Studio fitochimico e sistematico di Polygala flavescens DC (Polygalaceae), endemita italiano.

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DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica

Studio fitochimico e sistematico

Candidato:

David Dolci

Anno Accademico 2015/2016

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Specialistica in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

Tesi di Laurea

e sistematico di Polygala flavescens DC. (P

endemita italiano

Relator

Alessandra Braca

Lorenzo Peruzzi

Anno Accademico 2015/2016

in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

(Polygalaceae),

Relatori:

Alessandra Braca

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INDICE

Introduzione 1 Capitolo 1 - Botanica 2 1.1 La famiglia Polygalaceae 3 1.2 Il genere Polygala 5 1.3 Polygala flavescens 8

1.4 Usi medicinali del genere Polygala 11

Capitolo 2 - Fitochimica 13

2.1 Precedenti studi fitochimici 14

2.2 Xantoni 14

2.3 Benzofenoni 18

2.4 Flavonoidi 20

2.5 Saponine triterpenoidiche 22

2.6 Oligosaccaridi 29

2.7 Tabella dei composti 34

Capitolo 3 - Parte sperimentale 35

3.1 Raccolta in campo 36

3.2 Estrazione, ripartizione e separazione 38

3.2.1 Estrazione della droga 38

3.2.2 Ripartizione dell’estratto metanolico di PFF-T 40

3.3 Purificazione e isolamento 43

3.3.1 Analisi frazione IX 43

3.3.2 Analisi frazione X 45

3.3.3 Analisi frazione XI 47

3.3.4 Analisi frazione XII 49

3.3.5 Analisi frazione XIII 51

3.3.6 Analisi frazione XV 53

3.3.7 Analisi frazione XVI 55

3.3.8 Analisi frazione XVII 57

3.3.9 Analisi frazione XVIII 59

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3.4 Analisi dei composti volatili e non-volatili delle 5 popolazioni 63

3.4.1 Composti non volatili 63

3.4.2 Composti volatili 64

3.5 Citotassonomia 65

3.6 Misura dei caratteri morfologici 66

3.6.1 Misurazione degli exsiccata 66

3.6.2 Misurazione di frutti e semi 67

3.6.3 Misurazione del colore 68

Capitolo 4 - Risultati e discussione (Parte I) 85

4.1 Isolamento dei composti 86

4.2 Identificazione dei composti 87

4.3 Nuovi composti isolati 88

4.3.1 Composto 3 88 4.3.2 Composto 4 93 4.3.3 Composto 5 95 4.3.4 Composto 8 100 4.3.5 Composto 9 107 4.3.6 Composto 10 109 4.3.7 Composto 11 111

4.4 Composti isolati già descritti in letteratura 113

4.4.1 Composto 1 113

4.5 Analisi dei composti volatili e non-volatili delle 5 popolazioni 117

4.5.1 Composti non volatili 117

4.5.2 Composti volatili 118

Capitolo 5 - Risultati e discussione (Parte II) 126

5.1 Studio del caso tassonomico 127

5.2 Confronto tra i gruppi 128

5.3 Caratteri morfologici 129

5.3.1 Lunghezza ala 130

5.3.2 Larghezza ala 131

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5.3.4 Lunghezza bratteola 133 5.3.5 Larghezza bratteola 134 5.3.6 Lunghezza foglia 135 5.3.7 Larghezza foglia a ¼ 136 5.3.8 Larghezza foglia ½ 137 5.3.9 Larghezza foglia ¾ 138 5.3.10 Lunghezza fusto 139 5.3.11 Lunghezza capsula 140 5.3.12 Larghezza capsula 141 5.3.13 Lunghezza stipite 142 5.3.14 Superficie margine 143 5.3.15 Superficie capsula 144 5.3.16 Lunghezza seme 145 5.3.17 Larghezza seme 146 5.3.18 Lunghezza strofiolo 147

5.3.19 PCA dei caratteri morfologici 148

5.4 Caratteri colorimetrici 149

5.4.1 Ala gradazione di rosso 150

5.4.2 Ala gradazione di verdre 151

5.4.3 Ala gradazione di blu 152

5.4.4 Frangia gradazione di rosso 153

5.4.5 Frangia gradazione di verdre 154

5.4.6 Frangia gradazione di blu 155

5.4.7 Tubo gradazione di rosso 156

5.4.8 Tubo gradazione di verdre 157

5.4.9 Tubo gradazione di blu 158

5.4.10 PCA dei caratteri colorimetrici 159

5.5 Metaboliti secondari volatili 160

5.5.1 PCA dei metaboliti secondari volatili del fiore 161

5.5.2 PCA dei metaboliti secondari volatili delle foglie 162

5.5.3 PCA dei metaboliti secondari volatili dei frutti 163

5.5.4 PCA dei metaboliti secondari volatili dei semi 164

5.5.5 PCA dei metaboliti secondari volatili totali 165

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5.6 Metaboliti secondari non-volatili 167

