UNIVERSITÀ DI PISA
D
IPARTIMENTO DI
F
ARMACIA
Corso di Laurea Magistrale in
Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Tesi di Laurea
:
DERIVATI UREICI E
BIFENIL-CARBOSSAMMIDICI QUALI NUOVI POTENZIALI
MODULATORI ALLOSTERICI DEL RECETTORE
CANNABINOIDE CB1
Relatori:
Dott. Simone Bertini Prof.ssa Clementina Manera
Candidato:
Simone Codini (matricola 427063)
Settore Scientifico Disciplinare: CHIM/08
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I
NTRODUZIONE
ALLA
P
ARTE
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BACKGROUND
Ormai da svariati anni, la farmacologia del recettore CB1 costituisce materia di intensa ricerca, sia in ambito accademico che industriale. Questo recettore rappresenta infatti un importante “target” terapeutico per una vasta serie di patologie.
In particolare, lo sviluppo di CB1-agonisti (ortosterici) è diretto al trattamento di malattie e/o stati patologici che includono: dolore di varia origine, nausea, infiammazione, disordini cardiovascolari, sclerosi multipla e cancro. Tuttavia, nonostante gli indiscussi effetti benefici, i ligandi ortosterici CB1-agonisti presentano effetti avversi di non poco conto, come gli effetti psicotropi a livello centrale, forte alterazione dell’umore, psicosi acute e compromissione delle funzioni motorie e cognitive. Tutto ciò limita notevolmente il loro uso clinico. Infatti, allo stato attuale, soltanto tre farmaci contenenti derivati della cannabis (CB1/CB2-agonisti non selettivi) sono stati autorizzati all’immissione in commercio (Marinol®, Cesamet®, Sativex®); di questi, solo uno (Sativex®) è stato autorizzato e risulta disponibile in Italia.
D’altro canto, lo sviluppo di ligandi ortosterici CB1-antagonisti/agonisti inversi è diretto al trattamento dell’obesità, dell’osteoporosi e della dipendenza da nicotina (e alcool). Anche in questo caso, l’uso clinico di tali derivati è fortemente limitato dall’insorgenza di effetti indesiderati importanti, quali la depressione, l’aversione sociale e l’ideazione suicida. Un caso eclatante è rappresentato dal rimonabant (SR141617A), immesso in commercio nel 2006 come farmaco anti-obesità e ritirato dal mercato dopo due anni, proprio a causa dei suddetti effetti avversi.
L’esistenza di un sito di legame allosterico (ovvero topograficamente distinto da quello ortosterico) sul recettore CB1 viene dimostrata per la prima volta nel 2005. Ciò ha condotto ad una notevole, seppur non repentina, svolta nella ricerca riguardante il recettore CB1. Infatti, questa scoperta ha fatto sì che l’interesse scientifico fosse gradualmente
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(nell’arco di una decina di anni) rivolto all’identificazione di nuove molecole in grado di legarsi al sito allosterico e quindi di “modulare” l’attività del recettore CB1. Tra queste, le più importanti e studiate sono sicuramente Org27569 e PSNCBAM-1. Dalle molteplici evidenze derivanti dall’ampio studio di questi derivati (già descritte nell’Introduzione Generale della presente tesi), si giunge all’interessante conclusione che i modulatori allosterici del recettore CB1 mostrano effetti marcatamente “divergenti” sull’affinità di legame dei ligandi ortosterici e sull’attività funzionale degli stessi: sono infatti “enhancers” allosterici per quanto riguarda l’affinità di legame dei ligandi ortosterici ed invece inibitori allosterici per quanto riguarda l’efficacia del “signalling” indotto dagli agonisti ortosterici. Questo aspetto apparentemente “paradossale” indica con chiarezza che la farmacologia dei modulatori allosterici del recettore CB1 è complessa e necessita sicuramente di ulteriori approfondimenti.
Senza dubbio, la modulazione allosterica del recettore CB1 può offrire dei vantaggi rispetto alle esistenti strategie terapeutiche che hanno come “target” il sistema endocannabinoide.
Tali vantaggi vengono di seguito descritti.
Maggiore selettività per il sottotipo recettoriale
L’individuazione di ligandi ad alta selettività verso un determinato sottotipo recettoriale è spesso ostacolata dalla elevata omologia di sequenza, per quanto riguarda il dominio di legame ortosterico, tra un sottotipo recettoriale e l’altro.94 Sebbene a tutt’oggi siano stati sviluppati numerosi ligandi CB1-selettivi e CB2-selettivi, la selettività per il sottotipo recettoriale rimane una questione di non poca importanza.
I problemi correlati all’impiego di ligandi selettivi, ma non specifici, sono evidenziati in una recente pubblicazione95 in cui si è dimostrato che i potenti effetti anti-spastici di
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agonisti CB2-selettivi in vivo (selettività di circa 100 volte), si perdono completamente nel caso di topi CB1-/-. Inoltre, è oramai assodato che numerosi agonisti cannabinoidi risultino affini al recettore orfano GPR55 e al recettore vanilloide TRPV1.
Lo sviluppo di ligandi affini per il sito di legame allosterico, cioè di modulatori allosterici, potrebbe fornire un grado di selettività per il sottotipo recettoriale (ad es. CB1 rispetto a CB2) molto elevato (se non addirittura di specificità), proprio perché i siti allosterici sono molto meno strutturalmente conservati rispetto a quelli ortosterici.
