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Università degli Studi di Pisa
Facoltà di Medicina e Chirurgia
SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN ENDOCRINOLOGIA E MALATTIE DEL METABOLISMO (Direttore Prof. P. Vitti)
Studio del ruolo della terapia sostitutiva con testosterone sulla infiammazione
prostatica indotta da sindrome metabolica: da uno studio preclinico al
disegno di una sperimentazione clinica.
Relatore: Prof. D. Canale
Candidata Dott.ssa Linda Vignozzi
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Sommario
Introduzione ...2
Ruolo della sindrome metabolica e del trattamento con testosterone sulla ghiandola prostatica: uno studio preclinico nel coniglio ...5
Scopo della Tesi...19
Ruolo della sindrome metabolica sulla ghiandola prostatica: uno studio retrospettivo nei pazienti affetti da sindrome metabolica e BPH...20
Ruolo della sindrome metabolica e della terapia sostitutiva con testosterone sulla ghiandola prostatica: ideazione e disegno di uno studio clinico randomizzato, doppio cieco, controllato contro placebo. ...23
Razionale ...23
Obiettivi dello studio...25
Endpoint ...27
Disegno dello studio...28
Popolazione in studio ...31
Piano statistico...33
2 Introduzione
I sintomi del basso tratto urinario (Lower Urinary Tract Symptoms, LUTS) sono una patologia ad elevata prevalenza e con un impatto importante sulla qualità di vita nella popolazione anziana. L’incidenza dei LUTS, infatti, nella popolazione maschile aumenta con l’invecchiamento, raggiungendo una prevalenza del >45% nella fascia di età >70 anni (Rosen et al., 2003). I LUTS comprendono sintomi irritativi (urgenza, nicturia, aumento della frequenza) ed ostruttivi (ipovalidità, esitazione, mitto intermittente, sensazione di incompleto svuotamento). Nel maschio i LUTS sono frequentemente associati alla crescita della ghiandola prostatica, iperplasia prostatica benigna (Benign Prostatic Hyperplasia, BPH), con la conseguente compressione uretrale ed ostruzione, ed una irritabilità vescicale secondaria. Per tale motivo generalmente nel maschio ci si riferisce a LUTS secondari a BPH o LUTS/BPH. Il BPH rappresenta una delle patologie croniche più frequenti nella popolazione maschile (50% nei maschi tra 50-60 anni e 90% dei maschi >80 anni; McVary KT, 2006). Istologicamente, il BPH può essere definito come un aumento di volume della zona transazionale (periuretrale) della ghiandola prostatica associato ad un rimodellamento tissutale che coinvolge sia la componente epiteliale che fibromuscolare stromale (Fibbi et al., 2010). Studi preclini e clinici hanno dimostrato come il processo infiammatorio cronico della prostata sia, in realtà, il primum movens per lo sviluppo del BPH e conseguentemente dei LUTS. Il National Institute of Health (NIH) in una consensus ha definito e classificato la prostatite in quattro categorie (Krieger et al., 1999): Categoria I include la prostatite acuta batterica, categoria II prostatite cronica batterica; categoria III, altrimenti conosciuta come
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prostatite cronica / sindrome del dolore pelvico cronico (chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome, CP/CPPS). La CP/CPPS è definita come dolore pelvico cronico in assenza di dimostrabile infezione batterica ed è ulteriormente suddivisa in infiammatoria (IIIA) e non infiammatoria (IIIB), basata sulla presenza di leucociti nelle secrezioni prostatiche o nel liquido seminale. La categoria IV, o prostatite cronica asintomatica che è definita per la presenza di leucociti nelle secrezioni seminali o per la presenza di infiltrati infiammatori nei campioni istologici, in assenza di un tipico dolore pelvico cronico. La maggioranza delle prostatiti (60-80%) può essere classificata nella categoria III. La patogenesi della prostatite CP/CPPS è poco conosciuta, ma è ben stabilito il suo ruolo patogenetico nello sviluppo e progressione del BPH. Infatti, ad un infiltrato infiammatorio consegue la liberazione di citochine e chemochine (quali l’Iinterleuchina-8, IL-8) in grado, non solo di indurre il reclutamento di altre componenti cellulari flogistiche (automantenimento della flogosi), ma anche di stimolare la produzione di fattori di crescita per la cellule stromali di prostata (Fibbi et al., 2010). Un aumento dell’IL-8 nel liquido seminale è considerato, difatti, un marker surrogato di prostatite (Penna et al., 2007; Fibbie t al., 2010)
Sebbene l’invecchiamento sia ritenuto come il principale fattore di rischio per lo sviluppo e progressione del BPH, recentemente è stato dimostrato che LUTS possono riflettere anche altre malattie sistemiche (Moul S & McVary KT 2010). Infatti è stata documentata un’associazione indipendente tra LUTS e disfunzioni sessuali, lo stile di vita (fumo, alcool, sedentarietà) e molteplici fattori cardiovascolari, metabolici ed endocrini. In particolare, tra tutti questi una forte ed indipendente associazione con i LUTS è stata documentata per l’obesità e la sindrome metabolica
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(Mongiu S & McVary KT 2009; Moul S & McVary KT 2010; Gorbachinsky et al., 2010). Secondo la classificazione dell’NCEP-ATPIII (Alberti et al., 2009) la diagnosi di sindrome metabolica prevede la presenza di tre o più dei seguenti fattori di rischio cardio.-metabolici: l’obesità viscerale (Circonferenza vita>102cm), l’ipertensione
(pressione arteriosa≥130/85 o trattamento specifico), l’ipetrigliceridemia
