Lez.3 Studio proteoma

Tecnica analitica capace di misurare una

proprietà intrinseca della materia tutta:

La massa di una molecola è dettata dalla sua

struttura in termini di componenti atomici

ed è specifica per ogni specie molecolare (a

meno di situazioni di isobaria e/o isomeria

strutturale)

La conoscenza della massa

esatta ed accurata di un

composto

ne

consente

•

•

Informazioni qualitative

Informazioni qualitative

– Struttura di specie molecolari complesse

– Composizione di una miscela

– Purezza di un picco cromatografico

– Identificazione di una specie

•

•

Informazioni quantitative

Informazioni quantitative

– Abbondanza dei componenti di una miscela

(relativa ed assoluta)

Informazioni deducibili

dall’analisi MS.





Studio della struttura

Studio della struttura



Informazioni addizionali per determinare la

struttura di un composto





Rivelazione selettiva di uno ione

Rivelazione selettiva di uno ione



Drastica riduzione delle interferenze



Esperimenti SRM e MRM, PIS e Neutral loss

Informazioni analitiche deducibili dalla MSMS

(Tandem mass spectrometry)

1. Analisi di struttura delle proteine

Verifica di sequenza amminoacidica di proteine ricombinanti ;

caratterizzazione di varianti genetiche; identificazione di

sostituzioni amminoacidiche.

2.

Identificazione

di

modifiche

post-traduzionali (PTM)

Assegnazione del sito e della natura delle PTM.

3. Identificazione di proteine sconosciute

Coinvolte in meccanismi patologici o presenti in specifici tessuti o cellule;

Nell’ambito di investigazioni scientifiche;

Le operazioni svolte in generale da uno

spettrometro massa sono:

1.

Creare ioni in fase gassosa (in

Sorgente).

2.

Separare gli ioni nello spazio o nel

tempo sulla base del loro rapporto m/z

(nell’Analizzatore).

3.

Rivelare e misurare la quantità di ioni

per ciascun rapporto m/z (nel

Rivelatore).

Uno spettrometro di massa è uno strumento che produce ioni in fase

gassosa e li separa in funzione del loro rapporto

massa-carica (m/z).

Esso è essenzialmente costituito da una

sorgente

, un

analizzatore

ed un

rivelatore

.

m/z

Schematic mass spectrometer

Inlet Ionization

Mass Analyzer

Mass Sorting (filtering)

Ion Detector Detection Ion Source • Solid • Liquid • Vapor Detect ions Form ions

(charged molecules) Sort Ions by Mass (m/z)

1330 1340 1350 100 75 50 25 0 Mass Spectrum General operation of MS Create gas-phase ions

Separate ions in time or space by their m/z ratio

Numero di Massa A = Massa Nominale

Isotopi

1

_{H = 99,985}

_{H = 0,015}

3

_{H radioattivo e decade velocemente}

Abbondanze isotopi

•

Unità di massa

Dalton

==>1 u.m.a. = 1 Da

1 u.m.a. (Dalton) = 1/12 della massa del

_{C (1.9926786 x 10}

_g)

1 u.m.a. = 1 Da=1.9926786 x 10

_{/12 = 1.6605555663 x 10}

_g

•

Massa nominale

Massa Intera

(e quindi approssimata) degli isotopi più abbondanti

CH

Br: 12 + 3 x 1 + 79 = 94 Da

•

Massa monoisotopica

Massa Esatta

degli isotopi più abbondanti

CH

Br: (12.00 + 3x 1.007825 + 78.918336) = 93.941011 Da

•

Massa media

(

average mass, av

):

calcolata tenendo in considerazione l’abbondanza

relativa dei diversi isotopi

CH

Br: 12.01115 + 3 x 1.00797 + 79.904 = 94.93906 Da

(r = -NH-CH-CO-)

H₂O 18 18.0122 18.0150

Mass values of Amino acid residues

Additional moieties Nominal mass Monoisotopic mass Average mass

r 0 56 56.0128. 56.0044 G +1 57 57.0215 57.0519 A + 15 71 71.0371 71.0788 S +14 +17 87 87.0320 87.0782 P +42 –1 97 97.0528 97.1167 V +43 99 99.0684 99.1326 T +28+17 101 101.0477 101.1051 C +14+33 103 103.0092 103.1388 I +57 113 113.0841 113.1594 L +57 113 113.0841 113.1594 N +14+28+16 114 114.0429 114.1038 D +14+28+17 115 115.0269 115.0886 Q +28+28+16 128 128.0586 128.1307 K +56+16 128 128.0950 128.1741 E +28+28+17 129 129.0426 129.1155 M 28+32+15 131 131.0405 131.1926 H +14+67 137 137.0589 137.1411 F +91 147 147.0684 147.1766 R +42+58 156 156.1011 156.1875 Y +90+17 163 163.0633 163.1760 W +14 + 116 186 186.0793 186.2133

