Analisi della struttura e della variabilita genetica al locus codificante la Prolattina (PRL) nella Bufala Mediterranea Italiana

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INDICE

1. INTRODUZIONE……… 2

1.1 Origine e diffusione del bufalo……… 2

1.2 Patrimonio Bufalino Nazionale……….. 3

1.3 Cenni di citogenetica………. 6

1.4 Produzione latte……… 8

1.5 Caratteristiche chimico-fisiche del latte di bufala………. 10

1.6 La mozzarella di bufala campana………..……….. 13

1.7 I marcatori genetici e loro utilizzo……….. 14

1.8 La prolattina………. 17

1.8.1 Effetti della prolattina……… 20

1.8.2 Produzione e regolazione……… 21

1.8.3 Variazioni dei livelli di prolattina………... 22

1.8.4 Strutture e isoforme……… 22

2. OBIETTIVO……….24

3. MATERIALI E METODI………... 25

3.1 Preparazione dei campioni di DNA………... 25

3.2 Disegno dei primer………... 27

3.3 Amplificazione del DNA mediante PCR (Polymerase Chain Reaction)………. 28

3.4 Purificazione e sequenziamento dei frammenti amplificati……… 29

3.5 Genotipizzazione……….30

3.6 Analisi bioinfomatica e statistica………..30

4. RISULTATI E DISCUSSIONI………... 31

3.7 Struttura del gene della prolattina(PRL) nella specie bufalina………. 31

3.8 Analisi delle regioni esoniche………. 39

3.9 Analisi delle regioni introniche……….. 43

3.10 Analisi del promotore ………45

3.11 Analisi dei retroposoni………... 46

3.12 Genotipizzazione………50

5. CONCLUSIONI……….. 51

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1. INTRODUZIONE

1.1 Origine e diffusione del bufalo

I bufali appartengono all’ordine degli artiodattili, al gruppo dei ruminanti, alla famiglia dei cavicorni e sottofamiglia dei bovidi, di cui si conoscono i seguenti generi: Bubalus bubalus (bufalo) e Bos indicus (zebù).

Il genere Bubalus era presente nel Quaternario sia in Europa sia nel Sud dell'Asia. I cambiamenti di clima che si verificarono in questo periodo confinarono la specie nell'attuale territorio che comprende l'India, l'Indocina e il Sud-Est Asiatico da cui successivamente migrò in Mesopotamia, Europa orientale, Siria ed Egitto.

L’addomesticazione del bufalo avvenne nel III millennio a.C., nella valle dell'Indo e solo poco dopo (intorno al 2.500 a.C.) in Mesopotamia e in Cina.

La confusione che esisteva sul termine bubalus, ha portato ad avanzare, ad esempio, diverse teorie sull'introduzione del bufalo in Italia. Secondo alcuni, fu introdotto in epoca longobarda, con le invasioni barbariche del VI secolo, con Agilulfo. Secondo altri,

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l'introduzione del bufalo è avvenuta in epoca Normanna con le invasioni dei Saraceni e dei Mori.

Questi popoli avrebbero introdotto verso la fine del X secolo le bufale dall'Egitto in Sicilia e, successivamente, in epoca Sveva (1189-1266), esse sarebbero giunte nelle attuali aree di allevamento ed in particolare nella piana del Sele.

La prima vera attestazione della presenza del bufalo la ritroviamo nei documenti dell'Abbazia di Farpa nel Lazio nel XII secolo e nel XIII secolo, in epoca angioina, in un decreto del re Carlo I d'Angiò in cui si ordina di restituire un bufalo domito, cioè da lavoro.

Al bufalo va attribuito il merito di aver reso possibile l'utilizzazione di territori degradati, di aree marginali evitandone il completo abbandono da parte dell'uomo.

1.2 Patrimonio Bufalino Nazionale

Il patrimonio bufalino italiano è andato incontro ad una continua espansione passando da una consistenza di 14.000 capi controllati nel 1990 a 56.812 capi controllati dall’A.N.A.S.B. (Associazione Nazionale Allevatori Specie Bufalina) nel 2013. (Tabella 1).

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Tali distribuzioni si concentrano prevalentemente in Campania (119 allevamenti controllati, con un totale di 28516 capi per allevamento) e nel Lazio (125 allevamenti controllati, con un totale di 16827 capi per allevamento) (Tabella 2 e 3).

In Campania in particolare, l’allevamento bufalino si localizza in provincia di Caserta, nell’area del basso Volturno, mentre nel Salernitano, si estende dalla media e bassa valle del Sele fino alle pendici dei monti Alburni e del Cilento.

Gli allevamenti del napoletano sono situati, in gran parte, nei pressi del Lago di Licola e dei Regi Lagni. E’ infine possibile affermare che l’aumento considerevole dei capi è direttamente proporzionale all’alta richiesta di Mozzarella di Bufala Campana a marchio DOP.

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Tabella 2: Allevamenti presenti in Italia (dati ANASB-2014).

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Regione Media Kg latte

%GR %PR Capi controllati

Allevamenti Capi per all.

Basilicata 2394 8.01 4.74 1262 9 140.2 Calabria 2348 7.67 4.64 705 3 235.0 Campania 2289 8.20 4.66 28516 119 236.6 Emilia Romagna 1337 7.20 4.44 122 2 61.0 Friuli Venezia Giulia 2212 7.32 4.44 483 4 120.8 Lazio 2151 8.14 4.71 16827 125 134.6 Lombardia 2163 8.40 4.68 1817 9 201.9 Marche 1745 8.45 4.53 143 2 71.5 Molise 2039 7.98 4.60 356 4 89.0 Piemonte 2329 8.33 4.52 1228 4 307.0 Puglia 2125 8.11 4.66 3651 21 173.9 Sardegna 2206 7.24 4.31 248 1 248.0 Sicilia 2227 8.45 4.75 334 4 83.5 Toscana 2353 8.08 4.69 484 4 121.0 Veneto 1851 8.01 4.48 996 7 142.3

Tabella 4: Dati regionali anno 2013.

1.3 Cenni di citogenetica

Dopo la costruzione e pubblicazione del cariotipo standard di bufalo con ben sei diverse tecniche di bandeggio cromosomico, il laboratorio di Citogenetica Animale e Mappaggio Genetico dell’ISPAAM (Istituto per il sistema produzione animale in ambiente Mediterraneo) ha focalizzato parte della sua attività scientifica nel miglioramento

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genetico del bufalo, una specie di grande interesse economico nel mondo, con circa 130 milioni di capi, e in Italia, con circa 220.000 capi allevati soprattutto in Campania.

Gli studi hanno interessato sia aspetti di citogenetica clinica su bufale con problemi riproduttivi (il 22% delle bufale studiate presenta anomalie cromosomiche a carico dei cromosomi sessuali) che di citogenetica molecolare mediante il mappaggio fisico di numerosi loci mediante l’impiego di tecniche di ibridazione in situ in fluorescenza (FISH) e sonde di DNA contenenti sia marker di tipo I (geni espressi) che di tipo II (microsatelliti).

E’ stata pubblicata un mappa citogenetica con 293 loci dei 31 gruppi di sintenia nel bovino: 171 loci sono di tipo I e 122 di tipo II.

Tale mappa consente di estendere la nostra conoscenza nell’organizzazione fisica del genoma di tale specie e rappresenta un utile strumento per:

 studi comparativi con altri genomi (uomo e bovino) per i quali si dispone di mappe genetiche e citogenetiche più ricche e del sequenziamento di tutti i geni;

 la selezione assistita dei riproduttori con marker molecolari;

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 la selezione di regioni cromosomiche contenenti geni di interesse zootecnico (produzioni e resistenza alle malattie).

Le mappe citogenetiche comparative dei cromosomi X di bufalo (acrocentrico), bovino (submetacentrico) e pecora (acrocentrico con evidenti piccole braccia) hanno permesso di dimostrare che tale cromosoma ha avuto un’evoluzione molto più complessa degli autosomi, conseguentemente a trasposizioni centromeriche (tra bovino e bufalo) e di almeno 4 trasposizioni coinvolgenti altrettante regioni cromosomiche tra specie appartenenti alle sottofamiglie Bovinae e Caprinae (Iannuzzi et al. 2000).

1.4 Produzione latte

Secondo i dati elaborati dall’ A.N.A.S.B (www.anasb.it), la produzione di latte delle bufale in Italia iscritte al libro genealogico è aumentata dal 1990 al 2013. Infatti si è passati da una produzione media annua del 1990 di 1893 Kg di latte ad una di 2222 kg del 2013 (Tabella 5).

Variazioni sono state riscontrate anche nelle percentuali di grasso e proteine (Tabella 6).

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Tabella 5: Media annua di Kg di latte bufalino.

Tabella 6: Media annua della % di grasso e proteine nel latte bufalino.