(trigliceridi≥150 mg/dL o trattamento specifico), ridotti livelli di HDL (≤40mg/dL o trattamento specifico), la iperglicemia a digiuno (glicemia a digiuno≥110 mg/dl o trattamento specifico). L’obesità, ed in particolare l’adiposità viscerale, è stata raggruppata insieme ad altri fattori di rischio cardio-metabolici sotto la definizione della sindrome metabolica al fine di predire lo sviluppo di malattie cardiovascolari e metaboliche . In realtà studi recenti hanno evidenziato che la sindrome metabolica si associa non solo a malattie cardiovascolari e metaboliche, ma anche a disordini andrologici, quali la disfunzioni sessuali, infertilità maschile e LUTS/BPH. Pertanto la sindrome metabolica deve essere considerata più propriamente una condizione clinica caratterizzata da una presentazione fenotipica molto eterogenea (Gorbachinsky et al., 2010). Studi epidemiologici hanno documentato che pazienti con aumento del indice di massa corporea (Body Mass Index, BMI) soffrono più frequentemente di LUTS rispetto alla popolazione con BMI normale (Rohrmann et al., 2004; Seim et al., 2005). In particolare, in uno studio di popolazione su larga scala, Laven e coll. hanno dimostrato che la presenza di LUTS si associa strettamente alla presenza di obesità di tipo viscerale (Laven et al., 2008). Altri fattori della sindrome metabolica, quali l’ipertensione, il diabete mellito di tipo 2 (Michel et al., 2000; Michel et al., 2004; Tomita et al., 2009), l’iperglicemia ed i ridotti valori di HDL (Martin et al., 2011) hanno dimostrato tutti un’associazione con i LUTS. In accordo
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con questi dati, nel Boston Area Community Health study (BACH) si è dimostrata un’associazione positiva tra introito calorico (ed in particolare quello arricchito di acidi grassi polinsaturi) con i LUTS (Litman et al., 2007), corroborando il legame tra LUTS/BPH stile di vita e rischio cardio-metabolico
Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato una correlazione positiva tra BMI e caratteristiche ultrasonografiche della prostata. L’indagine ultrasonografica compiuta per via trasrettale con metodica color-doppler permette di valutare i seguenti parametri: ecostruttura, presenza di micro-calcificazioni, presenza di macro-calcificazioni; velocità di picco arterioso sistolico intraprostatico). In particolare ad un BMI maggiore corrisponde la presenza di caratteristiche ultrasonografiche indicative di un processo infiammatorio (macro-calcificazioni, disomogeneità, maggiore velocità di picco arterioso sistolico) e ad elevati valori di interleuchina-8 (IL-8) nel liquido seminale(Lotti et al., 2011).
Ruolo della sindrome metabolica e del trattamento con testosterone sulla ghiandola prostatica: uno studio preclinico nel coniglio.
Al fine di studiare l’interazione tra sindrome metabolica, ipogonadismo ed i loro effetti sulla ghiandola prostatica abbiamo messo a punto un modello animale di sindrome metabolica. Tale modello è ottenuto trattando conigli maschi adulti con una dieta arricchita in grassi (4% olio di arachidi e 0.5% colesterolo, high fat diet, HFD, n=44) per 12 settimane. Un gruppo di animali mantenuti per lo stesso periodo con una alimentazione standard è stato considerato come gruppo di controllo (n=22). Gli animali trattati con sindrome metabolica mostravano elevati valori di glicemia a digiuno, ridotta tolleranza ai glicidi, elevati valori di trigliceridi, ridotti valori di
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colesterolo HDL, aumento della pressione arteriosa (mean arterial pressure, MAP), ed un marcato aumento del grasso viscerale (vedi tabella 1). Inoltre, i conigli affetti da sindrome metabolica mostravano anche la presenza di un ipogonadismo ipogonadotropo, caratterizzato da bassi livelli di gonadotropine, bassi livelli di testosterone e ipotrofia delle ghiandole sessuali accessorie, quali le vescichette seminali e la prostata (tabella 1). In tabella vengono riportati anche i parametri cardiometabolici del gruppo di animali trattati con HFD e somministrazione giornaliera di un agonista selettivo del recettore nucleare Farnesoid X receptor, FXR, (INT-747, 10 mg/kg/die per 12 settimane, per via orale; n=14) conosciuto per migliorare i parametri della sindrome metabolica. Nel nostro studio, infatti, abbiamo confermato che questo agonista selettivo di FXR, INT-747, migliora l’iperglicemia a digiuno, la tolleranza ai glicidi, e riduce drasticamente il grasso viscerale. Al contrario il trattamento con INT-747 non altera lo stato di ipogonadismo. Un sottogruppo di animali affetti da sindrome metabolica è stato trattamento con testosterone (30 mg/kg/settimana i.m. per 12 settimane; n=13). Negli animali HFD, il trattamento con testosterone (T) non solo ripristinava uno stato di eugonadismo, ma normalizzava la glicemia a digiuno, la tolleranza ai glicidi, riduceva drasticamente il grasso viscerale e normalizzava la pressione arteriosa (tabella 1). Al contrario, non mostrava alcun effetto sulla dislipidemia (tabella 1).
7 Tabella 1
Tabella 1.Variazioni dei parametri metabolici nei diversi gruppi sperimentali al tempo 0 e alla 12° settimana. * p < 0,05, ** p< 0,01,
**** p< 0,0001 rispetto ai propri valori al tempo 0; °° p< 0,01, °°°p < 0,001, °°°°p< 0,0001 vs controlllo alla 12° settimana; ^^ p<0,01 vs HFD alla 12° settimana..
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Tale modello animale, pertanto, perfettamente mimava la condizione di sindrome metabolica nell’uomo.