Riduzione degli effetti collaterali
Come già detto nell’Introduzione Generale della presente tesi, i modulatori allosterici del recettore CB1 non alterano fortemente il processo di “signalling” fisiologico a livello del recettore (come invece fanno i ligandi ortosterici) in quanto risultano inattivi di per sé (cioè in assenza del ligando ortosterico) e potenziano o inibiscono gli effetti dei ligandi endogeni (endocannabinoidi), i quali sono più sito- e tempo-selettivi. In altre parole, i modulatori allosterici attuano un “fine tuning” dell’azione farmacologica degli endocannabinoidi. Inoltre, si può affermare che i modulatori allosterici vadano incontro al cosiddetto “ceiling effect” (effetto tetto), ovvero il fenomeno per cui un farmaco raggiunge l’effetto massimo e l’ulteriore incremento del dosaggio non produce un corrispondente incremento dei suoi effetti, proprio in relazione alla sua dipendenza dalla presenza degli endocannabinoidi per l’attivazione del “signalling”. Tutto ciò comporta sicuramente effetti collaterali minori rispetto a quelli che si avrebbero in seguito alla stimolazione diretta del recettore CB1 a livello del sito ortosterico.
La prova che il potenziamento del “signalling” fisiologico degli endocannabinoidi produca effetti benefici è anche data dagli inibitori degli enzimi preposti all’idrolisi di AEA e 2-AG. Infatti, i FAAH-inibitori hanno azione ansiolitica ed antidepressiva; i
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MAGL-inibitori (e anche i FAAH-inibitori) hanno azione anti-nocicettiva; eppure sia gli uni che gli altri non presentano gli effetti psicotropici centrali tipici dell’agonismo diretto sul recettore CB1.96,97
In realtà, il potenziamento dell’azione degli endocannabinoidi mediante la modulazione allosterica positiva del recettore CB1, sembrerebbe essere preferibile rispetto all’incremento globale dei loro livelli associato all’inibizione di FAAH e MAGL. Nel primo caso infatti si agisce specificamente sul “signalling” del recettore CB1 (Figura 28); nel secondo invece si agisce anche su altri potenziali “targets” degli endocannabinoidi, quali il recettore CB2 ed il recettore GPR55 (Figura 29). Inoltre, è noto che gli endocannabinoidi vengono metabolizzati, oltre che da FAAH e MAGL, anche dalla cicloossigenasi 2 (COX 2) e dalla lipossigenasi (LOX), producendo dei derivati eicosanoidi il cui ruolo non è ancora stato ben chiarito; COX 2 e LOX, tra l’altro, convertono l’acido arachidonico (che è anche un prodotto dell’idrolisi degli endocannabinoidi) in potenti molecole biologicamente attive (leucotrieni, prostanoidi ecc.). L’inibizione dell’idrolisi degli endocannabinoidi potrebbe quindi “dirottare” il metabolismo degli stessi verso questi ultimi enzimi, in particolar modo durante il processo infiammatorio, in cui la COX 2 è “up-regolata” (Figura 29). In altre parole, il potenziamento allosterico del recettore CB1 presenta il vantaggio addizionale di evitare l’interferenza dovuta agli effetti dei metaboliti non-FAAH e non-MAGL degli endocannabinoidi.
59 COX
CB1
a bg CB1 signalling N H OH O Anandamide O O 2-arachidonoil-glicerolo OH OH O Noladin etere OH OH O NH2 O Virodamina N H O N-arachidonoil-dopamina OH OH "Fine tuning" Modulatore Allosterico ↓ cAMP ↑ ERKCanali del calcio voltaggio-dipendenti
Ca2+
Canali del potassio «inward rectifying»
K+
Figura 28. Rappresentazione schematica degli effetti dovuti alla modulazione allosterica del recettore
CB1.98 COX
GPR55
CB2
CB1
a bg a bg a bg CB1 signalling CB2 signalling GPR55 signalling N H OH O Anandamide O O 2-arachidonoil-glicerolo OH OH O Noladin etere OH OH O NH2 O Virodamina N H O N-arachidonoil-dopamina OH OH COX-2, LOX Leucotrieni, Prostanoidi Altri derivati eicosanoidiAcido arachidonico N H OH O Anandamide O O 2-arachidonoil-glicerolo OH OH O Noladin etere OH OH O NH2 O Virodamina N H O N-arachidonoil-dopamina OH OH FAAH
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NUOVI
POTENZIALI
MODULATORI
ALLOSTERICI
DEL
RECETTORE CB1
Lo scopo di questa tesi di laurea è stato quello di progettare e sintetizzare nuovi possibili modulatori allosterici del recettore CB1 sfruttando un approccio basato sull’analogia strutturale con il derivato ureico di riferimento PSNCBAM-1. In particolare, è stato ritenuto interessante rimpiazzare l’atomo di azoto dell’anello piridinico di tale derivato con un atomo di carbonio, ottenendo così dei derivati a struttura bifenil-ureica A (Figura 30).
Figura 30. Struttura generale (A) dei derivati bifenil-ureici progettata a partire dalla struttura del modulatore
allosterico PSNCBAM-1.