Isobaric peptides

LFGGY

YGGFL

SEQUENCING

78 79 80 78.6

Bassa Risoluzione Massa Molecolare Media

Alta Risoluzione Massa Molecolare

Monoisotopica

Monoisotopic mass

corresponds to

lowest mass peak

When the isotopes are clearly resolved the monoisotopic mass is the

most accurate measurement

Mass spectrum of peptide with 94 C-atoms

(19 amino acid residues)

1981.84

1982.84

1983.84

No

C atoms (all

C)

One

C atom

Two

C atoms

“Monoisotopic mass”

When the isotopes are not resolved, the centroid of the envelope corresponds to

the weighted average of all the isotope peaks in the cluster, which is the same

as the average or chemical mass

Average mass corresponds to the

centroid of the unresolved peak

cluster

Distribuzione isotopica calcolata

(spettro simulato)

Angiotensina II (un

peptide)

β2-Microglobulina

(una proteina)

M

-M

= 0.67Da

M

-M

= 7.44Da

Fattori importanti per le performance della MS

Resolution

:

How well separated are the peaks from each

other?

Mass accuracy

: How accurate is the mass measurement?

Sensitivity

:

How is the smallest sample amount

analyzable?

La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente

espressa dalla risoluzione R

definita come:

R = m/_m

dove _

m

è la differenza di massa

tra due

picchi adiacenti risolti

e

m

è la massa

nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi).

Calcolo della Risoluzione

Uno spettrometro con una risoluzione

di 4000 risolverà due picchi con valori

di

m/z di 4000 e 4001 oppure di

400,0 e 400,1 ecc.

Picchi risolti al

10% della valle

Picchi risolti al

80% della valle

Intensit

à

ALTA RISOLUZIONE

Due picchi sono considerati risolti se

l’altezza della valle tra di essi è inferiore

al 10% dell’altezza del picco meno

intenso.

BASSA RISOLUZIONE

Mass spectrum of a 50 carbon atom compound

Elemental Composition: C H N O

6130 6140 6150 6160 6170

Poorer

resolution

Better resolution

Mass

What if the resolution is not so good?

Mass accuracy is the difference observed between

the theoretical mass and the measured mass

Mass accuracy is the difference observed between the theoretical mass

and the measured mass (m

– m

) and constitutes the error on the

mass measurement

Mass accuracy is often expressed in parts per million (ppm) = !m accuracy

/ m

* 10

i.e.: theoretical mass: 1000, measured mass: 999.9

Mass accuracy depends on resolution

Accuracy=ΔM/M i.e. 1/Resolution

0 2000 4000 6000 8000 Counts 2840 2845 2850 2855 Mass (m/z) Resolution = 14200 Resolution = 4500 Resolution =18100 15 ppm error 24 ppm error 55 ppm error

0 8000 Counts 2840 2845 2850 2855 Mass (m/z) Theoretical MW Experimental MW

Before Calibration

Low Accuracy, High Precision

0 8000

2840 2845 2850 2855

Mass (m/z)

After Calibration



All Mass Spectrometers MUST BE CALIBRATED. This adjust parameters in the mass

assignment of the ions.



In general, the closer calibration in space and time is the more accurate calibration. LOCK

MASS



Default calibrations are usually set up on instruments for nominal mass accuracy.



Calibrations can be done with any compound with a known elemental formula

(standard).



The best calibration compounds are those chemically similar to the compounds to be

measured.



It is best to have calibration compounds with MW ranging above and below the compound

MS Source

MALDI

ElectroSpray

MS Analyzer

Quadrupole

Time of Flight

Ion Trap

Under

vacuum

Introduzione del Campione

• Introduzione diretta (gas, liquido, solido)

•Introduzione a seguito di pre-frazionamento



Gas Cromatografia (GC/MS)



Cromatografia Liquida (LC/MS e nanoLC/MS)



Per GC:

Ionizzazione elettronica (EI)

Ionizzazione chimica (CI)



Per LC:

Elettrospray – nanospray

APCI

(atmospheric pressure chemical

ionization)

APPI

(atmospheric pressure

photoionization)

Scelta del metodo di ionizzazione

Scelta del metodo di ionizzazione

1.