In conclusione, in questi animali, similmente a quanto succede nell’umano abbiamo riscontrato anche lo sviluppo di un deficit di testosterone (ipogonadismo ipogonadotropo; Filippi et al., 2009; Vignozzi et al., 2011a) ed una importante infiammazione della prostata (Vignozzi et al., 2011b) . Abbiamo infatti evidenziato nelle prostate dei conigli con sindrome metabolica la presenza di un importante infiltrato infiammatorio all’indagine istochimica eseguita con ematossilina eosina (figura 1). Nei pannelli b e c, infatti, si mostra come nella prostata degli animali HFD sia presente un importante infiltrato di cellule infiammatorie a livello dello stroma interduttale e intracinare, dove sono presenti anche i tipici reperti istologici della prostatite: i corpora amilacea. Nella prostata dell’animale HFD si evidenzia, inoltre, una immunopositività per i marcatori dei leucociti (CD45; figura 2a-f), macrofagi (RAM11, figura 2a-b) e granulociti (lattoferrina, figura 3a-b) che infiltrano sia lo stroma che l’epitelio ghiandolare. All’indagini istologica si è evidenziato anche una importante fibrosi del tessuto (figura 4a-b) ed una marcata ipossigenazione (figura 5a-b valutata con il marcatore specifico di ipossia tissutale, Hypoxyprobe®).
E’ interessante osservare come il trattamento sostitutivo con testosterone era in grado di inibire sia il processo infiammatorio che la fibrosi e l’ipossia (vedi figure 1,3,4 e 5). Al contrario l’INT-747, pur mostrando al pari del testosterone un miglioramento sui parametri metabolici sistemici non evidenziava alcun effetto migliorativo sulla flogosi-fibrosi-ipossia prostatica (vedi figure 1,3,4 e 5).
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Figura 1. Staining con ematossilina eosina. Asterisco: infiltrati di cellule infiammatorie; freccia: corpora amilacea.
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Figura 2. Staining con anticorpo anti-CD45 (marcatore pan leucocitario). Asterisco: infiltrati di cellule infiammatorie CD-45 positive. Panello e: analisi densitometrica della
immunopositività.
Figura 3. Staining con anticorpo anti-RAM11 (marcatore dei macrofagi). Freccia: infiltrati di cellule infiammatorie RAM11 positive.
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Figura 4. Staining Masson tricromico. Asterisco: infiltrati di cellule infiammatorie CD-45 positive. Panello e: analisi densitometrica della quantità muscolo (staining rosso) e fibra collagene (staining blu) . ***p<0.001 vs controllo; °°°p<0.001 vs HFD.
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Figura 5. Staining con marcatore di ipossia tissutale iniettato nell’animale 1 hr prima del sacrificio (Hypoxyprobe) e rilevato all’indagine immunoistochimica con anticorpo
monoclonale specifico. Panello e: analisi densitometrica dello staining per Hypoxyprobe . ***p<0.001 vs controllo; °°°p<0.001 vs HFD
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Le prostate dei conigli con sindrome metabolica inoltre presentavano, all’analisi di espressione genica quantitativa (qReal Time RT-PCR) un aumento consistente di tutti i marcatori infiammatori (figura 6) aspecifici (COX2, RAGE) e specifici macrofagici (TLR2, TLR4, STAMP2), granulocitari (lattoferrina) e linfocitari (CD4, CD8,).
E’ interessante notare che l’HFD si associava ad un marcata induzione dell’espressione del fattore di trascrizione linfocitaria tipico della risposta immune Th1 (Tbet), e ad un significativo aumento dei fattori tipici della risposta Th2 e Th17, Gata3, RORγt rispettivamente (figura 7). Anche i marcatori di attivazione miofibroblastica (TGFβ, SM22 α, α-SMA, RhoA, ROCK1/ROCK2) risultano marcatamenti elevati (figura 8), supportando il rilievo istologico di una marcata fibrosi tissutale (Vignozzi et al., 2011b).
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Parimenti a quanto osservato con indagine immunoistochimica anche all’analisi di espressione genica il trattamento sostitutivo con testosterone era in grado di inibire l’induzione dell’espressione genica dei fattori infiammatori e della fibrosi (vedi figure 6, 7 e 8). Ancora una volta l’INT-747, non evidenziava alcun effetto migliorativo su tutti questi marcatori genici di flogosi e di fibrosi prostatica (vedi figure 6, 7 e 8).
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La condizione di MetS, nel nostro modello sperimentale, si associava non solo ad una riduzione dei livelli di T ma anche ad un aumento dei livelli sierici di 17 β estradiolo (E2). Tale rapporto veniva completamente normalizzato dal trattamento sostitutivo con T. Al contrario il trattamento con INT-747 normalizzava i livelli di E2 ma non quelli di T (Fig. 9a). Il rapporto tra T/E2 era, pertanto, completamente normalizzato dal trattamento con T ma non da quello con INT-747 (Fig. 9b). La quantità di grasso visceral era negativamente e significativamente associata ai livelli plasmatici di T (r=-0.317, N=119, P<0.0001, non mostrato), T/E2 ratio (r=-0.277, n=116, P<0.01, Fig. 9c), e positivamente con i livelli di E2 (r=0.256, n=116, P<0.01, non mostrato). E’ interessante notare come il rapporto T/E2 sia negativamente e significativamente associato con l’espressione genica di tutti i marcatori di fibrosi (Fig. 9d–i) e con molti di quelli correlati all’infiammazione (Tabella 2).
Nel loro complesso questi dati pre-clinici evidenziano un ruolo protettivo, anti-infiammatorio, anti-fibrotico e anti-ipossico sulla prostata del trattamento sostitutivo con testosterone in un modello di sindrome metabolica.
La infiammazione, fibrosi e ipossia sono considerati processi patologici strettamente interconnessi fra di loro. In aggiunta la loro concomitante presenza nella ghiandola prostatica caratterizza il passaggio da prostatite a sviluppo del BPH (Fibbi et al., 2010).
