farmacologici. Tra questi, il glucosio è di
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gran lunga il più importante regolatore del meccanismo di secrezione di insulina (77). Il diabete è una malattia metabolica caratterizzata da deficit nella produzione di insulina (tipo 1) o danneggiamento nella sensibilità all’insulina (tipo 2) (78).
La resistenza all’insulina, una sindrome caratterizzata da una diminuita abilità dell’insulina a svolgere le sue normali funzioni fisiologiche, è la maggiore caratteristica del diabete di tipo 2 e il fattore chiave nello sviluppo della sindrome metabolica (79). Lo sviluppo della resistenza all’insulina è strettamente correlato all’infiltrazione e all’infiammazione delle cellule immunitarie, con chiari collegamenti tra lo sviluppo di obesità, diabete mellito di tipo 2 e malattie cardiovascolari (80). Il rilascio di insulina è regolato in risposta ai livelli di glucosio nel sangue o altri nutrienti e quindi l’insulina stimola percorsi anabolici attraverso la regolazione del metabolismo di carboidrati, lipidi e proteine mentre inibisce il catabolismo di queste riserve di carburante (81). Approssimativamente il 50 % dell’insulina che raggiunge il fegato è degradata senza passare alla circolazione sistemica generale e agli altri tessuti del corpo. Nei soggetti normali, l’insulina è secreta energicamente in risposta a un pasto (76).
Azioni dell’insulina sul metabolismo periferico delle macromolecole.
I livelli di insulina plasmatica durante il digiuno sono il 5-20% di quelli misurati dopo un pasto e richiesti per mantenere il bilancio degli ormoni contro-regolatori e per prevenire la cheto-acidosi (75). Nel metabolismo dei carboidrati, l’insulina stimola un rapido assorbimento di glucosio, immagazzinamento, e utilizzazione del glucosio da quasi tutti i tessuti del corpo, in particolare muscoli, fegato e tessuto adiposo (82). L’insulina attiva l’immagazzinamento di glucosio come sintesi di glicogeno e diminuisce l’attività fosforilasica del fegato, ma incrementa l’attività glucochinasica (83). L’insulina inoltre incrementa la glicolisi e il percorso dei pentosi per accrescere l’utilizzazione del glucosio e diminuire la gluconeogenesi disattivando gli enzimi gluconeogenici (84). L’insulina inoltre regola il metabolismo dei lipidi (82). È un regolatore chiave nell’interazione tra il glucosio e il metabolismo degli acidi grassi (75). L’insulina stimola l’assorbimento del glucosio nelle cellule del tessuto adiposo, il quale, quando è convertito in glicerolo e/o acidi grassi è usato come substrato nella sintesi dei
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trigliceridi, una forma di immagazzinamento dei grassi (85). L’insulina diminuisce la degradazione e la mobilizzazione degli acidi grassi dai trigliceridi inibendo l’attività della lipasi ormone-sensibile nella parete dei vasi capillari vicini agli adipociti, incrementa la traslocazione degli acidi grassi negli adipociti e li immagazzina sottoforma di trigliceridi ( 85). L’insulina influenza il metabolismo delle proteine e la crescita (82).