1.

Natura e stato fisico dell

Natura e stato fisico dell

’

’

analita

analita

2.

2.

Volatilit

Volatilit

à

à

e stabilit

e stabilit

à

à

termica

termica

3.

3.

Tipo di informazione da ottenere

Tipo di informazione da ottenere





Massa molecolare

Massa molecolare





Struttura molecolare

Struttura molecolare





Electron Ejection: M M

.

+ e

-

Protonation: M + H

MH



Multiple Protonation: M + nH

M(H

)



Cationization: M + nCat

M(Cat

)



Electron Capture: M + e

M

 Ionizzazione chimica

 Chemical Ionization (CI)

 Bombardamento con atomi veloci

 Fast Atom Bombardment (FAB)

 Ionizzazione termospray

 Thermospray Ionization (TSP)

 Ionizzazione elettrospray

 Electrospray Ionization (ESI)

 Ionizzazione chimica a pressione atmosferica

 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

 Desorbimento laser assistito da matrice

 Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

Hard Ionization:

• Ionizzazione elettronica

– Electron Ionization (EI)

“The Nobel Prize in Chemistry for 2002 is to be shared between scientists working on two very important methods of chemical analysis applied to biological macromolecules: Mass Spectrometry (MS) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Laureates John B. Fenn, Koichi Tanaka (MS) and Kurt Wüthrich (NMR) have pioneered the successful application of their techniques to biological macromolecules!

La spettrometria di massa in proteomica

La spettrometria di massa in proteomica

Ion

source

Mass



Solventi volatili



Alta temperatura



ddp



Flusso di gas (desolvatation gas)



Condizioni di vuoto

Electrospray Ionization (ESI)

Esplosione Coulombiana

Limite di Rayleigh:

Droplet formation Spray voltage too low

Jet Spray

Spray voltage too low

Perfect Plume Spray voltage is optimal

Split-Spray

Spray voltage too high

Influenza del voltaggio sullo spray

Una delle caratteristiche dell’ESI è la possibilità di generare ioni multicarica.

Per molti composti, il numero di cariche è proporzionale alla loro grandezza.

Inoltre, il numero di cariche assunte dalla molecola dipende sia dalla presenza di gruppi basici che dal pH del solvente.



Picchi m/z consecutivi in una Gaussiana differiscono per una carica.

Determinazione delle

incognite M e n

Quadrupole Mass

Analyzers

I quadrupoli sono molto piccoli, poco ingombranti

e poco costosi .

Forniscono una Risoluzione < 2000 ed il loro limite di m/z

analizzabile è < 4000.

+U +Vcos(ωt) -U -Vcos(ωt)

Per un dato valore dei potenziali, solo gli ioni con un singolo valore del rapporto m/z sono

stabilizzati e raggiungono il rivelatore.

La scansione di uno spettro nel tempo si ottiene facendo variare simultaneamente Vdc e Vac ,

+

+

–

–

+

SEZIONE trasversale del Quadrupolo

+

+

–

–

+

SEZIONE trasversale del Quadrupolo

+

+

–

–

SEZIONE trasversale del Quadrupolo

+

+

+

–

–

SEZIONE trasversale del Quadrupolo

+

+

–

–

+

SEZIONE trasversale del Quadrupolo

SEZIONE longitudinale del Quadrupolo

Movimento degli ioni nel campo elettrico quadrupolare Esempio di traiettoria instabile

SEZIONE longitudinale del Quadrupolo

Movimento degli ioni nel campo elettrico quadrupolare Esempio di traiettoria stabile

Trappola Ionica

Analizzatore a quadrupolo in cui i quattro elettrodi lineari sono

sostituiti da un elettrodo ad anello (ring) e due elettrodi a calotta

(end cups).

La traiettoria degli ioni all’interno della trappola viene stabilizzata

dai seguenti fattori:

a) Elio – diminuisce la loro energia cinetica

b) N° controllato di ioni – distorsione delle loro traiettorie in caso di

sovraccaricamento

Pictorial diagrams of the common trapping mass analyser

Ions in a quadrupole ion trap maintain stable trajectories inside

the device as a result of the application of a radio frequency

voltage to the ring electrode. Mass analysis is achieved by

making ion trajectories unstable in a mass-selective manner.