5.6.1 PCA dei metaboliti secondari non volatili 168

5.7 Citotassonomia 170

5.7.1 Cariologia di Polygala flavescens 170

Capitolo 6 - Materiali e metodi 173

6.1 Metodi cromatografici 173

6.1.1 Cromatografia su strato sottile 173

6.1.2 Cromatografia ad esclusione molecolare 173

6.1.3 Cromatografia liquida ad alta prestazione 174

6.1.4 Gas cromatografia associata alla spettrometria di massa 175 6.1.5 Cromatografia liquida associata alla spettrometria di massa 175

6.2 Metodi spettroscopici e spettrometrici 176

6.2.1 Potere ottico rotatorio 176

6.2.2 Spettri UV 176

6.2.3 Spettri di risonanza magnetica nucleare 176

6.2.4 Spettri ESI-MS 177 6.2.5 Spettri HRESIMS 177 6.3 Metodi morfometrici 178 6.3.1 Erborizzazione 178 6.3.2 Acquisizione digitale 178 6.3.3 Misurazione e analisi 178 6.4 Metodi citologici 179 6.4.1 Incubazione 179 6.4.2 Microscopia ottica 179

6.4.3 Pretrattamento con colchicina e colorazione al Feulgen 180

6.5 Metodi statistici 181

Conclusioni 183

Bibliografia 187

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INTRODUZIONE

Polygala è un genere fonte di numerosi rimedi impiegati nella medicina tradizionale erboristica di tutti i continenti, eccetto l’Oceania. Molte specie sono utilizzate come anestetici, agenti antiinfiammatori, per il trattamento di disturbi intestinali, epatici e del sistema nervoso centrale (SNC) (De Campos et al., 1997; Pinheiro et al., 1998; El Sayah et al., 1999) (Weinhold et al., 2008; Klein et al., 2012). Due di esse sono divenute di uso consolidato, Polygala senega L. e Polygala tenuifolia Willd., come espettoranti in grado di fluidificare le secrezioni polmonari e favorire l’espettorazione (Schilcher, 1992; Tang e Eisenbrand, 1992). La letteratura recente riporta numerosi studi volti ad indagare eventuali attività farmacologiche nelle specie di Polygala. Molti di questi hanno evidenziato attività interessanti e conseguentemente l’interesse per la famiglia delle Polygalaceae è aumentata, soprattutto a causa della sua potenziale importanza medicinale, che non è stata ancora del tutto esplorata (Klein et al., 2012). Essendo il genere Polygala un’importante fonte di piante medicinali è stato deciso di studiare approfonditamente il gruppo di Polygala flavescens, la polygala gialla italiana (entità endemica presente esclusivamente nell’Italia peninsulare (Peruzzi et al., 2014). Il gruppo di Polygala flavescens è costituito da tre entità simili, descritte sommariamente sulla base di osservazioni qualitative. Attualmente queste tre entità sono riconosciute a livello di sottospecie (Arrigoni, 2014).

Lo scopo del presente lavoro di tesi sperimentale è lo studio fitochimico e sistematico del gruppo di Polygala flavescens, finalizzato a chiarire le relazioni che intercorrono tra le entità appartenenti al gruppo, oltre che la chimica di queste piante. Uno studio fitochimico si compone di tre parti principali: l’estrazione del materiale vegetale, la separazione delle sostanze presenti negli estratti e la caratterizzazione spettroscopica delle sostanze pure isolate. Seguendo questo schema concettuale si cerca di ottenere nuove sostanze di potenziale interesse. In uno studio sistematico si realizza la comparazione delle entità appartenenti al gruppo oggetto di analisi, con la finalità di chiarire le relazioni che intercorrono tra loro. La comparazione consiste nel confronto di opportuni caratteri, stabiliti all’inizio del lavoro. Uno studio sistematico si articola di due fasi principali: rilievo dei caratteri (quali ad es. morfologia, sequenze di DNA, metaboliti secondari e molti altri ancora) e analisi dei dati. Durante il rilievo si cerca di misurare/osservare/quantificare nel modo più accurato possibile i caratteri in tutte le entità del gruppo, considerando più popolazioni e individui possibile. Durante l’analisi dei dati, utilizzando tutti i caratteri disponibili, si cerca di evidenziare eventuali similitudini/differenze tra le varie entità.