Insulina cerebale
L’insulina situata all’interno del cervello ha principalmente origine pancreatica, attraversa la barriera emato-encefalica (BBB) ed entra nel cervello attraverso un sistema di trasporto attivo recettore-mediato, ma può anche essere prodotta dal cervello stesso (86). È interessante come essa giochi un ruolo molto importante nella regolazione del metabolismo del glucosio centrale e periferico, nel comportamento alimentare, nella neurotrasmissione, nell’apprendimento e nella memoria, nel mantenimento delle funzioni neurali, risultando neuro-protettiva (87). E’ altamente espressa nella corteccia cerebrale, nel bulbo olfattivo, nell’ippocampo, nell’ipotalamo, e nell’amigdala (88). Le scoperte suggeriscono che la segnalazione insulino-mediata nel cervello è richiesta per le normali funzioni mitocondriali e per il metabolismo (89)e che potrebbe essere d’aiuto per mantenere la regolazione centrale del bilancio energetico nel cervello e per evitare lo sviluppo di malattie neurodegenerative associate a difficoltà di apprendimento, memoria e malattie correlate all’età (90). Inoltre, il diabete scarsamente controllato ha conseguenze deleterie sui sistemi multi-organo, incluso il cervello (78). Un rapido incremento o decremento dei livelli di glucosio potenzia la tossicità ROS così come contribuisce alla lesione neurale (91). Le cellule neuronali nel cervello sono altamente sensibili allo stress ossidativo dovuto alla loro grande dipendenza dalla fosforilazione ossidativa per l’energia rispetto alle altre cellule (91). Questo crea una condizione di potenziale stress ossidativo nel cervello anche in situazioni normali (92). Con questo, l’insulina e i percorsi di segnalazione mediati dal recettore insulinico (IR), (insieme al fattore-1 di crescita insulino-simile (IGF-1) e al recettore IGF-1 (IGF-1R)) sembrano giocare un ruolo cruciale nella regolazione del metabolismo del sistema nervoso centrale (CNS), nella crescita e differenziazione neuronale, nella neuro-modulazione e nella neuro-protezione (93).
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Resistenza cerebrale all’insulina
La resistenza all’insulina è uno stato patologico comune in cui le cellule bersaglio non rispondono ai normali livelli di circolazione di insulina (94). È generalmente accettato che l’insulina situata nel cervello è per lo più di origine pancreatica, essendo passata attraverso il BBB. Sebbene ci sia un piccolo dibattito circa la quantità di insulina prodotta de novo nel CNS (95). L’insulina può raggiungere alti livelli nel cervello (96) ed esercita effetti trofici neuronali a lungo termine (97). La resistenza all’insulina si verifica quando le cellule recettrici di insulina sono progressivamente incapaci di avere una risposta adeguata all’insulina risultante da un’inadeguata entrata di glucosio nelle cellule (98). La resistenza all’insulina è un precursore della componente chiave di numerosi gravi problemi di salute delle società industrializzate, inclusa l’obesità, la sindrome metabolica, i disordini cardiovascolari, steatosi epatica non alcolica, depressione, Morbo di Alzheimer, asma, alcuni tumori e invecchiamento (99).
Aumenti acuti dei livelli di insulina nel plasma sono stati correlati a concentrazioni di insulina nel liquido cerebro-spinale (CSF) in soggetti con peso corporeo normale (100). La resistenza all’insulina cerebrale è vista come il risultato di vari meccanismi a differenti livelli (100). Inoltre, il ruolo delle vie di segnalazione insulino-dipendenti nello sviluppo della resistenza all’insulina è maggiormente dovuto agli effetti diretti dell’insulina sui componenti di segnalazione di insulina, compreso lo stesso recettore dell’insulina (IR) (101). Tuttavia, i grassi possono essere incapaci di indurre la resistenza all’insulina senza l’insulina (99). Così, la stessa via di segnalazione dell ‘insulina è un obiettivo legittimo per la prevenzione e la reversione della resistenza all’insulina e gli associati gravi problemi di salute (99).
I pazienti affetti da malattia di Alzheimer (AD) hanno un rischio maggiore di iperinsulinemia e iperglicemia rispetto ai soggetti di controllo sani (102). Il ripristino delle vie di segnalazione dell’insulina attraverso proinsulina-C-peptidica previene deleteri effetti del diabete di tipo-1 nei ratti (103), mentre un paragone tra diabete di tipo-2 contro diabete di tipo-1 nei ratti mostra che la perdita neuronale, la
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degenerazione neuronale, il metabolismo alterato della (Proteina Precursore dell'Amiloide) APP, l’aumento della proteina tau iperfosforilata (P-Tau) e la segnalazione disfunzionale insulina/IGF-1 era più severa nel diabete di tipo-2, probabilmente come risultato della resistenza all’insulina (104).