Radial Trapping Radial Trapping …simultaneously Ramp EXB Exit Lens with Grid Axial Trapping Axial Trapping

Quadrupolo in modalit

Quadrupolo in modalit

à

à

LIT

LIT

–

–

Linear Ion Trap

Linear Ion Trap

Su dei principi analoghi funzionano le trappole ioniche lineari (

LIT

)

Maggiore spazio dove intrappolare gli ioni =>Maggiore sensibilità



Estrema versatilità per l’analisi di molecole di diverse dimensioni

(anche molto grandi se poliprotonabili)



Elevata sensibilità



Nessuna interferenza dall’uso di matrici



Assenza di frammentazione in sorgente (ionizzazione soft)



Possibilità di accoppiamento con sistemi cromatografici (LC-MS)



Configurazione con sistemi per l’analisi tandem



Formazione di ioni multicarica misti con riduzione della sensibilità



Riduzione della sensibilità in presenza di sali o additivi



Difficoltà nell’analisi diretta di miscela complesse

Vantaggi

ESI SPECTRA OF TWO PROTEINS MIXTURE

M

= 10,000 Da

M

= 22,000 Da

m/z

M

+ 5H

Analisi di proteine intatte

Determinazione del peso molecolare accurato

di proteine intatte mediante spettrometria di

Analysis of

Intact Proteins

The accurate

molecular mass

of an intact

proteins contains

a wealth of

information

IT’S PURE BOSS….!

HAVE YOU RUN AN SDS-PAGE?

ONLY ONE BAND ON SDS-PAGE, BOSS….

…

HAVE YOU RUN A MASS SPEC?

Analysis of recombinant human bFGF

HPLC: single symmetric peak

Mass A: 17122.9±0.6 Mass B: 17051.9±0.9

ESMS analysis showed two components none of which exhibited the expected MW

Expexcted Mass Value: 17253.8

Measured Mass Values: 17122.9±0.6

17051.9±0.9

Δm1=-130.9 Da =

Met

Δm2= -71.0 Da =

Ala

Determination of accurate MW of proteins by ESMS

ESMS of a glycosylated protein

Expected Mass: 15286.9

Measured Mass: 16503.2

Glycosylated protein with High mannose

Accurate Protein MW demonstrated its unexpected

dimeric form

and the presence of an intermediate

monomer linked to Glutathione

(GS-Monomer)

B: 13623.3 GS-Monomer Dimer with 1 S-S bridge Expected Mass: 13318.2 Measured Mass: B:13623.3 A:26633.9

Δm1=+305 Da

Δm2=+13316 Da

Disulphide Bridges

CM Δm = +58

CAM-Cys Δm = +57

Red CAM Hspa

Exp MW 13331.5±0.8

Assessment of Cys oxidation state

Alkylated Hspa

Exp MW 12983.3±0.4

6 CAM residues = 3 S-S

2. Sample plate is introduced into MALDI source

3. Sample spot is irradiated with laser + + ₊ + + + + To Time of Flight

1. Sample is mixed with matrix and dried on a sample plate

La ionizzazione MALDI prevede l’irradiazione di una piccola superficie di campione, previamente cristallizzato con una matrice, con una luce laser (quasi sempre UV: λ 337 nm) con conseguente riscaldamento dell’area di irradiazione e vaporizzazione delle molecole organiche nella forma di ioni pseudomolecolari di tipo [M+H]+_{. Per composti con}

una elevata affinità per i cationi si possono formare anche addotti di tipo [M+Na]+_,

Isolate the analyte molecules

from one another such

that the incident laser radiation primarily heats the

matrix, rather than the analyte. Optimal molar ratios

are in the 1:1000 to 1:10000 (analyte to matrix) range.

Source of protons

(H

_ions)

_{to ionize the analyte}

molecules.

Absorbing medium for the ultraviolet light

, thus

converting the incident laser energy into molecular

electronic energy, which may be used both for

desorption and ionization.