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La produzione di latte si prolunga per l’intero corso dell’anno: si nota però una maggior produzione nei mesi autunnali e invernali ed un notevole calo in quelli estivi. Questo fenomeno è legato alle caratteristiche produttive della bufala, il cui naturale periodo riproduttivo si concentra tra i mesi di agosto e febbraio, con una gestazione di 310 giorni, i parti si verificano tra giugno e dicembre, ciò spiega l’elevata produzione nei mesi autunnali-invernali.

La richiesta di Mozzarella DOP, avviene prevalentemente nei mesi primaverili ed estivi, e per ovviare a quest’alta richiesta di prodotto, si attua una destagionalizzazione dei parti, intervenendo prevalentemente sulle manze, in quanto più facilmente influenzabili sul piano riproduttivo.

Ad oggi la tecnica di destagionalizzazione permette, anche con buone medie, di garantire il parto delle bufale in primavera, permettendo all’allevatore di ovviare alla maggior richiesta di prodotto.

1.5 Caratteristiche chimico-fisiche del latte di bufala

Il latte di bufala ha sapore dolce, colore bianco opaco, dovuto all’assenza di carotenoidi, il pH oscilla tra il 6,6-6,8.

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Il grasso è tra il 6-9% con prevalenza dell'acido oleico tra gli acidi insaturi e del acido palmitico tra gli acidi saturi. Le sostanze azotate, variano dal 3,8-4%. Le sostanze azotate non proteiche variano tra lo 0,20-0,30%. Il lattosio varia tra il 4,5- 5%.

I batteri lattici presenti nel latte di bufala sono in concentrazioni superiori ai batteri contenuti nel latte vaccino. I batteri lattici risulterebbero responsabili, per la maggior parte, del sapore e dell’aroma tipici della mozzarella, attraverso la produzione di particolari composti, ed influirebbe notevolmente sul fenomeno della cagliata durante la trasformazione.

Le principali differenze di natura chimica e chimico-fisica tra i due tipi di latte (bufalino e vaccino) sono rappresentate dal contenuto in grasso e in proteine, caratteri, questi, fondamentali per la caseificazione e che nel latte vaccino variano rispettivamente dal 3,6-4,5% e 2,8-3,3%. Questi diversi valori contribuiscono senz'altro alla tipicità del prodotto grazie alla diversa consistenza che esso viene, alla fine, ad assumere e conferiscono inoltre una maggiore resa alla trasformazione. Infatti, con latte fresco di bufala con l'8,3% di grasso e il 3,8-4% di proteine si otterrebbe una resa media del 24,6%. Ossia dalla lavorazione di 1 q.le di latte di bufala si ottengono oltre 24 Kg di mozzarella, contro i 13 Kg ottenuti mediamente da 1 q.le di latte

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vaccino. La resa di latte bufalino risulta, in questo caso, superiore di circa 1,8 volte quella del latte vaccino. (Tabella 7).

Le due specie di latte presentano, tra l'altro anche una diversa composizione caseinica che consente tramite analisi di individuare una frode molto comune: la presenza di latte vaccino nel prodotto venduto come mozzarella integrale di bufala.

Tabella 7: Composizione chimica del latte bufalino (dati A.N.A.S.B.)

Composizione chimica Latte di bufala Latte di vacca Acqua 81,5 87,5 Sostanza secca 18,5 12,5 Residuo magro 10,3 9,0 Caseina 3,6 2,8 Lattoalbumina e lattoglobulina 0,7 0,6 Grasso 8,2 3,5 Lattosio 5,0 4,5 Ca(-) 0.199 0.117 P 0.124 0.088 Rapporto Ca/P 1.61 1.31 Ceneri 0,8 0,75 Acidità (SH) 10.12 10.57 Densità (15°C) 1.031 1.029 Peso specifico 1,033 1,031

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1.6 La mozzarella di bufala campana DOP.

La Mozzarella di Bufala Campana è definita un “formaggio da tavola di pasta filata molle derivato da latte intero di bufala”; il disciplinare contenuto nel DPR 28/9/1979(ultima modifica: Provvedimento 11/02/2008 del Ministero delle Politiche Agricole, Alimentari e Forestali) prevede, per la produzione della Mozzarella di bufala, l’utilizzo esclusivo di latte di bufala.

La mozzarella di Bufala campana si differenzia dagli altri formaggi freschi soprattutto per le sue straordinarie caratteristiche organolettiche e di texture, che la rendono un prodotto inimitabile al di fuori della zona di produzione.

Al fine di valorizzare e tutelare in tutto il mondo questo prodotto, nel 1993 è stato costituito il Consorzio per la Tutela del Formaggio Mozzarella di Bufala Campana. Nello stesso anno la mozzarella di bufala campana veniva riconosciuta in ambito nazionale con l’istituzione del marchio a Denominazione D’origine Controllata (DOC) con il DPCM del 10/05/1993

Nel 1996 riceve la Denominazione d’Origine Protetta (DOP) con il regolamento CEE n° 1107 del 12/06/1996. La mozzarella che presenta

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questa “etichetta” ha una serie di caratteristiche che rappresentano una garanzia per il consumatore.

1.7 I marcatori genetici e loro utilizzo

I marcatori molecolari rappresentano caratteristiche ereditabili a livello di specie, di popolazioni e di individui. Un marcatore molecolare è un qualsiasi locus cromosomico, le cui varianti alleliche, possono essere identificate facilmente analizzando direttamente il DNA.

Un buon marcatore molecolare deve essere polimorfico, codominante, facilmente individuabile, ripetibile e possedere un meccanismo di trasmissione semplice (mendeliano o uniparentale).

Negli ultimi decenni, i progressi nella biologia molecolare, tra cui lo sviluppo della tecnica della PCR (Mullis & Faloona, 1987), hanno contribuito alla individuazione di nuovi marcatori molecolari. I principali marcatori, sono i microsatelliti (Weber & May, 1989), i RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA), gli AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) e gli SNP (Single Nucleotide Polymorphism), mentre gli RFLP sono basati sul taglio con enzimi di restrizione.

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Gli RFLP (Botstein et al. 1980) sono i polimorfismi nella lunghezza dei frammenti di restrizione. I polimorfismi sono identificati mediante restrizione del DNA con endonucleasi, che agiscono riconoscendo e tagliando una specifica sequenza nucleotidica e producendo una serie di frammenti diversi tra loro in lunghezza.

Mutazioni puntiformi, (che alterano la sequenza del DNA) o fenomeni di inserzione/delezione possono creare o eliminare il sito riconosciuto dall’enzima, dando origine ad un diverso profilo di restrizione del genoma. La tecnica RFLP, consente di distinguere i diversi alleli, di seguirne la segregazione in una popolazione scelta e di distinguere gli individui omozigoti dagli individui eterozigoti, per questo motivo sono detti “codominanti”.

I marcatori RAPD, sono analizzati tramite PCR utilizzando primer a sequenza casuale della lunghezza di circa 10‐12 paia di basi. I frammenti ottenuti dopo l’amplificazione, vengono visualizzati attraverso una corsa elettroforetica su gel d’agarosio. Il numero dei prodotti di amplificazione, generati dalla PCR con primer arbitrari, dipende dalla presenza di omologia tra DNA genomico e primer e/o la loro relativa affinità, mentre l’assenza di un particolare frammento può derivare da delezioni, inserzioni o mutazioni di basi nel DNA stampo a livello dei siti di legame del primer o nel segmento da essi delimitato.

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Tuttavia nonostante questa tecnica sia semplice ed economica, la sua limitazione è quella di non poter distinguere gli omozigoti dagli eterozigoti.

La tecnica AFLP, prevede una fase di restrizione enzimatica del DNA e una fase di amplificazione tramite PCR. Nello specifico i frammenti ottenuti dalla digestione, vengono legati a degli adattatori e successivamente amplificati con primer specifici (complementari agli adattatori e con nucleotidi selettivi a una estremità). Questa tecnologia genera una miscela di frammenti, che vengono separati ed identificati tramite elettroforesi su gel di poliacrilammide. Anche questi marcatori come i RAPs sono dominanti (Vos et al. 1995).

I polimorfismi osservati derivano, principalmente, da mutazioni puntiformi nei siti riconosciuti dagli enzimi o dalle basi selettive dei primer (polimorfismo di sequenza). Il vantaggio di questo metodo è, che permette di analizzare numerosi loci in un unico esperimento e non richiede informazioni sulla sequenza del genoma che viene sottoposto ad analisi.

I marcatori SNP (Single Nucleotide Polymorphism) identificano polimorfismi di singoli nucleotidi come sostituzioni puntiformi, ma anche singole inserzioni e delezioni nucleotidiche nella sequenza del DNA.