Recettori per l’insulina (IRs)
Le azioni dell’insulina sono mediate dai recettori per l’insulina (IR). Il IR è una proteina di membrana della famiglia del recettore tirosin-chinasi composto da due subunità alfa e due beta che sono largamente espresse nel cervello (105) con densità relativamente alta a livello di: bulbo olfattivo, ipotalamo e ippocampo (106). La presenza del recettore è stata collegata a una grande quantità di funzioni psicologiche incluse l’omeostasi energetica, l’assunzione di cibo e l’aumento del peso corporeo, la fertilità e la riproduzione, l’apprendimento e la memoria così come l’invecchiamento (105) I IRs del cervello sono presenti in concentrazione particolarmente alta nei neuroni, e in livelli molto più bassi nelle cellule gliali (106) e la trasduzione del segnale IR neuronale è simile a quella dei IRs periferici (107).
Fattore di crescita insulino-simile di tipo 1 (IGF-1)
Il fattore di crescita insulino simile di tipo 1 (IGF-1) è un polipeptide ampiamente espresso nel CNS (108). L’IGF-1 appartiene alla famiglia di proteine dei fattori di crescita insulino-simili (IGF), alla quale appartengono gli antagonisti IGF-1 e IGF-2, i recettori IGF1R e IGF2R, e diversi IGF proteine-vincolanti (IGFBP1-7). (109) Entrambi i segnali IGF1 e IGF2 attraverso il IGF1R portano alla crescita e agli effetti metabolici attraverso il meccanismi a valle del fosfatidilinositolo 3-chinasi (P13K)/Akt (110).
L’IGF-1 è un fattore cruciale coinvolto nella normale funzione cognitiva e nel fisiologico invecchiamento (111). Compromissioni nell’azione dell’insulina/IGF-1 ippocampale potrebbero condurre ad un deficit cognitivo e ad una successiva apoptosi neuronale (115). Esso fornisce inoltre una protezione effettiva contro la perdita di neuroni dopaminergici (116). Un aumento dei livelli di IGF-1 nel siero nel morbo di Parkinson (PD) precoce può riflettere uno sforzo compensatorio per proteggere i neuroni
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dopaminergici dalla degenerazione e/o può essere il risultato di un accresciuto turnover della dopamina per compensare le già diminuite funzioni dopaminergiche (114).
Substrati dei recettori dell’insulina (IRSs)
I substrati dei recettori dell’insulina sono proteine adattatrici di segnalazione che fungono da intermediari dei recettori della superficie cellulare attivati, più in particolare per il IR e il IGF-1R (115). Il legame dell’insulina ai recettori IR e IGF-1R attiva il dominio della tirosin-chinasi sul IR e il IGF-1R, il quale risulta in una fosforilazione della tirosina dei substrati di recettori dell’insulina multipli (IRSs) (116). Le proteine fosforilate attivano diversi meccanismi di segnalazione a cascata, incluso P13K/Akt/GSK-3 e Ras/MEK/ERK (117).
Quindi, il pathway Ras/ MEK/ERK attiva il bersaglio a valle( cAMP response element binding protein) CREB, coinvolto nella formazione della memoria a lungo termine nel cervello (118).
Vie di segnalazione dell’insulina a livello cerebrale
In condizioni fisiologiche molte serina/treonina chinasi a valle nelle vie di segnalazione dell’insulina come ad esempio Akt/PKB, mTOR, ERK1 fosforilano i residui di serina e treonina della proteina IRS e inibiscono la segnalazione dell’insulina come regolazione a feedback negativo (119). Nei neuroni i percorsi PI3K>Akt>GSK3beta>BAD, FOXO, TOR e GLUT sonochiaramente d’importanza critica per la segnalazione di sopravvivenza. (120). Perciò tutti questi percorsi avvalorano l’ipotesi che un aumento della segnalazione di insulina nel cervello potrebbe promuovere lo sviluppo neuronale e la sopravvivenza in vitro e in vivo.(120)
Quindi le conseguenze proposte delle reti di segnalazione di insulina normali o danneggiate sono rappresentate in diagramma nelle figure 4 e 5.