Funzioni della matrice nella

ionizzazione MALDI

Le principali caratteristiche delle matrici impiegate nella ionizzazione MALDI

Analisi Peptidi Analisi Proteine Analisi

Oligosaccaridi

Aromaticita’

Acidita’

Low Mass Gate

E’ un filtro elettrico che evita l’acquisizione a bassi

valori di m/z riducendo l’interferenza della matrice

Depending on the nature of the matrix

Depending on the nature of the matrix

we can obtain different molecular ions

we can obtain different molecular ions

Protonated

Protonated

species

species

Deprotonated

Deprotonated

species

species

Cationized

Cationized

_species

_species

Two peaks

800 1160 1520 1880 2240 2600 Mass (m/z) 0 464.3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Intensity

Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)[BP = 1608.8, 464]

1 6 0 8 . 8 2 2 1 6 4 . 0 9 1 5 8 4 . 7 9 2 0 1 7 . 0 0 1 3 2 1 . 6 7 1 3 7 8 . 7 6 2 0 1 9 . 0 4 1 1 4 3 . 5 7 1 8 2 1 . 8 3 1 8 9 1 . 0 2 1 4 9 3 . 7 7 1 6 1 0 . 8 4 1 5 8 6 . 8 5 1 1 0 9 . 4 8 1 0 3 2 . 5 7 1 3 8 0 . 7 7 1 8 9 3 . 0 4 2 1 6 6 . 0 9 1 4 7 5 . 7 8 2 0 2 1 . 1 0 1 2 3 4 . 7 1 1 0 8 2 . 6 0 2 2 7 4 . 2 4 1 3 2 3 . 6 6 1 8 2 3 . 8 6 1 1 4 5 . 5 6 2 5 0 2 . 3 6 1 7 7 2 . 9 6 1 6 0 3 . 8 1 1 0 3 4 . 5 5 1 1 1 1 . 5 5 1 7 1 9 . 9 1 1 5 0 4 . 8 0 2 4 1 6 . 3 1 8 0 5 . 4 0 1 4 5 2 . 7 6 1 2 5 4 . 6 0 1 6 3 9 . 9 0 8 5 5 . 0 1 9 3 5 . 4 9 2 0 3 3 . 0 3 1 1 8 0 . 6 4 1 0 6 4 . 6 1 2 2 7 6 . 2 2 1 4 1 0 . 7 4 9 8 0 . 4 7 2 2 1 8 . 0 4 1 3 5 8 . 7 0 1 8 2 5 . 9 8 1 2 1 1 . 6 1 2 1 8 9 . 0 3 1 7 9 9 . 8 7 2 5 3 2 . 3 5 1 7 7 4 . 9 7 2 5 0 4 . 3 5 1 3 8 2 . 7 1 1 3 2 5 . 7 1 2 1 4 5 . 0 1 2 3 8 5 . 0 7 1 5 7 0 . 7 8 2 1 1 0 . 0 2 1 5 3 2 . 7 7 2 5 6 7 . 3 1 1 6 1 2 . 8 2 1 8 6 8 . 9 1 1 4 7 9 . 7 5 9 0 5 . 4 6 2 0 0 8 . 9 6 1 8 9 5 . 0 5 1 2 7 8 . 6 4 1 0 1 3 . 5 1 1 9 2 3 . 0 2 8 0 1 . 2 6 1 7 1 4 . 9 7 1 1 3 9 . 4 5 1 6 6 9 . 9 0 1 9 7 3 . 0 1 2 3 5 9 . 1 9 2 0 8 0 . 9 5 2 4 6 0 . 2 1 1 0 9 8 . 9 1 1 7 4 0 . 8 5 2 3 3 0 . 2 8 1 0 3 7 . 5 0 8 6 7 . 7 4 2 2 5 1 . 0 4 8 3 5 . 4 3 800 1120 1440 1760 2080 2400 Mass (m/z) 0 1057.0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Intensity

Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)[BP = 1522.8, 1057]