La sindrome metabolica, pertanto, appare essere strettamente correlata allo sviluppo del LUTS/BPH. Un fattore a comune tra queste due condizioni cliniche è rappresentato dal deficit di testosterone, altrimenti chiamato ipogonadismo (Cohen 2009; Corona et al., 2009). Infatti, se è ormai da tempo dimostrato che l’ipogonadismo può essere considerato una caratteristica clinica tipica della
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sindrome metabolica, solo recentemente se ne è evidenziata un’associazione anche tra ipogonadismo e LUTS/BPH. Alcuni studi clinici prospettici (Kristal et al.2008; Trifiro et al,2010) e cross-sectional (Schatzl et al. 2000; Tan et al.2003; Roberts et al. 2004; Miwa et al. 2008; St Sauver et al. 2011) hanno dimostrato che esiste un’associazione inversa tra livelli di testosterone sierici e la presenza di LUTS/BPH. Il trattamento sostitutivo con testosterone dell’ipogonadismo nei pazienti con sindrome metabolica è stato dimostrato migliorare molti parametri glicometabolici tra cui: l’iperglicemia, la ridotta tolleranza ai glicidi, adiposità viscerale e l’ipertensione (Corona et al., 2011). Una delle reticenze mediche più forti all’utilizzo del testosterone come terapia sostitutiva è sicuramente la paura di un possibile effetto negativo sul tessuto prostatico, dovuto al fatto che il testosterone è conosciuto come ormone responsabile dello sviluppo ed accrescimento della ghiandola prostatica. Studi clinici hanno invece, dimostrato che la terapia sostitutiva con testosterone nei soggetti ipogonadici con LUTS/BPH con MetS (Haider et al. 2009) e senza sindrome metabolica (Shigehara et al., 2011; Amano et al.,2010) portava ad un miglioramento del quadro sintomatologico dei LUTS.
In accordo con questi dati clinici, come riportato nel paragrafo precedente, nel nostro modello sperimentale di sindrome metabolica il trattamento sostitutivo con testosterone, oltre a migliorare molti parametri della sindrome metabolica (quali l’iperglicemia, l’obesità viscerale, l’ipertensione arteriosa) preveniva completamente lo sviluppo di infiammazione prostatica, riducendo l’espressione genica e proteica di tutti i marcatori flogistici, fibrotici e di ipossia studiati. Questi dati preclinici indicano che il trattamento sostitutivo con testosterone riduce la flogosi prostatica associata
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a sindrome metabolica, rappresentando un’opzione terapeutica per ridurre il rischio di sviluppo e progressione del BPH.
Figura 9 r= - 0.277 p<0.003 r= - 0.59 p<0.001 T G F β m R N A r= - 0.32 p<0.05 R h o A m R N A r= - 0.52 p<0.001 α S M A m R N A S M 2 2 α m R N A r= - 0.55 p<0.001 R O C K 1 m R N A r= - 0.38 p<0.001 R O C K 2 m R N A Control HFD HFD +T HFD INT-747 Control HFD HFD +T HFD INT-747 a. b. 0 50 100 150 200 250 300 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 1 7 -e st ra d io l (p m o l/ L ) T /E r a ti o * * *° * ° ° d. e. f. g. h. i. c. Figure 10 r= - 0.45 p<0.001
Figura 9. Valori sierici di 17β estradiolo (E2) (pannello a) e rapporto T/E2 (pannello b) nei diversi gruppi sperimentali. Correlazione tra T/E2 e massa grassa viscerale (pannello c), espressione genica dei diversi marcatori di fibrosi (pannelli da d-i) nei diversi gruppi sperimentali.
18 Table 2. Associazione tra rapporto T/E2 (espresso come rapporto logT/logE) e l’espressione
genica dei marcatori infiammatori.
r N P TLR2 -0.47 47 0.001* TLR4 -0.52 48 0.000* CD4 -0.56 42 0.000* CD8 -0.63 42 0.000* LACTF -0.53 42 0.000* STAMP2 -0.32 42 0.038* RAGE -0.71 42 0.000* COX2 -0.48 48 0.001* IL-8 -0.34 47 0.018* IL1β -0.36 47 0.012* TNFα -0.26 46 0.079 IL-6 -0.41 48 0.004* T-bet -0.52 38 0.001* GATA3 -0.42 38 0.009* RORγt -0.17 38 0.317
Correlazioni (r) ed il livello di significatività (P) sono derivati da analisi univariata. N indicano il numero dei campioni. Gli asterischi indicano la significatività statistica.
19 SCOPO della TESI
Lo scopo di questa tesi è stato quello di progettare uno studio clinico che, partendo dai risultati del lavoro preclinico precedentemente descritto, permettesse di valutare gli effetti della terapia sostitutiva con testosterone sulla prostata.
A tal fine la candidata ha elaborato un primo studio clinico retrospettivo nel quale sono stati analizzati i preparati anatomo-patologici dei campioni di prostata derivati da prostatectomie semplici per BPH di una serie consecutiva di pazienti afferenti all’unità di Urologia
dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Careggi-Firenze. Le caratteristiche istologiche degli infiltrati infiammatori prostatici sono state correlate con i parametri della sindrome
metabolica secondo la definizione NCEP-ATPIII.
La candidata, infine, ha disegnato e redatto uno studio clinico di fase IV, in doppio cieco, randomizzato e controllato verso placebo per valutare il ruolo della terapia sostitutiva con testosterone sulla flogosi prostatica nei pazienti ipogonadici affetti da sindrome metabolica e BPH.
20 Ruolo della sindrome metabolica sulla ghiandola prostatica: uno studio retrospettivo
nei pazienti affetti da sindrome metabolica e BPH.