Inoltre, l’anello pirrolidinico terminale è stato mantenuto in alcuni composti, mentre in altri è stato rimpiazzato con un anello piperidinico. Infine, come sostituente periferico in posizione para del fenile, è stato mantenuto l’atomo di Cl, ma sono stati introdotti anche altri gruppi, quali H, F e OMe. Pertanto sono stati sintetizzati i derivati bifenil-ureici 1-8
N N N N O H H Cl PSNCBAM-1 N N O H H R1 R2 A R1 = Cl, H, F, OMe R2 = N N
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mostrati in Figura 31.
Come ulteriore sviluppo del progetto, uno degli atomi di azoto del raggruppamento ureico (quello adiacente al fenile para-sostituito) è stato rimpiazzato da un gruppo metilenico, ottenendo in tal modo dei derivati N-bifenil-arilacetammidici, aventi la struttura generale B (Figura 32). In questo caso, come sostituente periferico in posizione para del fenile, è stato introdotto l’atomo di Cl oppure il gruppo OMe. I due nuovi derivati N-bifenil-arilacetammidici sintetizzati (9 e 10) sono mostrati in Figura 33.
N N O H H Cl N 1 N N O H H N 2 N N O H H F N 3 N N O H H MeO N 4 5 N N O H H Cl N 6 N N O H H N 7 N N O H H F N 8 N N O H H MeO N
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Figura 32. Struttura generale (B) dei derivati N-bifenil-arilacetammidici, progettata a partire dalla
struttura del modulatore allosterico PSNCBAM-1.
Figura 33. Struttura dei due derivati N-bifenil-arilacetammidici, sintetizzati durante il lavoro di questa
tesi.
I derivati bifenil-ureici 1-8 sono stati sintetizzati come mostrato nello Schema 1. L’1,3-dibromobenzene commerciale 11 è stato sottoposto ad una mono-amminazione
palladio-catalizzata con pirrolidina o piperidina in presenza di
tris(dibenzilideneacetone)dipalladio(0) (Pd2dba3), 2,2’-bis(difenilfosfino)-1,1’-binaftile N N N N O H H Cl PSNCBAM-1 N O H R1 N B R1 = Cl, OMe 9 N O H H Cl N 10 N O H H N MeO
63 (BINAP) e sodio tert-butossido,99 ottenendo gli intermedi 12 e 13. Questi sono stati
sottoposti ad una reazione di cross-coupling con acido 3-nitrofenilboronico, in presenza di palladio acetato, trifenilfosfina e sodio bicarbonato acquoso in 1,2-dimetossietano (DME)80 Il gruppo nitro dei derivati 14 e 15 così ottenuti è stato quindi ridotto a gruppo amminico con nickel-Raney in presenza di idrazina idrata. Questa reazione ha rappresentato sicuramente il passaggio-chiave della procedura sintetica. È noto infatti in letteraturache questo tipo di reazione, a partire da un gruppo NO2, dia origine a svariati intermedi di
riduzione che possono “inquinare” il prodotto desiderato (che oltretutto, nel nostro caso, abbiamo verificato essere instabile a contatto con la silice, precludendo una eventuale purificazione mediante colonna cromatografica). Pertanto, in qualche caso, la reazione è stata ripetuta più volte, prolungando i tempi di reazione e verificando, mediante analisi NMR, che gli intermedi ottenuti corrispondessero effettivamente ai prodotto amminici desiderati 16 e 17. La successiva reazione con fenil-isocianato o fenil-isocianato para-sostituito (con -Cl, -OMe, -F),80 in cloroformio anidro ha fornito i prodotti finali bifenil-ureici 1-8.
64 a 11 Br Br Br R2 b O2N R2 N H2 R2 1-8 N N O H R1 R2 H 12: R2 = 13: R2 = N N 14: R2 = 15: R2 = N N 16: R2 = 17: R2 = N N
Schema 1. Reagenti e condizioni: a) pirrolidina oppure piperidina, Pd2dba3, BINAP, sodio t-BuONa,
toluene, 80 °C, 4.5 h; b) acido 3-nitrofenilboronico, Pd(OAc)2, P(Ph)3, DME, NaHCO3, H2O, riflusso,
overnight; c) NH2-NH2·H2O, Nickel-Raney, EtOH, 50 °C, durata variabile; d) opportuno aril-isocianato,
CHCl3 anidro, RT, overnight.
La sintesi dei derivati N-bifenil-arilacetammidici 9 e 10 e mostrata nello Schema 2. L’intermedio 16 (che è stato necessario ripreparare di volta in volta a causa della sua instabilità) già descritto nello Schema 1, è stato fatto reagire con para-cloro-fenilacetilcloruro oppure con para-metossi-para-cloro-fenilacetilcloruro, in presenza di trietilammina, in diclorometano anidro, fornendo rispettivamente i derivati 9 e 10.
9, 10 a 16 N N H2 N O H R1 N
Schema 2. Reagenti e condizioni: a) 4-Cl-fenilacetilcloruro oppure 4-MeO-fenilacetilcloruro, Et3N,
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Mentre la sintesi di tutti i nuovi derivati veniva ultimata, è stato pubblicato un brevetto di altri autori in cui si riporta la preparazione del composto bifenil-ureico 1 (Figura 31, Schema 1), per altro seguendo una procedura di sintesi diversa da quella adottata presso i nostri laboratori.81
I test biologici atti a verificare l’affinità di legame/selettività dei nuovi composti sintetizzati per i recettori cannabinoidi, nonché gli studi per verificarne l’eventuale comportamento da modulatori allosterici del recettore CB1, sono attualmente in corso.