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Gli SNP sono molto abbondanti, frequenti e distribuiti casualmente nel genoma. La maggior parte degli SNP risiede nelle regioni non codificanti in cui la probabilità di trovare una mutazione puntiforme è quattro volte maggiore rispetto a quella di trovarla in regioni codificanti. E’ inoltre stato determinato, che metà delle mutazioni presenti nelle sequenze espresse sono sinonime (non portano a cambiamenti nella sequenza aminoacidica).

Gli SNPs sono considerati marcatori biallelici, in quanto la probabilità che nella stessa posizione ci siano 2‐3 cambiamenti di base è minima (consentono la discriminazione degli individui omozigoti da quelli eterozigoti).

Questi marcatori sono utilizzati per studi evolutivi, ma anche mappatura e associazione con QTL (Vignal et al. 2002). Nelle razze di allevamento inoltre vengono usati per studi sulla tracciabilità e rintracciabilità di razza.

1.8 La prolattina

La prolattina è un ormone polipeptidico di 197-199 amminoacidi, peso di 23 kDa, noto anche come ormone luteotropico o luteotropina.

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L’ormone è prodotto e secreto dalle cellule della adenoipofisi chiamate lattotrope, viene anche prodotta da altre cellule specializzate dell'utero, della placenta, delle mammelle ed anche del sistema immunitario, sono stati documentati più di 300 effetti diversi e distinti dell’ormone.

Scoperto negli animali nel 1939 da Oscar Riddle, e nell’uomo nel 1970 da Henry Friesen, fu quindi, identificato come un ormone peptide.

Anche se spesso associato unicamente alla produzione di latte, la prolattina svolge una vasta gamma di altri ruoli, sia nell’uomo che negli animali. Svolge un’azione simile alle citochine come regolatore del sistema immunitario, ha anche importanti funzioni correlate al ciclo cellulare, influendo sul fattore di differenziazione e sul fattore anti-apoptotico.

La prolattina ha anche una profonda influenza sull’ematopoiesi, angiogenesi, ed è coinvolta nella regolazione della coagulazione del sangue attraverso diverse vie.

La secrezione della prolattina è modulata dalla serotonina, che pur essendo un importante fattore di liberazione, a sua volta dipende da un'altra sostanza per farlo, come dimostrato da alcuni studi. Questa sostanza, la cui liberazione è indotta dalla serotonina è conosciuta

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come VIP (Vasoactive Intestinal Peptide) e avrebbe un'azione paracrina nell'ipofisi, segnalando ai lattotropi di produrre prolattina.

La dopamina (aka prolattina Inhibitory Hormone) invece è il principale fattore che inibisce la secrezione di prolattina, legandosi ai recettori D2 dei lattotropi. Ciò diminuisce la produzione di AMP ciclico, apre canali del potassio e diminuisce il flusso di calcio verso il citoplasma cellulare.

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1.8.1 Effetti della prolattina

La prolattina è essenziale per l'avvio e il mantenimento della lattazione. Agisce sugli alveoli mammari per promuovere la sintesi e la secrezione del latte. La produzione di latte si avvia normalmente con la caduta dei livelli di progesterone al termine della gravidanza. La secrezione di PRL è mantenuta durante tutto l'allattamento.

Questo ormone è principalmente responsabile della sintesi delle proteine, il lattosio e i lipidi, tutti i principali componenti del latte.

Come accennato in precedenza la prolattina svolge molteplici effetti: - Ha un ruolo nelle formazione del rivestimento mielinico che

avvolge gli assoni dei neuroni nel sistema nervoso centrale.

- Contribuisce alla sintesi dei composti tensioattivi polmonari dei polmoni fetali al termine della gravidanza.

- Contribuisce alla tolleranza immunitaria del feto, dall’organismo materno durante la gravidanza.

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1.8.2 Produzione e regolazione

La prolattina è l'unico ormone ipofisario che soffre un tono inibitorio costante da parte dell'ipotalamo, durante la gravidanza, si osserva un aumento della produzione di prolattina, che può essere spiegato dall'azione di estrogeni, che promuovono l'iperplasia delle cellule lattotrope dell'ipofisi e l'aumento dell'espressione del gene della prolattina.

Durante la gravidanza, la prolattina, assieme a tutti questi ormoni ed anche al lattogeno placentare, promuove un ulteriore sviluppo del tessuto mammario.

La prolattina pituitaria è controllata dal fattore di trascrizione Pit-1 e naturalmente dalla dopamina, mentre la prolattina extra-pituitaria è controllata da un promotore distale e apparentemente non influenzato dalla dopamina.

Nelle cellule deciduali e nei linfociti, il promotore distale e in definitiva l’espressione della prolattina è stimolata dalla cAMP (Cyclic

adenosine monophosphate) agisce tramite un CRE e diversi siti di C / EBP (enhancer binding proteine CAAT)

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1.8.3 Variazione dei livelli di prolattina

Durante la gravidanza, le alte concentrazioni di progesterone, aumentano i livelli di prolattina da 10 a 20 volte. Tuttavia, contemporaneamente, gli estrogeni, nonché il progesterone, inibiscono gli effetti stimolatori della prolattina sulla produzione del latte. Il brusco calo di progesterone che consente gli alti livelli di prolattina e il conseguente avvio della lattazione.

Dopo il parto, i livelli di prolattina cadono drasticamente, ma la suzione ne promuove un nuovo rilascio. La suzione attiva meccanorecettori dentro e intorno al capezzolo, questi segnali sono portati da fibre nervose attraverso il midollo spinale all’ipotalamo, dove i cambiamenti dell’attività elettrica dei neuroni, che regolano la ghiandola pituitaria, aumentano la secrezione di prolattina.

La suzione stimola anche il rilascio di ossitocina dalla ghiandola pituitaria posteriore, innescando l’emissione del latte.

1.8.4 Struttura e isoforme

La struttura della prolattina è simile a quella dell’ormone della crescita e del lattogeno placentale. La molecola è piegata a causa dell’attività di

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tre legami disolfuro, la forma non glicosilata della prolattina è la forma dominante, che viene secreto dalla ghiandola pituitaria.

Esistono tre diverse forme di prolattina che si differenziano per le dimensioni:

- Little prolactin è la forma predominante, ha un peso molecolare di circa 22 kDa. È un polipeptide a catena singola di 198 amminoacidi, e sembra essere il risultato della rimozione di alcuni aminoacidi.

- Big prolactin di circa 48 kDa. Può essere il prodotto di interazione di diverse molecole di prolattina. Sembra avere poca o nessuna attività biologica.

-Big big prolactin di circa 150 kDa. Sembra avere una bassa attività biologica.

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2. OBIETTIVO

L’obiettivo della presente tesi è l’analisi della struttura del gene codificante per la Prolattina (PRL) della Bufala Mediterranea Italiana allo scopo di individuare marcatori genetici utili per il miglioramento delle prestazioni produttive della specie.

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3. MATERIALI E METODI

3.1. Preparazione dei campioni di DNA

La ricerca è stata condotta sul DNA estratto dai leucociti recuperati da campioni individuali di sangue (40 ml) di 755 bufale (bubalus bubalis) allevate in Campania (provincia di Salerno e Caserta) e in Basilicata, utilizzando come anticoaugulante Na2EDTA. Il campionamento è stato realizzato in collaborazione con l’Associazione Nazionale Allevatori Specie Bufalina (A.N.A.S.B.).

Dopo il prelievo, l’estrazione del DNA è stata eseguita secondo quanto indicato da Gossens e Kan (1981).

Reagenti: • NaCl 1,8%;

• tampone lisi I (170 l NaCl; 25 l Tris, pH 7,5; 50 l EDTA)

• tampone lisi II (addizionando alla lisi I, 250 l SDS e 50 l di proteinasi K).

• fenolo bufferato;

• SEVAG: cloroformio-alcool isoamilico 24:1 (v/v); • isopropanolo.

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I campioni sono stati centrifugati a 4°C a 3500 rpm per 20 minuti, in modo da separare i leucociti dagli eritrociti e dal plasma.

Con una pipetta pasteur sono stati recuperati i leucociti, e risospesi in 20 ml di H2O deionizzata, in modo da lisare gli eritrociti residui; successivamente i leucociti sono stati riportati in condizioni isosmotiche mediante l’aggiunta di 10 ml di una soluzione 1,8% NaCl e quindi nuovamente centrifugati a 3500 rpm per 20 minuti.

Allontanato il surnatante, i leucociti sono stati lisati aggiungendo 5 ml di tampone lisi I (170 l NaCl; 25 l Tris, pH 7,5; 50 l EDTA) e 4 ml di tampone di lisi II (addizionando alla lisi I, 250 l SDS e 50 l di proteinasi K).