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Figura 4 rappresentazione dei meccanismi di segnalazione cerebrale dell’insulina.
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a Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K)/protein Kinase B (Akt/PKB)
PI3K è un effettore chiave antiapoptotico nel percorso di segnalazione del fattore di crescita(121).
Akt/PKB, una serina/treonina proteinchinasi di 57 KDa espressa come Akt1 e Akt2 (122) svolge un ruolo chiave nella mediazione delle azioni antiapoptotiche dei fattori di crescita sulla cellula e gioca un ruolo importante nella protezione neuronale. La stimolazione dei recettori del fattore di crescita tirosinchinasico attiva il PI3K portando all’attivazione dell’Akt (121)più a valle, alla traslocazione vescicolare del GLUT4 e all’attivazione del trasporto di glucosio. (123) Studi prcedenti hanno chiaramente mostrato che l’insulina potrebbe attivare efficacemente l’Akt nelle cellule cerebrali. (124). L’attivazione di Akt è collegata alla fosforilazione di Thr-308 al suo dominio catalitico e di Ser-473 all’estremità C-terminale (Hui 2005) e disattiva la glicogeno-sintasi-chinasi-3 (GSK-3β), Bad, e i fattori di trascrzione fork-head. (125) Perciò molta della segnalazione di insulina a valle coinvolge l’attivazione di più PI3K per influire sugli eventi metabolici. (126) Comunque, IGF-1 legante il recettore IGF-1 previene la morte neuronale dopo ischemia transitoria nel proencefalo nei topi. (121)
b Proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPKs)
MAPKs sono sensibili anche alle condizioni di stress ossidativo che comportano una produzione aumentata di perossido di idrogeno (H2O2) con conseguente loro
attivazione. (127) La chinasi c-Jun N-terminale (JNK), un membro della famiglia MAPK è importante nellinduzione della morte neuronale(121)
IGNKs sono codificati da tre geni GNK1, GNK2, GNK3. (121) Il GNK attivato a sua volta fosforila un numero di fattori di trascrizione specialmente il c-JUN dei componenti della proteina attivatrice-1 (AP-1) e proteine cellulari in particolare quelle associate all’apoptosi. (128). In aggiunta GNK gioca anche un ruolo centrale nello sviluppo di resistenza all’insulina, un probabile meccanismo implica la fosforilazione dell’IRS-1 sulla ser-307 portando all’inibizione della fosforilazione insulino-indotta della tirosina IRS. (129).
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Similmente GNK attivato fosforila specificamente il dominio di attivazione N-terminale del fattore di trascrizione c-Jun sulla serina 63 e 73; in questo modo aumenta l’attività trascrizionale di c-JUN (130) L’ischemia cerebrale promuove sia l’espressione che la fosforilazione sulla Ser 63 di c-JUN (131). Pertanto la diminuzione di amiloide (Aβ) intracellulare stimolata dall’insulina nelle cellule di neuroblastoma murine-N2a si verifica tramite l’attivazione del percorso MAPK (132). Perciò l’azione neuroprotettiva dell’insulina è possibile tramite l’attivazione della segnalazione antiapoptotica del percorso PI3K/Akt e bloccando l’attivazione della segnalazione JNK (121).