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P
ARTE
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La struttura di tutti i composti è stata confermata per mezzo della spettrometria di risonanza magnetica nucleare protonica (1H-NMR).
Gli spettri 1H-NMR sono stati registrati utilizzando uno spettrometro Bruker Avance IIITM 400 (operante a 400 MHz) e sono riferiti al segnale residuo del solvente. I chemical shifts sono espressi in ppm e le costanti di accoppiamento J sono espresse in hertz (Hz).
Le evaporazioni sono state eseguite sotto vuoto in evaporatore rotante (rotavapor). Le TLC analitiche sono state eseguite usando lastrine di gel di silice 60 F254 (MERCK) contenenti un indicatore fluorescente; le varie macchie sono state valutate per mezzo di lampada UV (254 nm). Per la cromatografie su colonna è stato usato gel di silice 60 (0.040-0.063 mm) (MERCK).
68 1-(3-bromofenilpirrolidina) (12)
La reazione è stata effettuata in fiala chiusa.
Nella fiala sono state introdotte, nell’ordine, le seguenti sostanze: toluene (2.1 ml), 1,3-dibromobenzene (0.10 ml, 0.85 mmoli), il catalizzatore [(157.25 mg) costituito da: Pd2dba3 (0.02 mmoli), BINAP (0.063 mmoli) e t-BuONa (1.02 mmoli)] e pirrolidina (0.07 ml, 0.85 mmoli). La miscela così ottenuta è stata lasciata reagire, sotto agitazione magnetica, a 80 °C per 4.5 ore. Dopo raffreddamento fino a temperatura ambiente, il solvente è stato evaporato al rotavapor. Il grezzo così ottenuto (olio scuro) è stato purificato mediante colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando, come eluente, etere di petrolio. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 190.5 mg (0.843 mmoli) del prodotto desiderato.
Resa: 99 %
1H-NMR: (CDCl3) δ (ppm): 7.05 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 6.76-6.74 (m,1H), 6.68 (m,1H), 6.46 (m,1H), 3.27-3.24 (bs, 4H), 2.05-1.99 (bs, 4H).
69 1-(3’-nitro[1,1’-bifenil])-3-pirrolidina (14)
La reazione è stata effettuata in fiala chiusa, sotto atmosfera di azoto.
Nella fiala sono stati introdotti: 1,2-dimetossietano (DME) (5.0 ml), trifenilfosfina (78.68 mg, 0.3 mmoli) e Pd(OAc)2 (40.4 mg, 0.060 mmoli). La miscela è stata lasciata reagire per 15 minuti, sotto agitazione magnetica, a temperatura ambiente, per consentire la formazione in situ del catalizzatore Pd(PPh3)4. Sono stati quindi aggiunti: il composto 12 (179.1 mg, 0.793 mmoli) dissolto in 6.0 ml di DME, NaHCO3 (198.0 mg, 2.35 mmoli), acqua distillata (4.5 ml) ed infine l’acido 3-nitro-fenilboronico (146.0 mg, 0.87 mmoli). La miscela è stata lasciata reagire a 95 °C, overnight. Il DME è stato evaporato al rotavapor ed il residuo estratto in imbuto separatore utilizzando AcOEt/H2O. La fase organica è stata seccata su solfato di sodio, filtrata ed evaporata fino all’ottenimento di un olio scuro. Il grezzo è stato purificato mediante una prima colonna cromatografica di gel di silice (flash) usando, come eluente, una miscela Etere di Petrolio/AcOEt 9:1, ottenendo un olio rosso. Quest’ultimo è stato sottoposto ad una seconda purificazione cromatografica utilizzando, come eluente, una miscela etere di petrolio/diclorometano 7:3. Le opportune frazioni riunite ed evaporate hanno fornito 115.0 mg (0.43 mmoli) del prodotto desiderato.
Resa: 54 %
1H-NMR: (CDCl3) δ (ppm): 8.46 (m,1H), 8.19-8.16 (m,1H), 7.94-7.91 (m,1H), 7.58 (t,1H, J = 7.9 Hz), 7.33 (t,1H, J = 7.8 Hz), 6.89 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.74 (m,1H), 6.65-6.63 (m,1H), 3.38-3.35 (bs, 4H), 2.07-2.03 (bs, 4H).
70 3’-ammino-[1,1’-bifenil]-3-pirrolidina (16)
In un palloncino sono state introdotte le seguenti sostanze: composto 14 (63.8 mg, 0.24 mmoli), etanolo assoluto (4.0 ml) ed idrazina idrata (0.17 ml, 0.0034 mmoli). La miscela è stata lasciata sotto agitazione magnetica a 50 °C per circa 15 minuti, per favorire la solubilizzazione completa del composto 14. A questo punto è stato aggiunto nichel Raney (sospensione acquosa) (in eccesso: circa 200 mg). La miscela risultante (virata dal colore arancio vivo ad incolore) è stata lasciata reagire alla stessa temperatura, fino alla cessazione dell’effervescenza (liberazione di idrogeno molecolare) (circa 1 ora). Il tutto è stato quindi filtrato (sotto vuoto) su celite, lavando in filtro con etanolo ed avendo cura di non far essiccare il nichel Raney eventualmente ancora presente sul filtro (pericolo che possa incendiarsi). Il filtrato (limpido incolore) è stato portato a secco al rotavapor, ottenendo un residuo bianco del peso di 58.5 mg, usato per il passaggio successivo senza ulteriore purificazione.