Come riassunto nel paragrafo precedente, dati preclinici compiuti dal nostro gruppo di ricerca evidenziano che in un modello sperimentale di sindrome metabolica si ha lo sviluppo di una marcata infiammazione prostatica. Abbiamo, pertanto, deciso di iniziare uno studio clinico retrospettivo per valutare la possibile associazione tra sindrome metabolica e le caratteristiche istologiche del filtrato infiammatorio nei campioni di prostate derivate da intervento di prostatectomia semplice per BPH. Pertanto abbiamo preso in considerazione una serie consecutiva, non-selezionata, di 70
pazienti (età media 79.6±7.6) sottoposti a prostatectomia semplice per BPH. Tutti i campioni operatori sono stati pesati ed analizzati in cieco da due anatomi patologi che hanno classificato il processo infiammatorio prostatico in base alla modalità seguente: grado (lieve, moderato, severo), estensione (focale [10%], multifocale [10-50%], diffusa [>50%]) e sfaldamento ghiandolare (presente or assente). I pazienti con un quadro infiammatorio prostatico moderato-severo (grado ≥ moderato o estensione >10% o presenza di sfaldamento ghiandolare) sono stati paragonati al resto del campione. Sono stati valutati anche I parametri della sindrome metabolica definita con i criteri del National Cholesterol Education Program-Third Adult Treatment Panel (NCEP-ATPIII). Secondo la classificazione dell’NCEP-ATPIII (Alberti et al., 2009) la diagnosi di sindrome metabolica prevede la presenza di tre o più dei seguenti fattori di rischio cardio-metabolici: l’obesità viscerale (Circonferenza vita>102cm), l’ipertensione (pressione arteriosa≥130/85 o trattamento specifico), l’ipetrigliceridemia (trigliceridi≥150 mg/dL o trattamento specifico), ridotti livelli di
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HDL (≤40mg/dL o trattamento specifico), la iperglicemia a digiuno (glicemia a digiuno≥110 mg/dl o trattamento specifico).
Tra i 70 pazienti in studio, l’ipertensione, il diabete mellito e la dislipidemia erano presenti nel 49.6% (n=35), nel 17.3% (n=12) e nel 12.2% (n=9), rispettivamente mentre la diagnosi di sindrome metabolica definita con criteri NCEP-ATPIII era presente nel 33.5% dei casi (n=23).
L’analisi anatomo-patologica post-intervento ha evidenziato la presenza di una infiammazione moderata-severa in 56 pazienti (60%). La presenza di sindrome metabolica aumentava il rischio di infiammazione prostatica moderata-severa anche dopo aggiustamento per età (HR=3.153[1.001-9.936]; p=0.05, vedi Figura 10). In particolare, tra i fattori della classificazione NCEP-ATPIII I ridotti livelli di HDL ed elevati valori di trigliceridi risultavano essere i predittori più importanti di infiammazione prostatica (HR= 3.706[1.232-11.153]; p=0.02 e 3.348[1.187-9.443]; p=0.022, rispettivamente). Risultati simili sono stati osservati anche dopo aver corretto l’analisi escludendo i pazienti con diabete mellito che rappresenta uno stato di infiammazione cronica (HR= 4.678[1.118-19.567], p=0.035; 4.543[1.287-16.034], p=0.016 e3.644[1.178-11.269], p=0.025; rispettivamente per ridotti livelli di HDL ed elevati valori di trigliceridi).
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Figura 10.
In conclusione, questo studio retrospettivo ha permesso di dimostrare come bassi livelli di HDL possano essere significativamente correlati alla gravità ed estensione del processo flogistico prostatico nel tessuto adematoso. Tali caratteristiche della flogosi prostatica sono correlate anche con il peso dell’adenoma al momento dell’intervento chirurgico.
Tra i parametri della sindrome metabolica, inoltre, sia i ridotti livelli di HDL e gli aumentati valori di trigliceridi rappresentano dei fattori di rischio indipendenti per lo sviluppo della infiammazione prostatica, rafforzando il concetto che la sindrome metabolica e la prostatite sono due entità patologiche fortemente connesse tra di loro.
23 Ruolo della sindrome metabolica e della terapia sostitutiva con testosterone sulla
ghiandola prostatica: ideazione e disegno di uno studio clinico randomizzato, doppio cieco, controllato contro placebo.
Razionale
Come riportato nei paragrafi precedenti, dDati preclinici compiuti dal nostro gruppo di ricerca evidenziano che in un modello sperimentale di sindrome metabolica si ha l’insorgenza di una marcata infiammazione prostatica che viene prevenuta dal trattamento sostitutivo con testosterone (Vignozzi et al., 2011b). Dati preliminari da studi clinici retrospettivi hanno evidenziato che la sindrome metabolica correla significativamente con le caratteristiche istologiche dell’infiammazione prostatica. Studi clinici pilota hanno riportato che il trattamento sostitutivo con testosterone riduce i sintomi del basso tratto urinario (LUTS) associati a BPH.
Al fine di valutare con esattezza l’efficacia del trattamento sostitutivo con testosterone nel ridurre la flogosi prostatica, abbiamo deciso di disegnare uno studio d’intervento nei pazienti ipogonadici affetti da sindrome metabolica e BPH che sono candidati all’intervento di prostatectomia semplice.
Lo studio è disegnato come doppio cieco, randomizzato controllato vs placebo e verrà realizzato con una stretta collaborazione tra la SODc di Medicina della Sessualità e Andrologia, la SOD di Urologia e la SOD di Anatomia patologica della AOU Careggi, Firenze. Lo studio prevede l’arruolamento 120 soggetti maschi adulti affetti sia da BPH con indicazione all’intervento chirurgico di prostatectomia semplice che da sindrome metabolica (MetS).
La diagnosi di MetS verrà effettuata secondo i criteri diagnostici della National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III (NCEP-ATPIII) e definita per
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la presenza di tre o più dei seguenti parametri: obesità viscerale (circonferenza vita > or =102 cm), glicemia a digiuno (> or =110 mg/dL) o diabete; elevati trigliceridi (> or =150 mg/dL) o trattamento, elevati livelli di pressione arteriosa (BP > or = 130/85 mm Hg) o trattamento farmacologico e ridotti livelli di HDL colesterolo (< or =40 mg/dL) o trattamento.