Dopo incubazione over night a 37°C, i campioni sono stati sottoposti a due estrazioni, una con fenolo bufferato e l’altra con SEVAG (cloroformio/alcool isoamilico rapporto 24:1) per allontanare la componente proteica.

Infine, il DNA è stato precipitato mediante l’aggiunta di un volume di isopropanolo freddo e risospeso in 500 l di tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM EDTA, pH 8).

Successivamente è stata determinata la concentrazione del DNA ed il rapporto OD260/280 per mezzo di misurazione con Nanodrop ND-2000C Spectrophotometer (Thermo Scientific).

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3.2. Disegno dei primer

I primer utilizzati per l’amplificazione del gene della prolattina bufalina sono stati disegnati avvalendosi del software DNASIS-Pro (Hitachi), come stampo sono state utilizzate le sequenze dell’mRNA bufalino depositato in Banca Dati (GenBank: EF054878.1) e in taluni casi le sequenze del gene della prolattina bovina (GenBank: AF426315.1).

Successivamente, sono stati disegnati altri primer utilizzando come stampo le regioni sequenziate nel corso della ricerca. (Tabella 8)

Primer Sequenza

PRLex1Fbuf (Forward) 5’-GCTTCCTGGTGAAGTGTG-3’ PRLint1Rbos (Reverse) 5’-TTATCCACTCATTCTGCTCTG-3’ PRLint1Fbuf (Forward) 5’- CCAAGATTCTTATGTGGTGTGG -3’

PRLint1Rbufbis(Reverse) 5’- GTTTCTGCTGTGTAGCAAAGTGA – 3’ PRLex2Rbuf (Reverse) 5’ - CGAGGAGAGGTCATGGAT - 3’ PRLex2Fbuf (Forward) 5’- TCCCTTCGAGACCTGTTT- 3’

PRLint2Rbos (Reverse) 5’- GGTGAAGAATGCCCAGAG - 3’

PRLint2Fbufbis(Forward) 5’- TGTTCCACCCTACAAGCTCA -3’

PRLint2Rbufbis(Reverse) 5’- TCTCCCCCAAATTCATGTG – 3’

PRLint2Fbuf (Forward) 5’- ACACATGAATTTGGGGGAGA -3’

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PRLex3Rbuf (Reverse) 5’- GTCTGTTGGGCTTGTTCTT -3’ PRLex3Fbuf (Forward) 5’- CAGGGCAAAGGGTTCATT- 3’ PRLint3Rbos (Reverse) 5’ - AGAATCACTGCTTACTACCT -3’ PRLbufInt3Fbis (Forward) 5’ - AGCTTTGTTAGTGATGCCAG -3’ PRLbufex4Rbis (Reverse) 5’ - ACCTGGCCAAATATCATCT - 3’ PRL4exFbuf (Forward) 5’ - ATGAGCTTGATTCTTGGGTT - 3’ PRL5exRbuf (Reverse) 5’ - GCAGTTGTTGTTGTAGATGATT - 3’

Tabella 8 - Primer utilizzati per sequenziare il gene PRL di bufala.

3.3. Amplificazione del DNA mediante PCR (Polymerase Chain Reaction)

Per mezzo di PCR (Polymerase Chain Reaction) è stato amplificato l’intero gene codificante la Prolattina (PRL) più relativo promotore di 5 bufale scelte a random tra le province di Salerno e Caserta (Campania). La PCR è una metodica che consente l’amplificazione selettiva di sequenze di DNA attraverso una serie di duplicazioni successive mediate da una DNA polimerasi.

L’amplificazione si realizza attraverso la ripetizione ciclica di tre fasi: denaturazione, annealing ed estensione.

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Una tipica reazione di PCR è stata effettuata in 25 l di mix che comprendono:

1 l di DNA genomico, 5 l di buffer 5x, 2,5 l di MgCl2 25mM, 0,5

l di dNTP, 0,25 l di ciascun primer, 0,25 l di Taq DNA polimerasi (Promega, Madison,WI) .

Il programma di amplificazione comprende i seguenti 30 cicli:

Cicli Denaturazione Annealing Estensione 1 ciclo 97°C x 2’ 58,4 - 63,0°C x 45’’ 72°C x2’30’’ 30 cicli 94°C x 45’’ 58,4 - 63,0°C x 45’’ 72°C x 2’30’’ 1 ciclo 94°C x 45’’ 58,4 - 63,0°C x 45’’ 72°C x 10’

3.4. Purificazione e sequenziamento dei frammenti amplificati

I prodotti di PCR ottenuti sono stati inviati presso il Servizio di Sequenziamento del Centro di Ricerca CEINGE - Biotecnologie Avanzate (Napoli), che ha provveduto alla purificazione ed al

30

sequenziamento mediante il metodo enzimatico di Sanger (Sanger, 1977).

3.5. Genotipizzazione

Per la genotipizzazione dello SNP C → T, al nucleotide 108 dell’esone 5 i campioni individuali di DNA a concentrazione nota di 755 bufale allevate in Campania (provincia di Salerno e Caserta) e in Basilicata (provincia di Potenza sono stati inviati presso i laboratori della K Bioscience (Herts, UK, http://www.kbioscience.co.uk)

3.6 Analisi bioinfomatica e statistica

Sono state calcolate le frequenze alleliche e l’equilibrio di Hardy-Weinberg (χ2 test). Per mezzo del programma DNAsis-Pro (Hitachi Software Engineering Co., Japan) sono state realizzate le comparazioni nucleotidiche e gli allineamenti multipli.

31 4. RISULTATI E DISCUSSIONI

4.1 Struttura del gene della prolattina (PRL) nella specie bufalina

Usando come template il DNA genomico, estratto dai leucociti ottenuti da 5 campioni individuali di sangue di bufala scelti a random tra le province di Salerno e Caserta (Campania), sono state sequenziate le regioni esoniche del gene della prolattina (PRL), le rispettive regioni introniche e la regione del promotore.

Il gene nella specie bovina è stato mappato nel cromosoma 23 e si estende per circa 9388 bp (EMBL AF426315.1) (Molecular cloning and

analysis of bovine prolactin full-long genomic as well as cDNA sequences).

L’omologia rispetto alla corrispondente sequenza nella specie bovina è risultata nel complesso pari a circa l’96%, leggermente inferiore invece è risultata l’omologia con la specie ovina (EMBL KC764410.1), che si attesta intorno al 94%.

La struttura del gene PRL si caratterizza per esser poco frazionata, essendo costituita di soli 5 esoni.

In totale per ciascuno dei 5 soggetti in esame sono stati sequenziati un totale di 8960 bp (con un contenuto di A/T e G/C rispettivamente

32

pari circa 61,40% e 38,60%) comprendenti 858 bp di regioni esoniche, 7741 bp di regioni introniche e 361 bp di regione promotrice.

I cinque esoni, presentano dimensioni variabili: 82 bp del 1° esone, 182bp nel 2° esone, 108 bp nel 3° esone, 180bp 4° esone, 306bp nel 5° esone; e da 4 introni, di dimensioni variabili: 2715 bp del primo introne, 2363 bp del secondo, 2034 bp del terzo e 629 bp del quarto introne (Figura1).

Le putative TATA box sono localizzate ai nucleotidi -27/-22, -56/-52, mentre lo stop codon (TAA) si realizza tra il 190° e il 192° nucleotide del 5° esone. La tripletta codificante per la Metionina (ATG) si colloca ai nucleotidi 55/57 del primo esone. Il peptide leader (30 aminoacidi) è codificato dagli ultimi 28 nt del primo esone (ha inizio dall’ATG codificante per la Metionina) al 62° nt del secondo esone. Tutte le giunzioni di splice seguono la regola comune: 5’ GT/ 3’ AG.