Resa: 97 %
1H-NMR: (CDCl3) δ (ppm): 7.28 (t,1H, J = 7.8 Hz), 7.22 (t,1H, J = 7.8 Hz), 7.03-7.01 (m,1H), 6.95-6.92 (m,1H), 6.95-6.92 (m,1H), 6.88-6.85 (m,1H), 6.75-6.73 (m,1H), 6.69-6.65 (m,1H), 6.59-6.55 (m,1H), 3.36-3.33 (bs, 4H), 2.05-1.99 (bs, 4H).
71 N-(4-clorofenil)-N’-[3’-(pirrolidin-1-il)-[1,1’-bifenil]-3-il]urea (1)
La reazione è stata condotta sotto atmosfera di azoto.
In un palloncino vengono introdotti: il composto 16 (58.5 mg, 0.245 mmoli), CHCl3 anidro (10.2 ml) e p-cloro-fenilisocianato (39.0 mg, 0.245 mmoli). La miscela di reazione viene lasciata reagire a temperatura ambiente overnight. Dopo evaporazione del solvente, il grezzo è stato purificato mediante colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando, come eluente, una miscela etere di petrolio/AcOEt 7:3. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 37.1 mg (0.095 mmoli) del prodotto finale desiderato.
Resa: 39 %
1H-NMR: (DMSO) δ (ppm): 8.84 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.43-7.41 (m, 1H), 7.49 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.9 Hz, JAA’XX’ = 1.6 Hz), 7.26-7.22 (m, 2H), 6.81 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 6.67 (s, 1H), 6.55 (m, 1H), 3.30-3.27 (bs, 4H), 1.99-1.96 (bs, 4H).
72 N-fenil-N’-[3’-(pirrolidin-1-il)-[1,1’-bifenil]-3-il]urea (2)
La reazione è stata condotta sotto atmosfera di azoto.
In un palloncino vengono introdotti: il composto 16 (54.3 mg, 0.228 mmoli), CHCl3 anidro (9.48 ml) e fenilisocianato (27.16 mg, 0.228 mmoli). La miscela di reazione viene lasciata reagire a temperatura ambiente, overnight. Dopo evaporazione del solvente, il grezzo è stato purificato mediante colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando, come eluente, una miscela etere di petrolio/AcOEt 7:3. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 71.6 mg (0.2 mmoli) del prodotto finale desiderato.
Resa: 88 %
1H-NMR: (DMSO) δ (ppm): 8.74 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 7.70-7.69 (m, 1H), 7.47-7.42 (m, 3H), 7.34 (t, 1H, J = 7.8 Hz), 7.30-7.22 (m, 4H), 6.97 (t, 1H, J = 7.3 Hz), 6.83-6.81 (m, 1H), 6.71-6.69 (m, 1H), 6.56-6.53 (m, 1H), 3.30-3.27 (bs, 4H), 1.99-1.96 (m, 4H).
73 N-(4-fluorofenil)-N’-[3’-(pirrolidin-1-il)-[1,1’-bifenil]-3-il]urea (3)
La reazione è stata condotta sotto atmosfera di azoto.
In un palloncino vengono introdotti: il composto 16 (68.0 mg, 0.285 mmoli), CHCl3 anidro (11.9 ml) e p-fluoro-fenilisocianato (39.1 mg, 0.285 mmoli). La miscela di reazione viene lasciata reagire a temperatura ambiente, overnight. Dopo evaporazione del solvente, il grezzo è stato purificato mediante colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando, come eluente, una miscela etere di petrolio/AcOEt 7:3. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 28.7 mg (0.076 mmoli) del prodotto finale desiderato. Resa: 27 % 1H-NMR: (DMSO) δ (ppm): 8.74 (m, 2H), 7.70 (m, 1H), 7.48-7.45 (m, 2H), 7.43-7.41 (m, 1H), 7.35 (t, 1H, J =7.7 Hz), 7.26 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.0 Hz, JAA’XX’ = 1.5 Hz), 7.14 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.0 Hz, JAA’XX’=1.5 Hz), 6.82-6.80 (m, 1H), 6.70-6.69 (m,1H), 6.56-6.55 (m, 1H), 3.31-3.26 (bs, 4H), 1.99-1.96 (bs,4H).
74 N-(4-metossifenil)-N’-[3’-(pirrolidin-1-il)-[1,1’-bifenil]-3-il]urea (4)
La reazione è stata condotta sotto atmosfera di azoto.
In un palloncino vengono introdotti: il composto 16 (58.3 mg, 0.245 mmoli), CHCl3 anidro (10.2 ml) e p-metossi-fenilisocianato (36.54 mg, 0.245 mmoli). La miscela di reazione viene lasciata reagire a temperatura ambiente, overnight. Dopo evaporazione del solvente, il grezzo è stato purificato mediante colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando, come eluente, una miscela CHCl3/MeOH 99:1. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 39.7 mg (0.105 mmoli) del prodotto finale desiderato.