c Proteine FOXO
E’ emerso che le proteine FOXO sono un bersaglio importante dell’insulina e dell’azione del fattore di crescita (133). Perciò possono integrare diversi tipi di stimoli esterni per regolare l’espressione genica e modulare l’arresto del ciclo cellulare, l’apoptosi, l’autofagia, l’angiogenesi, la differenziazione, la resistenza allo stress, il mantenimento delle cellule staminali, la glucogenesi e l’asunzione di cibo (134). Sia l’insulina che l’IGF-1 inibiscono le FOXO tramite un meccanismo che necessita di PI3K (l’IGF-135) e proteinchinasi-1 trifosfoinositide dipendenti (PDK1). (136) FOXO3a (forchead box classO,3a) appartiene alla famiglia FOXO dei mammiferi con una distribuzione ubiquitaria e un’alta espressione nel cervello (137), che sono ragolati dall’attivzione indotta dal recettore per i fattori di crescita del percorso di segnalazione PI3K/Akt (138). L’attivazione dei recettori per i fattori di crescita come l’insulina, l’IGF-1 e il fattore di crescita nervoso (NGF) attiva il PI3K e successivamente aumenta la produzione di PI-3,4-bifosfato e PI3,4,5-trifosfato, portando alla fosforilazione e all’attivazione di Akt (139). Di conseguenza, l’attivazione di Akt da parte di insulina/IGF-1 causa la fosforilazione di FOXinsulina/IGF-1a sui residui amminoacidici thr24, ser256 e ser3insulina/IGF-19 (135)così come di FOXO3a sui siti treo32, ser253 e ser315 (140).
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d Glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK-3)
GSK-3 è una serina/treonina chinasi con un ruolo cruciale nella neurodegenerazione e nella memoria (141) Due isomeri, GSK-3α e β sono espressi soprattutto nelle sinapsi delle cellule cerebrali con particoare abbondanza nell’ippocampo, nella neocorteccia e nel cerebellum. (142) GSK-3β una proteina proapoptotica, è un bersaglio a valle chiave nei meccanismi di sopravvivenza PI3K/Akt. (143) E’ stato dimostrato che l’attività del GSK3β è necessaria per l’apoptosi delle cellule neuronali. L’espressione GSK3β è upregolata nel cervello (144) ciò suggerisce che la disattivazione di GSK3β PI3K/Akt mediata è in parte responsabile della neuroprotezione (145).
In questo modo l’insulina attiva la glicogeno sintasi promuovendo la sua defosforilazione attraverso la fosforilazione inibitoria di GSK3β da parte di Akt. (125) e Bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR)
Si è evidenziato che la segnalazione tramite il bersaglio della rapamicina (mTOR) modula il ciclo vitale (146).TOR è un membro della famiglia delle chinasi fosfoinositol-chinasi correlata fosfoinositol-chinasi (PKK) e fosforila proteine su residui di treonina e serina (146). La funzione di mTORC1 potenziato (un complesso funzionalmente distinto di mTOR) è mediata dall’attivazione di recettori per i fattori di crescita ormoni e citochine (146). Inoltre il legame dell’insulina al IR recluta IRs e attiva la subunità catalitica di PI3K così come genera la produzione di fosfatidilinositolo (3,4,5 )trifosfato PIP3. Perciò PI3K recluta chinasi 1 trifosfoinositol dipendente (PDK1) per fosforilare Akt che promuove la crescita e la sopravvivenza cellulare attraverso i suoi numerosi bersagli (147).
f p70S6K
La subunità ribosomiale 70KDa s6chinasi è uno degli effettori a valle del percorso PI3K/Akt/mTOR che gioca un ruolo chiave nella regolazione della sintesi dell proteina insulino stimolata tramite un meccanismo rapamicina dipendente (148).
L’inizio della traslazione dell’mRNa all’interno del ribosoma come tappa interessa la rapamicina e la p70S6K che è cruciale per la sopravvivenza delle cellule sotto stress apoptotico transitorio (149). Comunque è stato proposto che la preservazione della
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sintesi proteica tramite p70s6k potrebbe essere uno dei meccanismi attraverso i quali l’insulina previene l’apoptosi (143).