33

Oct-1 GATA-1 GATA-1 C/EBPα

Bufalo:tacacctaagtgaaagataatgctatattcaagaaactgcagagaaataaaggcaaa tgttacaat -290 Bovino:g---g---g

PU.1 GATA-1 c-Jun Oct-1

aaatg actgctataatttta tagttcctct aactcaaactagtctccagatctcaccatcattatctctctca -218 ---

C/EBPδ GATA-1 PIT-1A Oct-1

tttcctttcagtctaattaatcaaaatccttcctagatgttcatttctggtcagtatgtcttcctgaatatga -146 ---

C/EBPδ Oct-1 c-Jun C/EBPα

ataagaaatagaataccattcaatgtttgaaattatgggggtaatctcaatgacggaaatagatgactggcaa -73 ---

SP-1 NF-kappa b TATA Box CREB TATA Box

aagggaagggaatgcctgattaaatatattcatgaagatgtcaaagccttataaagccaacatttggggaaga -4 ---c--- Exon 1 M peptide leader NF1 GATA-1 gaaAGCCATAGGACGAGAGCTTCCTGGTGAAGTGTGTTTCTTGAAATCATCACCACCATGGACAGCAAAGGTT 70 --- CGTCACAGAAAGgtatgtacagcagcttgtggagttgttgggttttatcgatgttccaatgggggmattaatt 143 ----g---c---c--- tgaaatttgaggaaatattctcttaggtttcaggattacagagtttagaagaactagctaatcctgctctaga 216 --- agtcaattgtataggggcacaataggacagtggttcttgaatggaggactgtcttc-agagacatttggttaa 288 -a---c--- tgtctggagatggttttagttgtcttaataaggggcaggggtgcaactggtacccagggggcagagatcagag 361 ---g---t---g---t---a---t- atgttgctaagcatactacaatgcataagttagcccccagaacaagtacttatccagctcagggtgccaatca 434 --a---c---t--- tgtcaaagttgagaaaccttagactggaataagaccaaaaatgtctctgagtacaatttatcacaactccaga 507 ---a---a---c---c--- aggtagaaacaaacattttctagttaccaagattcttatgtggtgtggctaagatgagtcagtctgatgaaac 580 ---c--- ttttaactctgaagttataatacagacagtgacagcagagttgtctcctacaatactttgttgactgggttta 653 ---c---a---c- atccaaat---atcttaraaraaaacacaggctagtaacaataatcgcctttactttcttggttgacattcgc 723 ---gat---g--g---g--- tagaaaaagaaattGCAGATAACTAATGAGAACTTACTGTATAGCATGGACAAATCTACTCAGTGCTCTCTGG 796 ---a--- TGACCTAACTGGGAAGGAAATTCAAAAAAGAGGGTATATATGTATACGTATAGCTAATTCACTTTGCTACACA 869 ---c---a--c---t--- GCAGAAACTARCATAATATTCTAAAGCAATTATATTCCGATAAAAATTAATTTaacaaaagaaattgtaagac 942 ----g---g---g---a----g- A

34 aaagaaattaattacaaaatttatcttatgaaacaacaaaaacatttcttttttatctcatcttaggctgtgg 1015 ----c-- --- aaaaaagtccttcagatgataaaggttcagataaatgtagtcagagttaaagaatatctatccagttatgaat 1088 ---g--- ttcctagaaccaatattccaatttctctatctgtaaagtactttttatttatacttgtagatgaaacagttaa 1161 ---a---a--- tcagctgtgttacatgactgtaaagtacctaaaataatctctttggaaatatgcctttgaaaaattaaaagac 1234 --- tgttatatgaattatctcacaatattgatacttttattttgcaactaaaaggttgttcattctatactacatt 1307 ---t--- ctatactaaatagtcttttagatattttcaggtgttgagggttaggtattttttcaccctaaatctttagccc 1380 ---a--- ttgcctcattttgttttggacactttccaattacatttattcaagattccagaggaaaggagttttttggtaa 1453 ---g---c---c--- acacatttctacattctttgttttatttggagcaatttgaacttaaatatgatttacatcatcgctttttttc 1526 ---a---c---a---c---c- ttttgaaagtgtaagttactgatatgttagtggttcatatcggtccatctgctgaratagtaaattggtgayt 1599 ---t---a---g---c---c- acattgtctctgcta-ttgtaaaggactttgaaaatgaatgttttatagacagagcagaatgagtggataaaa 1671 ---a---a--- tcgtctttctagggtcactgctgtcatgcaaagacaaaatatttttctctactagtaatggcaatgatcgctg 1744 ---c---cc caagcacgggtcatcacagctastgatgtggtccctgttacacacatgcaacccaagagcccaactgcctgtg 1817 ---c---g---g--- tgttgtgacatgagaaagtgaaaagatgacagtgtggtccccagtcacctccatctgctaatcatgggacttg 1890 ---g---t--- ggggaaaatcacttgccctaagtcattgtttattaataaaatctgatgataataatggAGATCACTGGAAAGA 1963 ---c---g--- GCCCTGATGCTGCGAAAGATTGAAGGCAATACAAGAAGTGGGCAAGAGAGGATGAAATGGTTAAATAGTATCA 2036 --- ---gg---g---c---- TTGACTCAACAGACATGAATTTGAGTGAACYCCAGGATATAATGAATGAAGGGAAGCCTAGASTGCTGCAGTC 2109 c---t---a---c----t---g---a--- TATGGG-TGACAAAGAGACCGGACTTAGTTATGCACAACAataatacagtgaaggccaaggctatctcagagg 2181 ---g---t-a--- attatcatgaaacacaaattttacacatttttaaaagcttttagyaaagtatyaaggaaatggatggggttag 2254 ---c---c--- cagatccaagatgcagtatcctttttctcttagaattctctttgtgttcaataatagggttcasgaagtcatg 2327 ---g--- tgattcttcttacccaccgtgatggtaaaccatacagatca-actgtgctgttcttgccatttcagtgtctaa 2399 --t---a---c---a----g--- aatgcaagcattagtcagtaacagtgaaaaaattacaaactcctacaagctgctgaggatctgcagagaatcc 2472 ---g---g--g---a--- caagacwttaaactatcgtaggagaatgacctaaacatgctgactcacattaa-tytaaattccaaatgtttg 2544 ---a---g---c---a-t---g--- B

35 cagaacacaggagcacttctgggagcaatacaaaaaygcatggagtaacctacttctgcaactatatatctgt 2617 ---t---g--- gcaaatatcatcatccatctaaatttacacagtggaaggtgttgcttcttccccaccccagctgctacagcac 2690 --- cagatcctgctcagggcaacggggagagatgaggcctccctggacaggatggcttttgctaaccttgggctaa 2763 --a---

Exon 2 peptide leader

tacatcatctcagagcggctcatgtttttatttaagcagGGTCCTGCCTGCTCCTGCTGCTGGTGGTGTCAAA 2836 ---t---c---c--- TCTACTCTTGTGCCAGGGTGTGGTCTCCACCCCCGTCTGTCCCAATGGGCCTGGCAACTGCCAGGTGTCCCTT 2909 ---a--- CGAGACCTGTTTGACCGGGCAGTCATGGTGTCCCACTACATCCATGACCTCTCCTCGGAAATGTTCAACGAAT 2982 --- TTgtaagtactgtatttcttgcttatttccagaagaaacctttgcgtaagtgactgggctatactatccttta 3055 --- aacaagaaggctgcatcagccaaacttcaaagaacacactttctaggtcaaataagacattagctcataagat 3128 --- gtggtaactgaagaaaagatgtttcatgaaatctcaatgattcttaagcagtgacatacctgtttcaatttgc 3201 ---c-g--- ttttatttgttaaatttccaaaataaatttaaagcacctgtatttgtcagcttggactctcatagcagaatac 3274 --- catagactcagtagattaaacaacakaactttatttcctcgcacttctgggggctggaggtcccggatcaggg 3347 ---g---g---t---t---c---a- tgccagcaaggtcagtttctggtaagggctctgtctacccaggttggcttctccctgtgtccatgcagggttg 3420 --- ggggcagggaagagaaacagaggaaaggcacagagacaaaaga--aaactctctggtgtttctcttcataaag 3491 ---ga---ca--- actctaacatattggatcagtgttccaccctacaagctcatttaactttaattaatcctcataatcttcTGAG 3564 ---t---g---g- CTTCCCTTGTCGCTCAGCTGGTAAAGAATCTGCCGGCAATGTGGGAGACCTGGGTTCGATCCCTGGGTTGGGA 3637 ---g---ca--t---t---a--- AGATCCCCTGGATAAGGGAAAGGCTACCCACTCCAGTATTCTGGTCTGGAGAATTCCATGGACTGTATAGTCC 3710 ---c--- ATGGACTCGCTAAGAGTGGGACACAAATGAGCGATTTTCACTTTCATTgccaatcttcataaGGGCTTCCTAG 3783 ---t---t----t--- GTGGTGCTYGTGGGGAAGAACCCTCCTGCCAATGCAGGAGACATAAAAGATGCAGGTGCAATCCCTGGGTCAG 3856 ---c---a--- GAAGATGCCCTGGAGGAGGGCATGACAACCCACTCCAGTATTCTTGCCTGGAGAATCTCCATGGACAGAGGAG 3929 ---t--- CCTGGAGGGCTATAGTCCACAGGGTTGCAAATAGCAGTGCACAACTGAAGC---GTAGCTTGCACACAGTCTT 3999 ---a---g---gac--- CATAAAGGCCCTTTTCCAAACACAGTACTTTGGAGATTTTTGCTTCAACACATGAATTTGGGGGAGAAGGAAA 4072 ---a---c---c--- TGGCAACCCACTCCAGTGTTCTTGCCTGGAGAATCCCAGGGACGGGGGAGCCTGGTGGGCTGCCATCTATGGG 4145 ---t---g--- C D