1 5 2 2 . 7 8 1 0 3 2 . 6 3 1 5 8 6 . 9 8 1 8 9 2 . 0 3 1 5 2 4 . 7 8 2 1 6 4 . 0 6 1 6 0 3 . 8 1 1 0 9 4 . 6 0 2 0 2 0 . 1 1 1 5 8 8 . 9 8 1 7 6 6 . 9 1 1 2 3 5 . 6 2 1 6 1 9 . 7 9 2 2 7 4 . 2 0 1 1 1 1 . 5 9 1 4 3 0 . 8 7 9 6 3 . 5 7 1 0 3 4 . 6 3 1 1 8 2 . 7 1 8 9 3 . 0 3 2 1 6 6 . 0 7 1 5 0 6 . 7 4 1 7 1 5 . 0 9 1 8 9 4 . 0 2 1 1 5 3 . 6 3 1 2 5 1 . 5 9 1 5 3 2 . 8 4 2 2 7 6 . 1 9 1 6 2 1 . 8 4 2 0 2 2 . 1 0 1 3 1 4 . 7 3 1 0 9 6 . 5 9 1 4 3 3 . 7 6 1 9 5 6 . 0 8 8 0 5 . 4 6 1 7 6 8 . 9 3 1 0 1 1 . 6 7 1 1 2 1 . 6 2 8 7 1 . 0 1 2 2 0 2 . 0 9 1 5 5 6 . 8 3 1 0 3 6 . 6 0 1 8 1 8 . 9 7 2 3 2 7 . 1 7 1 2 1 9 . 6 1 9 0 2 . 5 0 1 1 8 4 . 7 3 1 6 4 2 . 7 9 9 6 5 . 5 5 1 0 7 5 . 6 3 Annexin A2 Glutathione peroxidase 32KDa 28KDa

http://www.kcl.ac.uk/ms-facility/maldi.html

Analisi veloci

Non c’e’ limite teorico ai valori di m/z analizzabili

Buona sensibilità (1 µl di soluzione a concentrazioni femtomolari)

Possibilità di analizzare miscele complesse grazie alla prevalenza delle

specie MH+ _{che sono le sole presenti in spettri di peptidi e piccole} molecole

Discreta tolleranza alla presenza di tamponi salini Prevede configurazioni opportune per analisi MS/MS

Problemi nella co-cristallizzazione della matrice e del campione

Soppressione di segnale in caso di eccessiva presenza di sali o

solventi non volatili

Bassa risoluzione nella configurazione ToF (modalità lineare)

Vantaggi

ΔV

Analizzatori a tempo di volo - TOF

Detector Regione di accelerazione Tubo di Volo (d)

Ec = zV = _ mv

V = _ mv

_{/ z}

2V= mv

_{/ z}

but v = d/t

m/z = [2V/d

_{] t}

Tubo di Volo (d)

Tubo di Volo (d)

Accelerazione degli ioni mediante ΔV ΔV

Ioni hanno acquisito una propria velocità in dipendenza del loro m/z e si muovono

Le loro diverse velocità separano progressivamente gli ioni con diverso m/z durante il loro cammino verso il detector

Le loro diverse velocità separano progressivamente gli ioni con diverso m/z durante il loro cammino verso il detector

Gli ioni con m/z diversi raggiungono il detector in tempi diversi

(m/z)₃ (m/z)₂ (m/z)₁

Ione (m/z)₁ rilevato

ΔV

d₁ d₂

d₃

Pur avendo lo stesso valore di m/z, gli ioni prodotti in sorgente non partono tutti

dalla medesima posizione =>

Sono soggetti ad accelerazione differenti =>

Si muovono con velocità differenti =>

Pur avendo m/z uguale, raggiungono il detector in tempi diversi

Risoluzione strumentale bassa

Delay extraction

Gli ioni con m/z uguali raggiungono il detector in tempi leggermente diversi a causa della loro differente accelerazione iniziale

(m/z)₃ (m/z)₂ (m/z)₁

Ione (m/z)₁ rilevato

dispersione

La dispersione determina la larghezza del picco di massa

Maggiore è la dispersione minore è la risoluzione

Analizzatore TOF con riflettore

Al riflettore elettrostatico viene applicato un potenziale dello stesso segno degli ioni generati in sorgente => repulsione elettrostatica

Ioni che hanno maggiore energia cinetica penetrano più in profondità nel reflectron rispetto a ioni che hanno energia cinetica minore.