g Sirutina1 (SIRT1)
Sirt1 è un membro di una famiglia genica altamente conservata( le sirtuine)che codifica per le deacetilasi NAD+ dipendenti, che son espresse ad alti livelli durante l’embriogenesi precoce (150) e nel cervello dei mammiferi adulti (151). SIRT1 era upregolata nella sclerosi laterale amiotrofica e AD (152) provando che SIRT1 protegge i neuroni coinvolti nella malattia. (137)L’aumento indotto dall’insulina nella crescita dei neuriti dipende anche dall’attivazione di SIRT1 (153). SIRT1 regola negativamente la segnalazione mTOR per influenzare la crescita dei neuriti e la sopravvivenza cellulare (154) e attraverso il suo complesso inibitorio a monte nelle cellule del fibroblasto La sovraespressione di SIRT1 deacetila l’IRS2 e upregola il livello di fosforilazione di IRS2 ed ERK1/2 nello striato (155).
h Sintasi inducibile di ossido nitrico (iNOS)
Tutte le cellule cerebrali producono ossido nitrico (NO) tramite l’NO-sintasi (NOS) (156). Durante una stimolazione anormale od eccessiva, NO contribuisce alla neurotossicità attraverso meccanismi associati al danneggiamento del DNA che portano all’attivazione della poli(ADP-ribosio) sintetasi, alla perossidazione lipidica e a disfunzioni mitocondriali e alla fine alla morte cellulare nella neurodegenrazione (157). Nei neuroni, l’NO è transitoriamente prodotto dall’attivazione di NOS neuronale (nNOS), e la sua sovrapproduzione è coinvolta nella neurotossicità (158). L’insulina inibisce significativamente i livelli di NO nella tossicità indotta da H2O2 nelle cellue gliali (124).
Quindi le cellule gliali residenti nel cervello esprimono iNOS e producono alti livelli di NO in risposta a un’ampia varietà di stimoli proinfiammatori e degenerativi (159). In modo simile, l’insulina downregola l’espressione di iNOS indotta da lipopolisaccaridi (LPS) nei macrofagi alveolari e l’insulina inibisce l’espressione di iNOS indotta da citochine negli epatociti di ratto(160). Questi risultati suggeriscono che l’insulina non solo regola l’espressione di iNOS nei tessuti periferici, ma regola anche l’espressione di iNOS nelle cellule del CNS (118).
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i Linfoma 2 a cellule B (Bcl-2)
Le proteine della famiglia Bcl-2 hanno uno o più domini di omologia Bcl-2 e giocano un ruolo cruciale nella trasduzione di segnale apoptotico intracellulare attraverso la regolazione della permeabilità della membrana mitocondriale (161). L’attivazione di PI3K/Akt /di PI3K/Akt influisce su vari bersagli a valle che potrebbero provocare l’attenuazione dell’apoptosi, tra i quali giocano un ruolo molto importante le proteine della familgia Bcl-2 pro e anti apoptotiche. L’Akt fosforila Bad, e blocca la morte neuronale primaria Bad-indotta (162). La sovraespressione di geni Bcl-2 previene la morte delle cellule neuronali e ritarda l’attivazione di caspasi-3 in caso di danno della cellula neuronale (163). D’altra canto, la fosforilazione di Bcl-2 indotta da JNK potrebbe fosforilare Bcl-2 e perciò la fosforilazione potrebbe disattivare le funzioni anti apoptotiche del Bcl-2 (164). I risultati riferiscono che l’insulina diminuiva significativamente l’aumento di fosforilazione di Bcl-2 sul Ser87 (121). Perciò, Bcl-xl è uno dei membri della famiglia Bcl-2 che gioca un ruolo chiave nella sopravvivenza dei neuroni. Neuroni carenti di Bcl-xl sono maggiormente vulnerabili alla morte cellulare, nonostante un trattamento con insulina o fattori simili all’insulina possano inibire la loro apoptosi. E’ mostrato che il trattamento con insulina diminuisce il tasso di apoptosi elevando i livelli di Bcl-2 e Bcl-xl e riducendo i livelli di Bax (165).