36 GTTGCACAGAGTCGGACACGACTGAAGCGACTTAGCAGCAGCagcagcattcagttcataacagtacctgaca 4218 --c---t---g--- aaaagcactcttaggtggggctgggaaaaagaagcatcttgattttctggtccttcagtgtccctctgggcat 4291 ---g--- tcttcacccagcacacagtaaatagccaatcaatgggaactgcacttcagtgaactgggtggatggaacatat 4364 ---a---c-- tagacagagctgaattcctgtaatgaaaacaaataatgatagttttttaaatgctacaaattactgttctaag 4437 --- atgtgcaatatatgggtttataactacaatagaatkcttggtttataattggaaacaaaattattctctttct 4510 ---g--- gatgaaattacttttraagttgcatactcgtttatgtcaatcaaggagctcatagtagagcacacaactgata 4583 ---a---t---t---c---g-a--- aaaaatggtrctcaaagtttctattaaattcatatagttctttttattcactagttttcctttcatcttccat 4656 ---g--- ttttgactgtcatcttttttccagatctttgaagtaatctctttaaatgctcacaacttttgctaaagattag 4729 ---c---a-- gttttctttatcaccgtgttagctagttatttcgactctccttctcagtccattgcttactattttcaaaaat 4802 ---a-a---g--- tttatgccatgtttttctgacttaccattttctcatcatcaacaatactgtattctgcatctgtgaagcatac 4875 ---c---g--- taagctataggtttgtggattcagattagtcaaagaaaagttataattatatatcttcttttaagggagtata 4948 ---c- ttgattccaacccaaagtaaacaagagattaaatgtctatataggtatcatacatatgcactatatttggttc 5021 ---g---c--- aaatactaaaaaaagatgatacttaataaagcagttaatatttcatatttgggttatttttagtgtttgctat 5094 ---g----t--- ccaaatagtaactatgggaaggatgaaatgaaacaagggaaaaaaaagaaggaaagaggttggaattcagatg 5167 ---t--- acaagcaactgttttcagagataatggaaagaaaaagtaggaaaaagaattactttcaatttttatrtgaccc 5240 ---t---g--- tcattaaaaa--attattcatctatggaacrtgttaatattcwgctaaaggttcatttattgaatgcccaaac 5311 ---aa---ca---g---t--- Exon 3 aaccctaacaaattgaatttgcttggtcgcttccagGATAAACGGTATGCCCAGGGCAAAGGGTTCATTACCA 5384 ---g---a-t--- TGGCCCTCAACAGCTGCCATACCTCCTCCCTTCCTACCCCTGAAGACAAAGAACAAGCCCAACAGACCCACgt ---g---t---t-- gagtcttttatccgggttttcaccagaacaagtgagaragtgcactggtgttaccaggcttcaggttattaga ---c---c--- ggtcatggtaactggacatgcagagaaaggtggagaaacagtaaataatcaaagaggaattgcattatgcagt ---t--tgc-t-at -c-g--- tggtgaaatatgagtagaatcaagggatgactataaagatctgtagcagcaaaataaataacagatctatgaa --a---a--- ttgtccatacagacaacataagttcaaccaatgcattagatccaaggttgcagccattatactgtatgaaaac ---gtg---c--- 5749 5457 5530 5603 5676

37 atgaaatgaatggaatgtccatgtttaaaatatagatttaaaaaatccatggatatgtaagaaacataacccc ---a---t---c--- agttttgagtattccctgtactagtgactcctacatgggagtctcttctacactgcgctacttaagccactaa ---a---a---c-- ttctgcctttcaaggctcacctgattcttttacttctctgacacctacctcattcttgactgactcctctatc ---c---c---a- acatcttatttttaattataaatctccccccaaaaatgggtcctaaaaaatattatgttttgcttctcctggc --c---t---c ---a---t tgtgatgattgcctttgttctgatgaccacacatctaccgataagcctcaatcgtgtatcccagatccaaatt ---a---tg---a--- tttatcattataatcgctcctttctgattccctgagctaggcacagtgctagcattatttaaaatatttccac ---c--c---a---c----a--- atgcacctccccttaagtacaatctgttctcttgcttcagctttgttagtgatgccagcatttttttcatctg ---a----g--- ytaatcttcttaataaggaggatgataaaatgaaggaagaaggtcaagaagaaaaagg---acttttaaaata c---agg--- agtttaaaataaatttaaaatttattgagagctattaccttgccatacaatttacaaagtggtttgttttcat ---ac--- tactatgtttaatcctcacaaraattcctgtagcacagtgactgttattatacttcctgtaatatggaaacca ---tg-a---a----c---c--- agactcagaaaaattgtggaatttgcaccagtcacataggtagtaagcagtgattctggatttcttccaactc ---t---g--- -- agagctctcactcttcctctttaagctacaatgcccccaggaaaaccatgctgccactcacccttaagtctga ---c---ag--- atttcatttcagctcccttactctcacatcccatcatgtttctattgcaatgtctgtttgattcttctctgct --- gttcattttctgtaccattaaagtagttcatggctacatcaagaaatcaagcattttagtcagagatgctcag ---c--- ---a---a--- cccctgggagtttcatgtccagtcctggtagtagtgaactagggggcaaaaccctccattgtgaatcccaatg ---g- ---a---g-g---c-a atgctgctaataaagacaacactgtgccattttctgcccagacacatgtcaacaaaatagactgctctgatat ---ct---c--- cagcttgggggctgatgttgggatggactgaggaaagtgtggttaggaatgtcatatcttctgcattgcctct --- ---tt-c--- ttgttctgatatcataaaaggaactaccaatcaaaaa-taaaaatacattaatgaatacatyrattcattaat ---a---c---c---g---cg--- atgaatgaatctcagggtgaaaatgaggtgggcacaggtggagtccttccttcctgggtcaggtactccaggc ---a-t---t---t---t--- acatactgagttccaacaaaayacttagatttctctccccagacaagcaaagcattcaaatataaaagaactc ---t--- actgagtggatggcagaatttcagagggaaaaagaaaatt-tttatgttataaattagaactaatcagaarca 7277 ---c---c---c---a-- ttggttactaaaataagccagatttttaagtatttcagcaaagtataaaccgatagcttacattttataattt 7350 --- 5822 5895 5968 6041 6114 6187 6260 6330 6403 6476 6549 6622 6695 6768 6841 6914 6987 7059 7132 7205

38 tgcaaccttcaaaaaattttcaatacatataggaaaacccaggagttttttaggtcagtcactctgagcaaaa 7423 ---a---a--- Exon 4 attacatgttaccaaatccactgaattatgcttattttaatgagattgtttcctgtggttgttcagCATGAAG 7496 --c---t---c--- TCCTTATGAGCTTGATTCTTGGGTTGCTGCGCTCCTGGAATGACCCTCTGTATCACCTAGTCACAGAGGTGCG 7569 ---t---c---a-- GGGTATGAAAGGAGCCCCAGATGCTATCCTATCGAGGGCCATAGAGATTGAGGAAGAAAACAAACGACTTCTG 7642 --- GAAGGCATGGAGATGATATTTGGCCAGgtgagcagccycatgaaagcttccttgctattctcatgaatgagag 7715 ---tt---t--- aggtaatttctgtaatgaggaatgagttttgaactatctcactgttcaagaacacaattcaggccttcttttt 7788 ----g---a--- ctagaacagtattacataaatcaagaacctgttcattcatagtgatagattctattgtaagtgaattagaatt 7861 ---c-g--g---g--- ccacagcaatttttcacaggtatagtctttcttgaattgcacwgttacaccaaaatcttgccttttcctgggt 7934 ---t--a---c--- acagatggctgaaatattttcaaggataagagaactagagaatacaatttgcaagataaatgttttcttcaaa 8007 ---t--- atatcccaagatatcctctactgaaattcagcttgtattctttctctgttctcctcaaaccataggatgcgag 8080 ---a---c---a--a taagaagaaagaaaagagaaggtcaaaaccaaatacttgagttctgcttttagtttttattaataaattacta 8153 -g---a--- --- acagatatctgatacactggctccaaaatccaagtgtagagactttsatgtatcttccctaatttttaatttg 8226 ---t---c--- Exon 5 ataattagaaagaacaaagatgagcaaatactactaaaactcataataactcattatcttttggatgtttagG 8299 ----a---t--- TTATTCCTGGAGCCAAAGAGACTGAGCCCTACCCTGTGTGGTCAGGACTCCCATCCCTGCAAACTAAGGATGA 8372 ---g--- AGAGGCGCGTTATTCTGCTTTTTATAACCTGCTYCACTGCCTGCGCAGGGATTCAAGCAAGATTGACACTTAC 8445 ---t--a---c--- CTTAAGCTCCTGAATTGCAGAATCATCTACAACAACAACTGCTAAGCCCACATTCATCCTATCCATTTCTGAG 8518 --- ATGGTTCTTAATGATCCATTCCCTG-CAAACTTCTCTGAGCTTTATAGCTTTGTAATGCATGCTTGGCTCTAA 8590 ---c--- TGGGTTTCATCTTA 8604 ---

Figura2: Sequenze nucleotidiche del gene della prolattina (PRL) bufalina e bovina. La numerazione è relativa al primo nucleotide (+1) del primo esone e i trattini rappresentano i nucleotidi identici a quelli della linea superiore.