Questo si traduce in traiettorie diversificate. Se il potenziale applicato al reflectron è opportunamente scelto, avviene una correzione per gli ioni aventi medesimo m/z che

raggiungono il detector in contemporanea => alta risoluzione

dispersione

Riflettore elettrostatico

Riflettore elettrostatico

Riflettore elettrostatico

Riflettore elettrostatico

Gli ioni aventi lo stesso m/z ma diversa energia cinetica penetrano differentemente nel riflettore. Quelli con energia cinetica maggiore in

Riflettore elettrostatico

All’uscita dal reflectron, le velocità sono le stesse rispetto all’entrata, ma lo ione con velocità maggiore si trova dietro a quello con velocità

Riflettore elettrostatico

Qualora il ritardo dato dal reflectron è opportunamente tarato, i due ioni, aventi comunque velocità diverse, raggiungono il detector in

AVERAGE MW

RANGE m/z – Limite superiore di analisi

Individua l’intervallo di m/z all’interno del quale è possibile effettuare le analisi Limiti superiori di analisi:

Analizzatori quadrupolari - bassi (max ca 3000-4000)

Trappole ioniche (tridimensionali e lineari) - intermedi (ca 4000-6000)

Time of Flight - elevati (oltre 100000)

TRASMISSIONE

Definita come il rapporto tra il numero di ioni generati in sorgente e il numero di ioni che arrivano al rilevatore

ToF Reflectron < ToF lineare

Sensibiltà ToF Ref < Sensibiltà ToF Lineare

ACCURATEZZA (errore a m/z 1000)

Analizzatori quadrupolari e trappole ioniche - media (max 0.03% =>300ppm) Time of Flight reflectron – alta ( 0.006% =>60ppm ext cal)

( 0.003% =>30ppm int cal)

Cellule batteriche intatte Opportuna matrice organica

Tipizzazione batteri

LASER

.

Mass spectrometric images of a mouse brain section

TIC

TIC

Time

Requisiti

 Cromatografia a fase inversa da interfacciare con la sorgente  _{Sorgenti compatibili impiegate in campo proteomico: ESI e MALDI} ESI analisi “on line” direttamente in sorgente MALDI analisi “off line” caricamento piastra portacampioni

 _{Sistemi cromatografici impiegati: nano 25–1000 nL/min o capillari 0.4–200 _L/min}

Tempi di caricamento in colonna incompatibili con l’esecuzione di un’analisi media

Necessità di utilizzare un sistema di tipo capillare per il caricamento del campione e di tipo nano per la separazione cromatografica

POSIZIONE DI

POSIZIONE DI

INTRAPPOLAMENTO DEI PEPTIDI

INTRAPPOLAMENTO DEI PEPTIDI

C

Colonna analitica

Trapping column

POSIZIONE DI ELUIZIONE DEI PEPTIDI

POSIZIONE DI ELUIZIONE DEI PEPTIDI

C

Colonna analitica

Colonne per nano-cromatografia

PC per gestione sistema Pompa capillare Pompe nano Spettrometro di massa Sorgente nanoESI Ion Trap Pompa nano

Abbattimento dei volumi morti

Protein Mixture

Peptide Mixture

Proteins

Peptides

MS analysis

MS data

Protein quantitation and identification

Protein quantitation and identification

(Protein) (Protein) separation separation

digestion

digestion

Schema generale di analisi proteomica

CLASSIC APPROACH

CLASSIC APPROACH

SHOT GUN PROTEOMICS

First Dimension

HPLC- cation exchange off line

resulted in 24 x 200µl fractions

not peptide resolution

JWSCyanoiTRAQREP2iii(1111340328)001:10_ConcMS JWSCyanoiTRAQREP2iii(1111340328)002:10_UV JWSCyanoiTRAQREP2iii(1111340328)003:10_UV

JWSCyanoiTRAQREP2iii(1111340328)001:10_FlowMeasrd JWSCyanoiTRAQREP2iii(1111340328)004:10_UV JWSCyanoiTRAQREP2iii(1111340328)001:10_PressureMS

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 mAU 0 50 100 150 200 250 300 nl/min 0 50 100 150 min

SECOND DIMENSION

HPLC- RP nano LC online with the mass spectrometer

Fraction 5

Fraction 7

Fraction 6

Only one third of each cation exchange fraction loaded

Peptides were eluted from a 75µm C18 capillary column with a linear gradient: 0-42% ACN, 0.1% formic at 0.4%min at a LC-MS flow rate of approx 200nl min.



Complementare agli approcci elettroforetici: ottima alternativa nell’analisi di proteine

di membrana.



Estrema versatilità applicativa anche nell’analisi di miscele complesse.



_{Basse quantità di materiale di partenza 100µg invece di 0.5-1mg per gel.}



Quantificazione realizzata a livello di peptidi

(Differential Proteomics Gel Free).

Vantaggi

Svantaggi



Costo della strumentazione.