I pazienti verranno valutati per la presenza di ipogonadismo, definito per livelli di testosterone totale < 12 nmol/l o testosterone libero < 225 pmol/L (calcolato secondo la formula di Vermeulen) .
La durata dello studio è di sei mesi, ossia corrispondente al tempo minimo di attesa per intervento chirurgico di prostatectomia semplice per BPH nella SOD di Urologia che individuerà i pazienti eligibili.
L’utilizzo del placebo è ritenuto scevro da possibili danni al paziente in ragione del fatto che il trattamento sostitutivo con testosterone nei pazienti ipogonadici è un trattamento personalizzato e raccomandato solo in presenza di sintomatologia,e quindi non per il semplice rilievo di bassi livelli di testosterone sierici (Bhasin et al., 2010).
I sintomi di prostatite e del basso tratto urinario verranno valutati sia con scores clinici (valutazione dei sintomi specifici di prostatite tramite questionario National Institute of Health Chronic Prostatitis Symptom Index , NIH-CPSI e valutazione dei sintomi di LUTS tramite questionario International Prostate Symptom Scor , IPSS), ultrasonografici (valutazione con ecografia trans rettale dei marcatori di flogosi prostatica (macrocalcificazioni, disomogenieità etc), biochimici (valutazione delle citochine infiammatorie nel liquido seminale) ed istologici (analisi istomorfometrica ed immunoistochimica dei campioni di prostata derivati dai pazienti arruolati nello
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studio trattati o no con testosterone. Parallelamente ad i sintomi e segni clinici di prostatite e LUTS verrà valutata anche l’effetto della terapia con testosterone o placebo sulla funzione sessuale (parametro androgeno-dipendente), come indicatore biologico di risposta alla terapia.
Il questionario NIH-CPSI è un sistema di punteggio validato, anche nella sua versione italiana (Giubilei et al., 2005)per valutare tre domini distinti: il dolore, i sintomi urinari e l’impatto della qualità di vita. I sintomi del paziente sono valutati per un totale di 43 punti (dolore 21, sintomi urinari 10 e impatto sulla qualità di vita 12). Il questionario verrà riempito direttamente dal paziente ma il punteggio verrà calcolato direttamente dal medico esaminatore. In base al punteggio di questo questionario la severità della prostatite cronica può essere così distinta in lieve (0-14 punti), moderata (15-29) o severa (>30).
L’ International Prostate Symptom Score (IPSS) è stato raccomandato per una valutazione iniziale soggettiva della gravità del LUTS/BPH. IPSS valuta differenti componenti dei LUTS: sintomi irritativi ed ostruttivi ( “total IPSS”: 0-35) e la qualità di vita (“bother IPSS”: 0-5).
L’Indice Internazione della funzione erettile (International Index of Erectile Function-5, IIEF-5) permette di dare un punteggio da 0 a 5 della funzione erettile attribuendo 5 alla funzione erettile migliore. I punteggi possibili vanno da 1 a 25, con un cut-off di 21 per distinguere le disfunzioni erettili (punteggio <21).
Obiettivi dello studio
Abbiamo identificato i seguenti obiettivi che abbiamo classificato come primari, secondari ed esploratori:
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Obiettivo primario • Valutazione nei pazienti ipogonadici affetti sia da BPH che sindrome metabolica (MetS) dell’efficacia del trattamento con testosterone comparato con placebo e dalla visita 1 alla 3 nel migliorare i sintomi di prostatite (utilizzando il questionario NIH-CPSI, National Institute of Health Chronic Prostatitis Symptom Index) ed i sintomi di LUTS (utilizzando il questionario IPSS, International Prostate Symptom Score) associati a BPH.
Obiettivi secondari • Valutazione nei pazienti ipogonadici affetti sia da BPH che sindrome metabolica (MetS) dell’efficacia del trattamento con testosterone comparato con placebo e dalla visita 1 alla 3 nel migliorare:
1- le caratteristiche ultrasonografiche tipiche del processo prostatitico (presenza di macro-calcificazioni, aumento del volume della ghiandola prostatica) ;
2- l’infiammazione prostatica all’analisi immunoistologica e di espressione genica dei marcatori infiammatori sul tessuto prostatico ottenuto dai campioni chirurgici di prostatectomia
3- i parametri metabolici (glicemia, insuline mia, colesterolo totale, colesterolo HDL,trigliceridi, emoglobina glicata, pressione arteriosa, circonferenza vita, indice di massa corporea)
4- i livelli seminali della chemochina infiammatoria IL-8 (considerato un marker biochimico surrogato di prostatite)
5- la funzione sessuale valutata con questionario International Index of Erectile Function-5 (IIEF-5).
Obiettivi esploratori: Valutazione nei pazienti ipogonadici affetti sia da BPH che sindrome metabolica (MetS) dell’efficacia del trattamento con testosterone comparato con placebo e dalla visita 1 alla visita 3
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1- i marcatori infiammatori plasmatici (PCR, VES)
2- la riduzione della secrezione di citochine infiammatorie(basale e indotta dalla stimolazione con agenti infiammatori ad ex. TNF alpha, o dalla co-coltura con cloni di linfociti T-helper) nelle colture di cellule stromali prostatiche isolate dai campioni chirurgici di almeno 10 pazienti per braccio di trattamento
Endpoint
Abbiamo, pertanto, identificato i seguenti endpoints che abbiamo classificato come primari, secondari ed esploratori:
Endpoint primario: Un significativo miglioramento di almeno due sui tre questionari sopraelencati, precisamente; NHI-CPSI, “total IPSS” e “bother IPSS” verrà considerato l’endpoint primario. Un miglioramento significativo del punteggio NIH-CPSI verrà definito per la riduzione di 2 o più punti. Un miglioramento significativo del punteggio “total IPSS” verrà definito per la riduzione di 3 o più punti. Un miglioramento significativo del punteggio “bother IPSS” verrà definito per la riduzione di 1 o più punti.