39

4.2. Analisi delle regioni esoniche

Sono stati sequenziati tutti e 5 gli esoni del gene che codifica per la prolattina (PRL) per un totale di 858 nucleotidi, con un contenuto in A/T e G/C rispettivamente del circa 50,1 % e 49.9 %.

L’analisi delle sequenze ha messo in evidenza la presenza di una mutazione silente: C → T, al nucleotide 108 dell’esone 5.

Figura 2: mutazione esonica riscontrata nel 5° esone.

Le omologie realizzate con le sequenze disponibili in banca dati (Figura 4), hanno messo in evidenza alcune differenze; di particolare interesse è risultata quella con la sequenza XM_006072861.1 (Bubalus

bubalis prolactin-like, transcript variant X1, mRNA) la quale si

caratterizza per la presenza di una extra codone “CAG” tra il primo ed il secondo esone.

40

Dall’analisi della sequenza genomica tale tripletta corrisponderebbe agli ultimi tre nucleotidi del primo introne. L’evento è, quindi, riconducibile ad un possibile splicing alternativo riguardante il secondo esone, un evento costitutivo allele-indipendente: casuale inserzione dell’ultima tripletta dell’introne 1, per riconoscimento di un extra sito accettore (AG) di splicing (Figura 3).

41 2 M D S K G AGCCATAGGACGAGAGCTTCCTGGTGAAGTGTGTTTCTTGAAATCATCACCACCATGGACAGCAAAGGTT 70 --- ---- --- . . . . . . S S Q K G S C L L L L L V V S N L L L C Q G V CGTCACAGAAAG GGTCCTGCCTGCTCCTGCTGCTGGTGGTGTCAAATCTACTCTTGTGCCAGGGTGT 140 ---cag--- ---c--- . . . --a--- . . . --a---t--- V S T P V C P N G P G N C Q V S L R D L F C P GGTCTCCACCCCCGTCTGTCCCAATGGGCCTGGCAACTGCCAGGTGTCCCTTCGAGACCTGTTTGACCGG 210 --- --- --- --- A A M V S H Y I H D L S S E M F T E F D K R Y GCAGTCATGGTGTCCCACTACATCCATGACCTCTCCTCGGAAATGTTCAACGAATTTGATAAACGGTATG 280 --- --- --- --- A Q G K G F I T M A L N S C H T S S L P T P E D CCCAGGGCAAAGGGTTCATTACCATGGCCCTCAACAGCTGCCATACCTCCTCCCTTCCTACCCCTGAAGA 350 ---—- --- --- --- K E Q A Q Q T H H E A L M S L I L G L L R S W CAAAGAACAAGCCCAACAGACCCACCATGAAGTCCTTATGAGCTTGATTCTTGGGTTGCTGCGCTCCTGG 420 --- --- --- --- N D P L Y H L V T E V R G M K G A P D A I L S AATGACCCTCTGTATCACCTAGTCACAGAGGTGCGGGGTATGAAAGGAGCCCCAGATGCTATCCTATCGA 490 --- ---c--- --- --- R A I E I E E E N K R L L E G M E M I F G Q V I GGGCCATAGAGATTGAGGAAGAAAACAAACGACTTCTGGAAGGCATGGAGATGATATTTGGCCAGGTTAT 560 --- --- --- --- 3 5 4

42 P G A K E T E P Y P V W S G L P S L Q T K D E TCCTGGAGCCAAAGAGACTGAGCCCTACCCTGTGTGGTCAGGACTCCCATCCCTGCAAACTAAGGATGAA 630 --- --- --- --- E A R Y S A F Y N L L H C L R R D S S K I D T GAGGCGCGTTATTCTGCTTTTTATAACCTGCTYCACTGCCTGCGCAGGGATTCAAGCAAGATTGACACTT 700 ---t--- ---c--- ---c--- ---c--- Y L ACCTTAAGCTCCTGAATTGCAGAATCATCTACAACAACAACTGCTAAGCCCACATTCATCCTATCCATTT ---g--- --- --- ---. . . ---. . . CTGAGATGGTTCTTAATGATCCATTCCCT-GCAAACTTCTCTGAGCTTTATAGCTTTGTAATGCATGCTT ---g--- --- . . . . . . GGCTCTAATGGGTTTCATCTTA --- XM_006072861.1 --- NM_001290885.1 . . . gb|EU340420.1 . . . gb|EU340420.1

Figura 4: Analisi delle regioni esoniche sequenziate e le sequenze presenti in banca dati.

43

4.3. Analisi delle regioni introniche

Sono state sequenziate tutte le regioni introniche del gene PRL bufalino per un totale di 7741 bp che si caratterizzano per una percentuale di A/T e G/C rispettivamente pari a 62.4% e 37.60%.

Il confronto delle sequenze dei diversi soggetti presi in esame ha permesso di evidenziare 34 mutazioni: quindici nel 1° introne (10 transizioni, 5 trasversione), otto nel 2° introne (5 transizioni, 3 trasversioni), otto nel 3° introne (6 transizioni 1 trasversione ed una inserzione (Figura 5)) e tre mutazioni nel 4° introne (1 transizioni, 2 trasversioni). MUTAZIONE POSIZIONE Introne 1 A C ₁₃₆ Introne 1 A G ₆₆₈ Introne 1 A G ₆₇₁ Introne 1 A G ₈₈₀ Introne 1 A G ₁₅₈₆ Introne 1 T C ₁₆₀₂ Introne 1 C G ₁₇₇₁ Introne 1 T C ₂₀₇₁ Introne 1 C G ₂₁₀₃ Introne 1 T C ₂₂₃₀ Introne 1 T C ₂₂₃₈ Introne 1 C G ₂₃₂₂ Introne 1 A T ₂₄₈₃ Introne 1 T C ₂₅₃₁ Introne 1 T C ₂₆₈₅

44 Introne 2 T G ₃₃₀₄ Introne 2 C T ₃₇₉₆ Introne 2 G T ₄₄₇₇ Introne 2 A G ₄₅₃₀ Introne 2 A G ₄₅₉₇ Introne 2 A G ₅₂₃₈ Introne 2 A G ₅₂₇₃ Introne 2 A T ₅₂₈₅ Introne 3 A G ₅₅₇₂ Introne 3 INS 1 T 6324-6330 Introne 3 T C ₆₃₃₇ Introne 3 A G ₆₅₀₁ Introne 3 T C ₇₁₂₄ Introne 3 A G ₇₁₂₅ Introne 3 T C ₇₂₃₀ Introne 3 A G ₇₃₅₁ Introne 4 T C ₇₇₅₆ Introne 4 T A 7980 Introne 4 G C 8276

Tabella 9: Mutazioni introniche riscontrate nei campioni. La numerazione è relativa al 1° nt del 1° esone (+1)

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4.4. Analisi del promotore

L’analisi del promotore ha messo in evidenza cinque putative sequenze GATA (AGATAA) in posizione -342/-333, -306/-297, -232/-223, -217/-208, 57/66; due putative TATA Box, localizzate rispettivamente ai nucleotidi -27/-22, -56/-52.

L’estremità 5’ del gene, mostra quattro siti putativi CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP, 298/285, 220/211, -118/-109, -79/-70) (Raught et al. 1995), due siti NF Oct-1 (Nuclear

Factor Octamer -1) (Bohmann et al. 1987) e due siti c-Jun (N-terminal

kinases).

Inoltre il gene presenta un possibile sito Pit -1a, (pituitary-specific

transcription factor) (Bodner 1988), un fattore di trascrizione cellulo-specifica, che si lega al gene prolattina in diversi siti, per consentire la produzione di prolattina nella ghiandola pituitaria, e un fattore SP-1 appartenente alla famiglia delle Sp/KLF (Sp/Krüppel-like Factor) (Van Vliet et al. 2000) in posizione -74/-64.

Sono stati, inoltre, osservati un putativo sito consenso per NF1 (Nuclear Factor 1) un fattore di trascrizione che si lega al DNA e che interagisce con il suo sito DNA-affine con alta affinità ed un sito NF-kappa b (nuclear factor NF-kappa-light-chain-enhancer of activated B cells),

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si può trovare in tutti i tipi di cellule ed è coinvolto in tutte le reazioni delle cellule agli stimoli, gioca un ruolo chiave nella regolazione della risposta immunitaria alle infezioni.

