1. INTRODUZIONE...8
1.1. LO SVILUPPO DELLA RETINA NEI VERTEBRATI...9
1.1.1. Introduzione ...9
1.1.2. Xenopus laevis come organismo modello ...10
1.1.3. Il campo precoce dell'occhio ...11
1.1.4. Il fattore di trascrizione Xrx1 ...12
1.1.5. Il ruolo dei microRNA nella retinogenesi ...14
1.2. RICERCA DEI GENI REGOLATI DA XRX1 ...15
1.2.1. Strategia generale del progetto ...15
1.2.2. Come funziona un set di sonde ...18
1.2.3. Assegnazione e annotazione ...19
1.2.4. Risultati degli esperimenti ...19
1.2.5. Fasi successive del progetto ...20
1.3. PROBLEMI INCONTRATI...21
1.3.1. Set di sonde senza annotazione ...21
1.3.2. Set di sonde con annotazioni errate ...22
1.3.3. Scarsa annotazione dei trascritti di Xenopus laevis ...23
1.4. SOLUZIONI PROPOSTE IN LETTERATURA...25
1.4.1. Cause degli errori nelle annotazioni Affymetrix ...25
1.4.2. Soluzioni adottate in precedenza ...25
1.4.3. Cause delle scarsa annotazione dei trascritti di Xenopus laevis ...27
1.4.4. Banche dati disponibili ...28
1.4.5. Limiti delle strategie utilizzate ...29
1.4.6. Una strategia alternativa ...29
1.4.7. Elementi per una soluzione in Xenopus laevis ...30
1.5. SCOPI DELLA TESI...33
1.5.1. Obiettivo 1: annotazione esaustiva dei trascritti di X. laevis ...34
1.5.2. Obiettivo 2: quantificare e risolvere i problemi Affymetrix ...35
1.5.3. Obiettivo 3: identificare nuovi microRNA in Xenopus laevis ...35
2. MATERIALI E METODI...37
2.1. DATI E STRUMENTI UTILIZZATI...38
2.1.1. Fonti di dati esterne ...38
2.1.2. Organizzazione dei dati ...39
2.1.3. Linguaggi e piattaforma utilizzata ...40
2.1.4. Strumenti bioinformatici di terze parti ...41
2.2. METODI...42
2.2.1. Panoramica della strategia seguita ...42
2.2.2. Dalle sonde ai trascritti ...44
2.2.3. Dai trascritti alle regioni genomiche candidate ...45
2.2.4. Dalle regioni candidate agli allineamenti ...47
2.2.5. Dagli allineamenti ai geni ...48
2.2.6. Annotazione di microRNA ...49
2.2.7. Altre operazioni ...53
3. RISULTATI...56
3.1. RIANNOTAZIONE ESAUSTIVA DEL TRASCRITTOMA DI XENOPUS LAEVIS...57
3.1.1. Tipi di sequenze trascritte ...57
3.1.2. Copertura e similarità ...57
3.1.3. Classificazione degli allineamenti ...58
3.1.5. Allineamento degli mRNA completi ...65
3.1.6. Allineamento delle sequenze ESTs ...66
3.2. AGGIORNAMENTO DATI MICROARRAY AFFYMETRIX...67
3.2.1. Premessa ...67
3.2.2. Criteri per il confronto dei risultati ...67
3.2.3. Riannotazione completa del microarray Affymetrix GeneChip ... Xenopus laevis Genome Array 69 3.2.4. Guadagno di funzione di Xrx1: riannotazione dei geni differenzial-... mente espressi 70 3.2.5. Perdita di funzione di Xrx1: riannotazione dei geni differenzial-... mente espressi 71 3.2.6. Un esempio specifico ...72
3.3. IDENTIFICAZIONE DI NUOVI MICRORNA ...73
3.3.1. MicroRNA xla-mir-1b. ...74 3.3.2. MicroRNA xla-mir-15c ...75 3.3.3. MicroRNA xla-mir-23a ...75 3.3.4. MicroRNA xla-mir-24b ...76 3.3.5. MicroRNA xla-mir-92a-1 ...77 3.3.6. MicroRNA xla-mir-92a-2 ...78 3.3.7. MicroRNA xla-mir-133b ...79 3.3.8. MicroRNA xla-mir-133d ...79 3.3.9. MicroRNA xla-mir-142 ...80 3.3.10.MicroRNA xla-mir-194 ...81 3.3.11.MicroRNA xla-mir-205 ...82 3.3.12.MicroRNA xla-mir-223 ...82 3.3.13.MicroRNA xla-mir-363 ...83 3.3.14.MicroRNA xla-mir-703 ...84 3.3.15.MicroRNA xla-mir-1306 ...84
4. DISCUSSIONE...86 1. Annotazione sistematica dei trascritti di Xenopus laevis ...87 2. Riannotazione del microarray Affymetrix GeneChip Xenopus laevis
...