Resa: 43 %
1H-NMR: (DMSO) δ (ppm): 8.65 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 7.70-7.68 (m, 1H), 7.42-7.40 (m, 1H), 7.35 (AA’XX’, 2H, JAX = 9.0 Hz, JAA’XX’ = 2.7 Hz), 7.32-7.30 (m, 1H), 7.29-7.19 (m, 2H), 6.87 (AA’XX’, 2H, JAX = 9.0 Hz, JAA’XX’ = 2.7 Hz), 6.82-6.79 (m, 1H), 6.71-6.68 (m, 1H), 6.55-6.53 (m, 1H), 3.73-3.70 (m, 3H), 3.30-3.26 (bs, 4H), 2.10-1.95 (bs, 4H).
75 1-(3-bromofenil)piperidina (13)
La reazione è stata effettuata in fiala chiusa.
Nella fiala sono state introdotte, nell’ordine, le seguenti sostanze: toluene (10.6 ml), 1,3-dibromobenzene (0.50 ml, 4.24 mmoli), il catalizzatore [(784.4 mg) costituito da: Pd2dba3 (0.02 mmoli), BINAP (0.063 mmoli) e t-BuONa (1.02 mmoli)] e piperidina (0.42 ml, 4.24 mmoli). La miscela così ottenuta è stata lasciata reagire, sotto agitazione magnetica, a 80 °C per 4.5 ore. Dopo raffreddamento fino a temperatura ambiente, il solvente è stato evaporato al rotavapor. Il grezzo così ottenuto (olio scuro) è stato purificato mediante una colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando, come eluente, prima etere di petrolio; successivamente una miscela etere di petrolio/AcOEt 9:1. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 676.3 mg (2.81 mmoli) del prodotto desiderato.
Resa: 66 %
1H-NMR: (CDCl3) δ (ppm): 7.08 (t, 1H, J=8.0 Hz), 7.03 (m, 1H), 6.92-6.89 (m, 1H), 6.84- 6.81 (m, 1H), 3.17-3.14 (bs, 4H), 1.71-1.66 (bs, 4H), 1.61 (m, 2H).
76 1-(3’-nitro-[1,1’-bifenil]-3-il)piperidina (15)
La reazione è stata effettuata in fiala chiusa, sotto atmosfera di azoto.
Nella fiala sono stati introdotti: 1,2-dimetossietano (DME) (5.1 ml), trifenilfosfina (36.7 mg, 0,14 mmoli) e Pd(OAc)2 (18.9 mg, 0,028 mmoli). La miscela è stata lasciata reagire per 15 minuti, sotto agitazione magnetica, a temperatura ambiente, per consentire la formazione in situ del catalizzatore Pd(PPh3)4. Sono stati quindi aggiunti: il composto 13 (89.8 mg, 0.37 mmoli) dissolto in 6.0 ml di DME, NaHCO3 (93.5 mg, 1.1 mmoli), acqua distillata (2.1 ml) ed infine l’acido 3-nitro-fenilboronico (68.9 mg, 0,41 mmoli). La miscela è stata lasciata reagire a 95 °C, overnight. Il DME è stato evaporato al rotavapor ed il residuo estratto in imbuto separatore utilizzando AcOEt/H2O. La fase organica è stata seccata su solfato di sodio, filtrata ed evaporata fino all’ottenimento di un olio scuro. Il grezzo è stato purificato mediante una prima colonna cromatografica di gel di silice (flash) usando, come eluente, una miscela Etere di Petrolio/AcOEt 9:1, ottenendo 41.0 mg (0.145 mmoli) del prodotto desiderato. Un’altra aliquota di eluato, portata a secco ed analizzata mediante NMR, ha mostrato essere costituita dal prodotto desiderato e da impurezze; per cui è stata purificata una seconda volta mediante cromatografia su colonna di gel di silice (flash), utilizzando, come eluente, una miscela etere di petrolio/diclorometano 8:2. Le due frazioni sono state quindi riunite ottenendo in totale 73.8 mg (0.263 mmoli) di prodotto desiderato.
Resa: 70 %
1H-NMR: (CDCl3) δ (ppm): 8.44-8.43 (m, 1H), 8.19-8.17 (m, 1H), 7.91-7.89 (m, 1H), 7.6 (t, 1H, J = 7.9 Hz), 7.38-7.34 (m, 1H), 7.15-6.99 (m, 1H), 3.26-3.22 (bs, 4H), 1.76-1.75 (bs, 4H).
77 1-(3’-ammino-[1,1’-bifenil]-3-il)piperidina (17)
In un palloncino sono state introdotte le seguenti sostanze: composto 15 (80.9 mg, 0.29 mmoli), etanolo assoluto (4.8 ml) ed idrazina idrata (0.2 ml, 0.004 mmoli). La miscela è stata lasciata sotto agitazione magnetica a 50 °C per circa 15 minuti, per favorire la solubilizzazione completa del composto 15. A questo punto è stato aggiunto nichel Raney (sospensione acquosa) (in eccesso: circa 200 mg). La miscela risultante (virata dal colore arancio vivo ad incolore) è stata lasciata reagire alla stessa temperatura, fino alla cessazione dell’effervescenza (liberazione di idrogeno molecolare) (circa 1 ora). Il tutto è stato quindi filtrato (sotto vuoto) su celite, lavando in filtro con etanolo ed avendo cura di non far essiccare il nichel Raney eventualmente ancora presente sul filtro (pericolo che possa incendiarsi). Il filtrato (limpido incolore) è stato portato a secco al rotavapor, ottenendo un residuo bianco del peso di 88.0 mg, usato per il passaggio successivo senza ulteriore purificazione.