Endpoint secondari:
- Riduzione statisticamente significativa del numero e/o dimensioni delle calcificazion
i intraprostatiche nel gruppo trattato con testosterone vs. placebo
- Riduzione statisticamente significativa dell’infiammazione prostatica all’analisi
immunoistologica e di espressione genica dei marcatori infiammatori sul tessuto prostatico nel gruppo trattato con testosterone vs. placebo
- Miglioramento significativo dei parametri metabolici (glicemia, insuline mia,
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arteriosa, circonferenza vita, indice di massa corporea) nel gruppo trattato con testosterone vs. placebo
- Riduzione statisticamente significativa dei livelli seminali della chemochina
infiammatoria IL-8 (considerato un marker biochimico surrogato di prostatite) nel gruppo trattato con testosterone vs. placebo
- Miglioramento significativo della funzione sessuale valutata con questionario
International Index of Erectile Function-5 (IIEF-5 ) nel gruppo trattato con testosterone vs. placebo
Endpoint degli obiettivi esploratori
• Riduzione statisticamente significativa dei marcatori infiammatori plasmatici (PCR, VES)
- Riduzione statisticamente significativa della secrezione di citochine
infiammatorie(basale e indotta dalla stimolazione con agenti infiammatori ad ex. TNF alpha, o dalla co-coltura con cloni di linfociti T-helper) nelle colture di cellule stromali prostatiche isolate dai campioni chirurgici del gruppo trattato con testosterone vs. placebo
Disegno dello studio.
Avendo identificato i suddetti obiettivi e volendo raggiungere i sopraelencati endpoints, abbiamo disegnato lo studio di sperimentazione clinica come uno studio di fase IV, doppio cieco, randomizzato e controllato contro placebo, come segue:
-Alla visita 1 (tempo 0).
A tutti i pazienti reclutati verrà effettuato un esame fisico (peso, altezza, circonferenza vita, pressione arteriosa) e verrà effettuato un prelievo ematico per il dosaggio dei seguenti indici ormonali (testosterone, estradiolo, sex hormone binding globulin,
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SHBG), metabolici (glicemia, insulinemia, colesterolo totale, colesterolo HDL, trigliceridi, emoglobina glicata-HbA1c), prostatici (PSA), biochimici generali (emocromo) e infiammatori (PCR, VES).
Verranno somministrati anche i seguenti questionari: NIH-CPSI per valutare la presenza e severità della prostatite,l’ IPSS per valutare i sintomi di LUTS) e l’IIEF-5 per valutare la funzione erettile. L’IIEF-5 utilizzato come indicatore biologico di una buona risposta alla terapia androgenica verrà riempito dal paziente, chiuso in busta e letto dall’esaminatore solo alla fine dello studio per mantenere in cieco le procedure. Verrà effettuata anche un’ ecografia trans rettale con metodica color-doppler (Lotti et al.,2011) Dopo effettuata l’ecografia trans rettale verrà chiesto al paziente di effettuare una raccolta del liquido seminale per permetter il dosaggio dell’interleuchina-8 (marcatore biochimico di prostatite). Alla visita 1 I pazienti verranno divisi in ipogonadici e non ipogonadici in base ai livelli di testosterone totale < 12 nmol/l o testosterone libero < 225 pmol/L (calcolato secondo la formula di Vermeulen) . I pazienti non ipogonadici verranno considerati come gruppo di controllo. I pazienti ipogonadici verranno randomizzati in due gruppi di trattamento (TG) distinti: TG1: placebo; TG2: testosterone gel 2% (50mg/die). La randomizzazione sarà stratificata in base all’età < 45 anni vs. ≥ 45 anni.
-Alla visita 2 (tempo 12 settimane). Tutti I pazienti saranno ri-valutati per I seguenti indici PSA ed ematocrito per valutare l’eventuale comparsa di contro-indicazioni al trattamento con testosterone.
Un campione di sangue verrà, inoltre, conservato per il dosaggio del testosterone e SHBG che verrà effettuato alla fine dello studio in modo da mantenere in cieco le procedure sperimentali.
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-Alla visita 3 (visita finale, tempo 24 settimane). Alla ventiquattresima settimana dall’arruolamento tutti I pazienti verranno ri-valutati con un esame fisico (peso, altezza, circonferenza vita, pressione arteriosa). Verrà effettuato un prelievo ematico per il dosaggio dei seguenti indici ormonali (testosterone, estradiolo, sex hormone binding globulin, SHBG), metabolici (glicemia, insulinemia, colesterolo totale, colesterolo HDL, trigliceridi, emoglobina glicata-HbA1c), prostatici (PSA), biochimici generali (emocromo) e infiammatori (PCR, VES).
Verranno somministrati anche i seguenti questionari: NIH-CPSI per valutare le variazioni di severità della prostatite,l’ IPSS per valutare le variazioni di grado dei LUTS e l’IIEF-5 per valutare la funzione erettile. Verrà effettuata anche un’ ecografia trans rettale con metodica color-doppler (Lotti et al.,2011) Dopo effettuata l’ecografia trans rettale verrà chiesto al paziente di effettuare una raccolta del liquido seminale per permettere il dosaggio dell’interleuchina-8 (marcatore biochimico di prostatite).
Un miglioramento significativo del punteggio NIH-CPSI verrà definito per la riduzione di 2 o più punti. Un miglioramento significativo del punteggio “total IPSS” verrà definito per la riduzione di 3 o più punti. Un miglioramento significativo del punteggio “bother IPSS” verrà definito per la riduzione di 1 o più punti.
In conclusione, i “ responders” saranno quei pazienti che mostreranno un significativo miglioramento di almeno due sui tre questionari sopraelencati, precisamente; NHI-CPSI, “total IPSS” e “bother IPSS”.