Genome Array 93
3. Nuovi microRNA identificati ...99 4. Conclusioni ...
Riassunto
Lo sviluppo dell'occhio dei Vertebrati è un processo altamente ordinato che richiede specifici segnali induttivi e precisi movimenti morfogenetici. Le fasi precoci di questo processo cominciano in una regione ben definita della piastra neurale anteriore, chiamata campo precoce dell'occhio ("eye field"). È stato dimostrato che, in questa regione, un complesso network di fattori di tra-scrizione (ETFTs) contribuisce ad innescare una serie ordinata di eventi che portano al successivo sviluppo della retina e delle strutture dell'occhio. Tra gli EFTFs, Xrx1 è espresso precocemente, ed è necessario per il corretto sviluppo della retina.
Per identificare i geni regolati da Xrx1, sono stati condotti esperimenti con i microarrays Affymetrix, comparando i profili di espressione di embrioni interi nei quali l'espressione di Xrx1 era stata aumentata o fortemente ridotta. Questi esperimenti hanno prodotto una mole di dati preziosi per la compren-sione dei meccanismi regolati da Xrx1.
Tuttavia, alcuni problemi bioinformatici legati alla piattaforma Affyme-trix, e descritti in letteratura, hanno complicato l'interpretazione dei dati spe-rimentali. Anche se una soluzione preliminare a questo problema era già stata sviluppata nel nostro laboratorio, questa non era riuscita ad eliminare alcune incertezze nei dati. Inoltre, l'annotazione non esaustiva dei geni di Xenopus
laevis, aveva reso difficile la selezione dei geni su cui compiere ulteriori
inda-gini sperimentali.
Il primo scopo di questa tesi è stato dunque la soluzione dei problemi in-formatici relativi che affliggono i dati derivati dagli esperimenti con i
microar-dei geni di Xenopus laevis, attraverso l'uso microar-dei dati genomici disponibili per
Xenopus tropicalis.
Recentemente è stato dimostrato che alcuni microRNA controllano la tra-duzione di fattori di trascrizione chiave per il differenziamento dei precursori retinici, giocando un ruolo importante durante la retinogenesi tardiva (De-cembrini, et al., 2008; Georgi and Reh, 2010). Tuttavia, poche informazioni sono disponibili riguardo al ruolo dei microRNA nel campo precoce dell'oc-chio, e alla loro eventuale interazione con gli ETFTs come Xrx1.
Durante l'analisi preliminare dei dati degli esperimenti condotti con i mi-croarrays, avevamo osservato che alcune sequenze EST di Xenopus laevis, che non sembravano codificare per alcuna proteina nota, rappresentavano in realtà trascritti primari capaci di originare microRNA (pri-miRNA). Inoltre, in alme-no un caso, una sequenza di questo tipo era stata rappresentata casualmente sulla superficie del microarray Affymetrix GeneChip per Xenopus laevis. Una esaustiva ricerca di casi analoghi avrebbe quindi potuto consentire di estrarre dai dati degli esperimenti con i microarrays Affymetrix alcune informazioni ri-guardo l'effetto di Xrx1 sui microRNA del campo precoce dell'occhio. L'ostaco-lo principale era rappresentato dal fatto che, per Xenopus laevis, si conosceva-no soltanto poche sequenze di precursori di microRNA ufficialmente descritte in mirBase. Terzo e ultimo scopo di questa tesi è stato quindi quello di analiz-zare le sequenze EST disponibili per descrivere, sulla base delle omologie con altri organismi modello, il maggior numero possibile di microRNA in Xenopus
laevis.
I dati così ottenuti potranno essere utilizzati per verificare se i dati in no-stro possesso possono fornire informazioni riguardo una eventuale interazione tra Xrx1 e microRNA durante la retinogenesi precoce.