1H-NMR: (CDCl3) δ (ppm): 7.31-7.26 (m, 3H), 7.22-7.19 (m, 1H), 7.14-7.10 (m, 1H), 7.03-6.96 (m, 2H), 6.95-6.88 (m, 2H), 6.67-6.59 (m, 1H), 3.21-3.16 (bs, 5H), 1.74-1.66 (bs, 5H).
78 N-(4-clorofenil)-N’-[3’-(piperidin-1-il)-[1,1’-bifenil]-3-il]urea (5)
La reazione è stata condotta sotto atmosfera di azoto.
In un palloncino vengono introdotti: il composto 17 (59.1 mg, 0.234 mmoli), CHCl3 anidro (9.7 ml) e p-cloro-fenilisocianato (35.9 mg, 0.234 mmoli). La miscela di reazione viene lasciata reagire a temperatura ambiente, overnight. Dopo evaporazione del solvente, il grezzo è stato purificato mediante colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando, come eluente, una miscela etere di CHCl3/MeOH 99:1. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 119.5 mg di una sostanza che, analizzata mediante NMR, ha mostrato essere costituita dal prodotto desiderato e da impurezze; quindi è stata purificata una seconda volta usando la stessa miscela eluente, ottenendo 53.4 mg (0.131 mmoli) del prodotto finale desiderato.
Resa: 56 %
1H-NMR: (DMSO) δ (ppm): 8.94 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 7.69-7.68 (m, 1H), 7.51-7.47 (m, 2H), 7.44-7.42 (m, 1H), 7.36-7.30 (m, 3H), 7.28-7.26 (m, 1H), 7.25-7.22 (m, 1H), 7.09-7.08 (m, 1H), 6.98-6.92 (m, 2H), 3.21-3.18 (bs, 4H), 1.67-1.61 (bs, 4H), 1.57-1.55 (m, 2H).
79 N-fenil-N’-[3’-(piperidin-1-il)-[1,1’-bifenil]-3-il]urea (6)
La reazione è stata condotta sotto atmosfera di azoto.
In un palloncino vengono introdotti: il composto 17 (88.0 mg, 0.349 mmoli), CHCl3 anidro (14.5 ml) e fenilisocianato (41.6 mg, 0.349 mmoli). La miscela di reazione viene lasciata reagire a temperatura ambiente, overnight. Dopo evaporazione del solvente, il grezzo è stato purificato mediante colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando, come eluente, una miscela etere di petrolio/AcOEt 7:3. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 33.6 mg (0.090 mmoli) del prodotto finale desiderato.
Resa: 26 %
1H-NMR: (DMSO) δ (ppm): 8.75 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 7.69 ( m, 1H), 7.47-7.42 (m, 2H), 7.34 (m, 1H), 7.28 (t, 3H, J = 1.9 Hz), 7.24-7.22 (m, 1H), 7.09 (m, 1H), 6.99-6.92 (m, 2H), 3.22-3.16 (m, 5H), 1.68-1.59 (m, 5H), 1.58-1.52 (m, 2H).
80 N-(4-fluorofenil)-N’-[3’-(piperidin-1-il)-[1,1’-bifenil]-3-il]urea (7)
La reazione è stata condotta sotto atmosfera di azoto.
In un palloncino vengono introdotti: il composto 17 (55.2 mg, 0.219 mmoli), CHCl3 anidro (10.0 ml) e p-fluoro-fenilisocianato (30.0 mg, 0.219 mmoli). La miscela di reazione viene lasciata reagire a temperatura ambiente, overnight. Dopo evaporazione del solvente, il grezzo è stato purificato mediante colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando, come eluente, una miscela CHCl3/MeOH 99:1. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 119.5 mg di una sostanza che, analizzata mediante NMR, ha mostrato essere costituita dal prodotto desiderato e da impurezze; quindi è stata purificata una seconda volta usando come eluente una miscela etere di petrolio/AcOEt 7:3, ottenendo 27.6 mg (0.110 mmoli) del prodotto finale desiderato.
Resa: 50 %
1H-NMR: (DMSO) δ (ppm): 8.78 (m, 2H), 7.69 (m, 1H), 7.47 (AA’XX’, 2H, JAX = 7.0 Hz, JAA’XX’ = 2.1 Hz), 7.43 (m, 1H), 7.28 (t, 1H, J = 7.7 Hz), 7.22 (m, 1H), 7.12 (AA’XX’, 2H, JAX = 7.0 Hz, JAA’XX’= 2.1 Hz), 6.97 (m, 1H), 6.93 (m, 1H), 3.21-3.18 (bs, 4H), 1.64-1.61 (bs, 4H), 1.55 (m, 2H).
81 N-(4-metossifenil)-N’-[3’-(piperidin-1-il)-[1,1’-bifenil]-3-il]urea (8)
La reazione è stata condotta sotto atmosfera di azoto.
In un palloncino vengono introdotti: il composto 17 (55.2 mg, 0.219 mmoli), CHCl3 anidro (10.0 ml) e p-metossi-fenilisocianato (32.6 mg, 0.219 mmoli). La miscela di reazione viene lasciata reagire a temperatura ambiente, overnight. Dopo evaporazione del solvente, il grezzo è stato purificato mediante colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando, come eluente, una miscela etere di petrolio/AcOEt 7:3. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 27.2 mg (0.070 mmoli) del prodotto finale desiderato.