l Citocromo c, caspasi e PARP
I percorsi di segnalazione cellulare o biochimica coinvolgono i mitocondri nell’apoptosi rilasciando citocromo-c nel citoplasma (166). Una volta che il citocromo-c è rilasciato dai mitocondri, si lega direttamente al Apaf-1 in modo dATP dipendente e promuove un cambiamento conformazionale che permette a caspasi-9 di unirsi al complesso, che è stato definito l’ “apoptosoma” (167). Caspasi-9, che è un promotore della cascata della caspasi citocromo-c-dipendente, attiva la caspasi-3, seguita dall’attivazione di caspasi-2, -6, -8 e -10 a valle. La caspasi-3 è un passaggio cruciale nell’esecuzione del processo di apoptosi, e l’inibizione della sua attivazione potrebbe bloccare la morte cellulare apoptotica (121). L’insulina potrebbe diminuire l’attivazione di caspasi-3, che potrebbe avere effetto sul passaggio finale della cascata apoptotica (121). La caspasi-3
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attiva anche l’Ndase caspasi attivato e porta a danni al DNA. In aggiunta, le caspasi a valle spaccano molte proteine substrato, compresa la poli (ADP ribosio) polimerasi (PARP). Un’attivazione eccessiva di PARP causa esaurimento di nicotinammide-adenina-dinucleotide e ATP, che porta in ultima analisi al fallimento cellulare e alla morte cellulare (167). Perciò, è anche evidente che l’insulina impedisce l’attivazione di caspasi-3 e la frammentazione del DNA attraverso l’attivazione del percorso PI3K/Akt e la sua conseguente inibizione di GSK-3β (168).
m Fattore neurotrofico cerebrale (BDNF).
Il fattore neurotrofico cerebrale (BDNF) è un importante neurotrofina del cervello che sostiene la sopravvivenza cellulare, la differenziazione e la plasticità (138). L’attivazione di mTOR e il conseguente potenziamento della sintesi proteica sono indotti dalla stimolazione del BDNF (169). Quindi disfunzioni del BDNF sono state associate a vari disordini, come i disturbi dell’umore (170). Perciò, BDNF è in grado di sopprimere l’incremento pro apoptotico indotto da FOXO3a attivo, tramite l’attivazione sia del percorso di segnalazione PI3K/Akt che del percorso ERK (138).
n Trasportatore 4 di glucosio (GLUT4)
Il GLUT4, principale isoforma del trasportatore di glucosio (171), è responsabile dell’assorbimento di glucosio stimolato dall’insulina (172). La trascrizione genica in risposta allo stress ossidativo influisce sulla segnalazione di insulina alterando la disponibilità di GLUT4 portando ad una diminuzione nell’assorbimento di glucosio che comporta resistenza all’insulina (173). Il percorso di segnalazione mediato da insulina attiva il GLUT4 comprendendo PI3K, PKC, Akt/PKB e altri effettori (125). In presenza di insulina, l’ossitochinasi (OX) e il GLUT4 sono espressi nella membrana plasmatica, dove il GLUT4 induce l’assorbimento di glucosio (174). E’ stato suggerito che l’inibizione di OX, seguente al legame di angiotensina (Ang IV), potrebbe aumentare l’assorbimento di glucosio nei neuroni, portando a un miglioramento dei processi cognitivi (175).
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o Substrato 1 di tossina botulinica correlata a Ras C3 (Rac1).
Rac1 (Famiglia Rho, piccola proteina legante GTP, è un regolatore pleiotropico di molti processi cellulari, compreso il ciclo cellulare. L’adesione cellulare è stata anche coinvolta quale effettore a valle di PI3K per controllare la crescita dei neuriti e per promuovere la migrazione cellulare epiteliale colonica causata dal fattore di crescita epidermico (176). Quindi, l’insulina che agisce sull’IRs attiva il percorso di segnalazione PI3K/Akt/mTOR, che a sua volta promuove il riarrangiamento citoscheletrale di actina Rac-1 dipendente e formazione della spina dendritica (177).