4.5. Analisi dei retrotrasposoni

Negli eucarioti la trasposizione, è la forma più comune di trasferimento di materiale genetico, ed è determinata dalla capacità dei retrovirus di inserire nei cromosomi di una cellula ospite, copie di DNA per mezzo di trascrizione inversa del proprio genoma virale.

Gli elementi inseriti, sono denominati retroposoni e possono generare brevi ripetizioni nel sito di inserzione del DNA bersaglio.

Le inserzioni di elementi di origine retroposonica, possono posizionarsi indifferentemente in ogni posizione del genoma, negli esoni e negli introni, e svilupparsi in direzione 3’- 5’ oppure 5’- 3’.

In accordo con la nomenclatura proposta da Lenstra et al. (1993), per il genoma bovino sono state individuate tre differenti tipologie di retroposoni denominati: Bov-B, Bov-A2 e Bov-tA, che incidono rispettivamente per lo 0,5%, 1,8%, and 1,6% sull’intero genoma bovino; ad esempio il Bov-tA è contenuto in 285000 copie (Lenstra et

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Il Bov-B, che è stato originariamente descritto come un SINE (Short

Interspersed Repeats) o Art2 o PstI si caratterizza oltre che per

ripetizioni PstI, di circa 560 bp, anche per un segmento di 78 bp, all’estremità 3’, omologo alla sequenza monomerica di 115bp del Bov-A (Lenstra et al, 1993) (Figura 6).

Quest’ultimo elemento non è mai stato trovato in singola copia, probabilmente perché generato dalla delezione della porzione centrale di un Bov-B e dal successivo riassemblamento delle due estremità (Okada et al. 1997). Il Bov-tA (eterodimero di un frammento di 73 bp di uno pseudogene di un t-RNA più un Bov-A) e il Bov-A2 (dato dalla duplicazione di un Bov-A) sono i più frequenti SINE riscontrabili nel genoma bovino (Lenstra et al. 1993). In particolare, essi hanno in comune la presenza di un elemento Bov-A.

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Figura 6: Elementi di origine retroposonica (Lenstra et al. 1993)

Il gene della prolattina (PRL) nel bufalo, si caratterizza per la presenza di 4 sequenze nucleotidiche che mostrano un’alta omologia con sequenze di origine retroposonica indicate come A, B, C, D.

L’elemento A, si localizza nel primo introne in posizione 738-922, e sembrerebbe essere una sequenza retroposonica di tipo L1_Art (Duncan 1987). Tale sequenza presenta, infatti, una omologia del 78%

ml mr 560 bp Bov-B R 115 bp R Delezione (Step 1) 75 bp 115 bp R ml mr Ricombinazione con tRNA preudogene

(Step 2) Duplicazione del Bov - B

Bov-A ml mr R R 115 bp 115 bp ml mr ml mr Bov-A2 Bov-tA 115 bp: unità monomerica mr: metà destra dell’unità monomerica

ml : metà sinistra dell’unità monomerica

73 bp: tRNA pseudogene 560 bp : Pst I

R : ripetizione tandem

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con le sequenze L1_Art bovine depositate in banca dati (gb|AC150707.3); l’elemento B, anch’ esso posizionato nel primo introne in posizione 1953-2152, ha mostrato un omologia di circa il 78% con le sequenze retroposoniche Bov-B descritte da Lenstra et al. (1993) e quelle presenti in banca dati (gb|AC150561.6).

Gli elementi C e D si collocano nel secondo introne, rispettivamente in posizione 3565-3762 e 3777-4191; per il primo elemento osserviamo una forte omologia (89%) con le sequenze riconducibili a Bov-tA2 (Lenstra et al. 1993), mentre il secondo (omologia del 75%) con il retroposone di tipo Bov-A2 (Lenstra et al. 1993).

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4.6. Genotipizzazione

La successiva genotipizzazione, effettuata su un campione di 755 esemplari di bufalo mediterraneo, suddivisi tra quattro aziende, tre Campane ed una Potentina (Tabella 10).

Lo studio ha messo in evidenza la seguente distribuzione genotipica: 589 T/T, 154 C/T e 12 C/C, con una frequenza dell’allele T dello 0.88%. La distribuzione dei genotipi è risultata in equilibrio di Hardy-Weinberg. T/T C/T C/C TOTALE capi Az. Campana 1 138 40 0 178 Az. Campana 2 253 62 6 321 Az. Campana 2 108 29 4 141 Az. Basilicata 90 23 2 115 Totale genotipi 589 154 12 755 Tabella 10: Genotipizzazione.

Sebbene il polimorfismo individuato nella regione codificante non determini cambiamento aminoacidico, non è da escludere una sua possibile associazione con caratteri di interesse economico compresi quelli attualmente molto difficili da misurare quali la qualità e quantità del latte in gruppi di soggetti dei quali si disponga dei dati fenotipici.

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Conclusioni

E’ stato sequenziato l’intero gene codificante la prolattina (PRL), nella Bufala Mediterranea, più 361 nucleotidi fiancheggianti la regione 5’. Il gene della prolattina si estende su un tratto di 8681 bp, che comprendono 858 bp di regioni esoniche e 7741 bp di regioni introniche.

La struttura del gene si presenta poco frazionata essendo composta da solo 5 esoni.

Il gene della prolattina (PRL) bufalina, relativamente alle regioni sequenziate, mostra un’organizzazione molto simile a quella dell’omologo gene nella specie bovina, le sostanziali dissomiglianze, si acclarano nelle regioni introniche, l’omologia pertanto è del l’96%. Leggermente inferiore invece è risultata l’omologia con la specie ovina, che si attesta intorno al 94%.

Come da atteso le principali differenze di sequenza si rilevano nelle regioni introniche.

L’analisi delle sequenze ottenute dai 5 soggetti presi in esame ha evidenziato la presenza di 34 siti polimorfici (SNP) nelle regioni introniche (22 transizioni, 11 transversioni, 1 inserzione nucleotidica)

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e una transizione nel 5° esone, con un rapporto transizione/trasversione (ti/ts) di 2.09.

La valutazione del rapporto ti/ts è importante non solo per comprendere l’evoluzione dei pattern di DNA, ma anche per rendere più attendibile la stima della distanza genetica e della ricostruzione filogenetica delle specie (Yang and Yoder, 1999).

Su un campione di 755 esemplari di Bufala Mediterranea, allevate in quattro aziende, tre Campane e una della Basilicata, è stata condotta una genotipizzazione per l’unica mutazione esonica osservata (transizione C → T, al nucleotide 108 al 5° esone). I risultati hanno evidenziato una frequenza dell’allele T pari allo 0.88%.

Inoltre lo studio del gene della prolattina (PRL) nel bufalo, ha permesso di individuare la presenza di 4 sequenze nucleotidiche che mostrano un’alta omologia con sequenze di origine retroposonica indicate come A, B, C, D.

L’elemento A, mostra una omologia del 78% con le sequenze L1_Art (Duncan 1987) bovine depositate in banca dati.

L’elemento B, anch’ esso posizionato nel primo introne, ha mostrato un omologia di circa il 78% con le sequenze retroposoniche Bov-B descritte da Lenstra et al. (1993).

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Gli elementi C e D si collocano nel secondo introne; per il primo elemento osserviamo una forte omologia (89%) con le sequenze riconducibili a Bov-tA2 (Lenstra et al. 1993), mentre il secondo (omologia del 75%) con il retroposone di tipo Bov-A2 (Lenstra et al. 1993).

I progressi della genetica molecolare offrono la possibilità di analizzare regioni genomiche che influiscono su tratti di rilevanza economica e per identificare polimorfismi genetici utili per i programmi di selezione marker-assistita(MAS).

Negli ultimi anni, alcuni studi sono stati effettuati sui bufali per l'identificazione di polimorfismi genetici ai loci delle proteine del latte (Masina et al. 2007; Cosenza et al. 2009a, b; Pauciullo et al. 2011; Cosenza et al. 2014), e sono stati identificati geni candidati responsabili per variazioni delle caratteristiche quali-quantitative del latte di Bufala Mediterranea. (Cosenza et al. 2007; Pauciullo et al. 2010a).

Ultimamente sono state individuate associazioni significative tra marcatori genetici e caratteri di interesse economico, come la produzione di latte (Pauciullo et al. 2012a, b) e le proprietà di coagulazione del latte (Bonfatti et al. 2012).

L’analisi dei marcatori genetici identificati al locus codificante per la prolattina rivestono una notevole importanza in quanto non è da

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escludere una loro possibile associazione con caratteri riproduttivi/produttivi di interesse economico compresi quelli attualmente molto difficili da misurare quali la qualità e quantità del latte.

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