Resa: 32 %
1H-NMR: (DMSO) δ (ppm) : 8.78 (s, 1H), 8.62 (m, 1H), 7.68 (m, 1H), 7.44-7.40 (m, 1H), 7.36 (AA’XX’, 2H, JAX = 5.8 Hz, JAA’XX’ = 2.2 Hz), 7.33-7.30 (m, 1H), 7.29-7.25 (m, 1H), 7.23-7.18 (m, 1H), 7.08 (m, 1H), 6.97 (m, 1H), 6.95-6.92 (m, 1H), 6.86 (AA’XX’, 2H, JAX = 5.8 Hz, JAA’XX’ = 2.2 Hz), 3.6 (m, 2H), 3.20-3.18 (bs, 4H), 1.65-1.61 (bs, 4H), 1.56-1.52 (m, 2H)
82 N-(4-clorofenyl)-N’-[3’-(pirrolidin-1-il)[1,1’-bifenil]-3-il]carbossammide (9)
La reazione è stata condotta sotto flusso di azoto.
In un palloncino (previamente fiammeggiato) è stato introdotto il composto 16 (69.4 mg, 0.745 mmoli), dissolto nella minima quantità di CH2Cl2 anidro. Sono state quindi aggiunte: trietilammina (0.1 ml, 75.23 mg, 0.745 mmoli) e DMAP (90.54 mg, 0.741 mmoli). La miscela è stata quindi raffreddata in bagno di ghiaccio e sale (circa -5 °C) ed è stato aggiunto p-clorofenil-acetilcloruro (115.2 mg, 0.09 ml, 0.61 mmoli). Sono stati effettuati due prelievi dopo 1 h e 30 minuti e dopo 4 h ma la reazione non era avvenuta. Dopo circa 24 ore, sono stati aggiunti di nuovo il cloruro acido e trietilammina (raffreddando la miscela a -5 °C), lasciando la miscela reagire per altre 2 ore, scaldando alla temperatura di circa 40 °C. Dopo evaporazione del solvente, Il residuo ottenuto è stato estratto in imbuto separatore, utilizzando una soluzione satura di NaHCO3 e CH2Cl2. La fase organica è stata seccata su solfato di magnesio, filtrata ed evaporata, ottenendo un grezzo del peso di 217.4 mg, il quale è stato purificato mediante una colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando come eluente una miscela etere di petrolio/AcOEt 8:2. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 47.8 mg (0.122 mmoli) del prodotto desiderato.
Resa: 16 %
1H-NMR: (CDCl3) δ (ppm): 7.68 (m, 1H), 7.64 (m, 1H), 7.51-7.48 (m, 1H), 7.34 (AA’XX’, 4H, JAX = 4.0 Hz, JAA’XX’ = 1.9 Hz), 7.28 (AA’XX’, 4H, JAX = 4.0 Hz, JAA’XX’ = 1.9 Hz), 6.87-6.84 (m, 1H), 6.73 (s, 1H), 6.60-6.57 (m, 1H), 3.67 (s, 2H), 3.35-3.32 (bs, 4H), 2.04-2.0 (bs, 4H).
83 N-(4-metossifenil)-N’-[3’-(pirrolidin-1-il)-[1,1’-bifenil]-3-il]carbossammide (10)
La reazione è stata condotta sotto flusso di azoto.
In un palloncino (previamente fiammeggiato) è stato introdotto il composto 16 (70.1 mg, 0.745 mmoli), dissolto nella minima quantità di CH2Cl2 anidro. Sono state quindi aggiunte: trietilammina (0.1 ml, 75.23 mg, 0,745 mmoli) e DMAP (90.54 mg, 0.741 mmoli). La miscela è stata quindi raffreddata in bagno di ghiaccio e sale (circa -5 °C) ed è stato aggiunto p-metossifenil-acetilcloruro (0.11 ml, 0.64 mmoli). Sono stati effettuati due prelievi dopo 1 h e 30 minuti e dopo 4 h ma la reazione non era avvenuta. Dopo circa 24 ore, sono stati aggiunti di nuovo il cloruro acido e trietilammina (raffreddando la miscela a -5 °C), lasciando la miscela reagire per altre 2 ore, scaldando alla temperatura di circa 40 °C. Dopo evaporazione del solvente, Il residuo ottenuto è stato estratto in imbuto separatore, utilizzando una soluzione satura di NaHCO3 e CH2Cl2. La fase organica è stata seccata su solfato di magnesio, filtrata ed evaporata, ottenendo un grezzo del peso di 180.1 mg, il quale è stato purificato mediante una colonna cromatografica di gel di silice (flash) utilizzando come eluente una miscela etere di petrolio/AcOEt 8:2. Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 34.1 mg (0.067 mmoli) del prodotto desiderato.
Resa: 12 %
1H-NMR: (CDCl3) δ (ppm): 7.58 (s, 1H), 7.49-7.46 (m, 1H), 7.35-7.32 (m, 2H), 7.29-7.24 (m,4H), 6.94-6.91 (m, 2H), 6.86-6.82 (m, 1H), 6.71 (m, 1H), 6.57-6.55 (m, 1H), 3.84-3.80 (m, 3H), 3.71-3.66 (m, 2H), 3.34-3.31 (bs, 4H), 2.03-1.97 (bs, 4H).
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