p Fattore nucleare-κB (NF-κB)
E’ stato proposto che il fattore di trascrizione fattore nucleare κB (NF-κB) formi una ponte cruciale tra lo stress ossidante e la risposta cellulare (178). NF-κB trasporta rapidamente informazioni al nucleo, assicurando così una risposta cellulare veloce e finemente sintonizzata (179). Il trattamento degli astrociti con insulina prima della stimolazione dei liposaccaridi (LPS), ha ridotto significativamente la traslocazione nucleare di questo fattore nucleare forse bloccando la degradazione dell’inibitore κBα (IκBα), visto che il livello di p- IκBα era diminuito quando comparato con il gruppo trattato con LPS (118). Comunque, la gestione di insulina prima di LPS ha soppresso l’espressione di iNOS impedendo la traslocazione nucleare di NF-κB nei macrofagi alveolari (180). Inoltre, il trattamento con insulina non ha avuto effetto sulla fosforilazione PKB LPS indotta (118).
q Alfa-sinucleina (α-Syn)
L’Alfa-sinucleina (α-Syn) è un membro della famiglia sinucleina di proteine, che comprende anche β- e ?- sinucleina. Tutti i membri della famiglia sono prevalentemente proteine neuronali che in condizioni fisiologiche si localizzano preferibilmente nei terminali presinaptici (181). α-Syn è una proteina citosolica conosciuta per il suo collegamento con il morbo di Parkinson, demenza a corpi di Lewy e atrofia multipla (182). La presenza di corpi di Lewy all’interno delle cellule è stata ritenuta a caratteristica patologica dell’ α-Syn tossica che inizia i percorsi di apoptosi
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intracellulare (183). L’ α-Syn può essere rilasciata dopo la morte delle cellule o secreta da cellule neuronali (105). L’ α-Syn, potenzialmente in forma di piccoli oligomeri, sembra causare la frammentazione mitocondriale, che può essere responsabile di conseguenti disfunzioni e morte dei mitocondri (184). Mutazioni della α-Syn possono causare PD autosomico dominante, e la α-Syn, che è componente principale della caratteristica patologica del PD: il corpo di Lewy (185). L’α-Syn influisce su vari percorsi mitocondriali (186), specialmente sull’inibizione del complesso I, causa la produzione di ROS, stress ossidativo e la conseguente morte neuronale.
r Ossidanti e antiossidanti.
Le reazioni di ossidazione sono essenziali per la liberazione di energia libera e per la formazione di ATP. Pertanto, reazioni di ossidazione incontrollate potrebbero essere dannose per le cellule formando radicali liberi ossigeno e nitrogeno reattivi e possono prendere parte alla patogenesi di molti alimenti umani (187). Prove emergenti mostrano che le specie di ossigeno e nitrogeno reattivo (RONS), funzionano anche come molecola di segnalazione di insulina nella normale fisiologia e getta dubbi sul potenziale effetto benefico degli antiossidanti (188). Per questo, un aumento di generazione mitocondriale di RONS di flusso metabolico in eccesso causa resistenza all’insulina (188) e prodotti finiti da ossidazione di lipidi e proteine, in prevalenza malondialdeide (MDA) e carbonili proteici (PCO) addotti (91). Il glucosio stimola la produzione di superossido dismutasi attraverso la NADPH ossidasi, una fonte principale di superossido, nei tessuti neuronali. Il glutatione ridotto (GSH), in qualità di fonte di tiolo non proteica impedisce la perossidazione dei lipidi. Si è scoperto che la sintesi epatica di GSH stimolata dall’insulina (189) è in correlazione con l’attività di glutatione per ossidasi (GPx) (190). GSH è noto per rivestire un ruolo molto importante nella neuroproduzione. Il GSH sintetizzato nel citosol può essere traslocato ad altri organuli, come i mitocondri, difesa contro i danni nitrosidativi a DNA, lipidi e proteine (191). Nei neuroni, il GSH è facilmente ossidato dallo RONS, e perciò si è mostrato che i neuroni in coltura muoiono velocemente dopo l’incubazione in presenza di RONS.