Immediatamente dopo la visita 3 il paziente verrà sottoposto all’intervento di prostatectomia semplice per BPH. Verranno utilizzati I campioni di prostate per gli
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esami istologici routinari. Un parte del campione verrà utilizzata 1-per analisi immunoistochimiche delle componenti flogistiche tissutali ed 2-una parte per l’analisi di espressione genica dei seguenti marcatori infiammatori (TLR2, TLR4, RAGE, COX2, IL-8, IL-6, TNFalpha, CD4, CD8, RORc, Tbet, GATA3) e di attivazione miofibroblastica (RhoA, ROCK1, ROCK2, alphaSMA, SM22-alpha, TGFbeta). Un campione di prostate verrà utilizzato anche per l’isolamento di cellule stromali (human benign prostatic hyperplasia stromal cells, hBPH) utilizzando una metodica già utilizzata dal nostro gruppo in precedenza (Penna et al., 2009) In tali colture cellulari ottenute da pazienti trattati con testosterone o placebo e da quelli non trattati verrà analizzata la secrezione basale delle seguenti citochine, chemochine e fattori di crescita tramite l’analisi con metodica Bio-Plex Pro™ Human Cytokine 27-Plex (Lédée et al. 2008). Verranno analizzate le seguenti citochine/chemochine:IL-1β, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IFN-α, TNF-α, G-CSF, GM-G-CSF, VEGF, PDGF, bFGF, IP-10, MCP-1, RANTES, eotaxin, MIP-1-alpha, e MIP-1-beta.
Popolazione in studio
Setting clinico: pazienti ambulatoriali e ricoverati che afferiscono ai centri clinici coinvolti per ipertrofia prostatica benigna (BPH) in lista di attesa per intervento chirurgico di prostatectomia semplice per BPH
Definizione della popolazione che sarà considerata eleggibile allo studio: Verranno considerati eleggibili soggetti maschi adulti affetti sia da BPH in lista di attesa per intervento chirurgico di prostatectomia semplice che da sindrome metabolica (MetS).
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La diagnosi di MetS verrà effettuata secondo i criteri diagnostici della National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III (NCEP-ATPIII) e definita per la presenza di tre o più dei seguenti parametri: obesità viscerale (circonferenza vita > or =102 cm), glicemia a digiuno (> or =110 mg/dL) o diabete; elevati trigliceridi (> or =150 mg/dL) o trattamento, elevati livelli di pressione arteriosa (BP > or = 130/85 mm Hg) o trattamento farmacologico e ridotti livelli di HDL colesterolo (< or =40 mg/dL) o trattamento.
- Criteri d’inclusione
1. Soggetti maschi adulti in lista di attesa per intervento di prostatectomia semplice per BPH
2. Diagnosi di sindrome metabolica (NCEP-ATPIII) definita per la presenza di tre o più dei seguenti parametri: obesità viscerale (circonferenza vita > or =102 cm), glicemia a digiuno (> or =110 mg/dL) o diabete; elevati trigliceridi (> or =150 mg/dL) o trattamento, elevati livelli di pressione arteriosa (BP > or = 130/85 mm Hg) o trattamento farmacologico e ridotti livelli di HDL colesterolo (< or =40 mg/dL) o trattamento.
3. .Diagnosi di prostatite cronica (CP/CPPS) definita per uno punteggio superiore a 15 al questionario NIH-CPSI
- Criteri d’esclusione
1. Età <18 anni;
2. Partecipazione ad altra sperimentazione clinica;
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4. Diagnosi pregressa, presenza o sospetto di neoplasia maligna della prostata o della mammella;
5. Valori di PSA >4ng/mL 6. Valori di ematocrito≥52%
7. Utilizzo di farmaci inibitori della 5alpha-reduttasi nei tre mesi precedenti;
8. Presenza di una seria patologia organica o mentale diagnosticata da uno specialista psichiatra (per esempio: depressione maggiore in trattamento farmacologico) sospettata sulla base della storia medica e/o sull’esame fisico del paziente
9. Sospetto di mancata compliance alla partecipazione allo studio;
10. Presenza di severa allergia o ipersensibilità al farmaco in studio (sostanza attiva o eccipienti della formulazione);
Piano statistico
Assumendo una probabilità di successo pari al 5 % nel gruppo trattato con placebo, lo studio richiede l’arruolamento di 86 pazienti con una rapporto di allocamento tra i gruppi di 1: 1 per ottenere una potenza dell’80% nel distinguere una differenza nella percentuale di successo tra i due gruppi di trattamento di almeno il 25%. Pertanto, la probabilità attesa di successo nel gruppo trattato in esame è uguale o superiore al 30%. per rilevare la presenza di eterogeneità verrà utilizzato il test statistico del chi-quadro a due code . Il livello di significatività è stato fissato al 5%.
I dati saranno espressi come medie± SD quando corrispondenti a dei parametri che presentano una distribuzione normale, mentre come mediane (quartile) per quelli che non non presentano una distribuzione normale. Differenze tra più di due gruppi saranno valutate con test one-way ANOVA o Kruskal–Wallis.
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Il test di Student a due code per dati non accoppiati sarà utilizzato per confrontare le medie dei parametri con distribuzione normale. In tutti gli altri casi verrà utilizzato Il test Mann– Whitney U. Possibili variazioni dei parametric tra l’endpoint (visita 3) e baseline (visita 1) verranno valutati con test T o Wilcoxon test per dati appaiati. Tutte le analisi statistiche saranno effettuate con il programma SPSS for Windows 17.0.
Tale studio è stato sottoposto alla valutazione del Comitato Etico dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Careggi, Firenze ed è stato presentato come progetto nell’ambito del Bando “Giovani Ricercatori” del Ministero della Salute (GR-2010-2315837; “Evaluation of the effect of testosterone replacement therapy (TRT) on prostatic gland in hypogonadal patients affected by benign prostatic hyperplasia (BPH) and metabolic syndrome (MetS).
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