Sintesi e valutazione funzionale di derivati pirazolo[3,4-d]pirimidinici quali inibitori duali VEGFR-2/RET chinasi

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UNIVERSITA’ DI PISA

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in

Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

TESI DI LAUREA

Sintesi e valutazione funzionale di derivati pirazolo[3,4-d]pirimidinici

quali inibitori duali VEGFR-2/RET chinasi

Relatori: Candidata:

Prof.ssa La Motta Concettina Gemini Rita

Dott.ssa Sartini Stefania

ANNO ACCADEMICO 2012-2013

SSD/CHIM08

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A mio padre,

che oggi mi avrebbe sorriso fiero.

Al grande amore che ci unisce e che non morirà mai.

A mia madre,

che mi ha trasmesso l’amore per lo studio

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Ringraziamenti

Questa pagina è dedicata a tutti coloro che mi sono stati vicini e che, in un modo o nell’altro, mi hanno permesso di realizzare questa tesi.

Per cominciare, ringrazio le mie relatrici, la professoressa La Motta e Stefania.

Un pensiero tutto particolare ad Anna e Paola, le mie compagne di laboratorio, con cui ho condiviso questi ultimi sei mesi; grazie per la vostra sincera amicizia, senza la quale non sarebbe stato lo stesso.

Desidero inoltre ringraziare, una ad una, le mie compagne di corso, nonché amiche: Elisa, una delle persone migliori che conosca. Grazie per i tanti pomeriggi passati insieme a studiare, per le ansie condivise, per esserci sempre stata nello studio, come nella vita. Valentina, per le sue “fulminee” pedalate in bicicletta, che mi lasciavano sempre senza fiato, ma che non mi hanno mai fatto perdere un treno. Irene, anche lei per me speciale, per i suoi “scatti di ragionamento”, che mi hanno aiutato a risolvere non pochi dubbi. Martina, da cui ho imparato a mantenere la calma prima degli esami, della serie “noi ci proviamo!”. Claudia, con cui invece era praticamente impossibile arrivare tranquilla ad un esame; grazie per avermi aiutato quando per me non era facile studiare. Camilla e Livia, che non potrei non nominare insieme, sempre affidabili e disponibili.

Grazie ai miei fratelli, le colonne portanti della mia vita; a Simona, ai miei nipoti. Con voi accanto, non sarò mai sola.

Al mio amore grande, Giorgio, che ha sempre creduto in me e mi ha sopportato con tanta pazienza in questi ultimi mesi. Grazie anche per avermi tenuta stretta per mano nei momenti più difficili e tristi; senza di te non saprei immaginare la mia vita.

Grazie ai suoi genitori, che mi fanno sentire parte della loro famiglia.

Grazie a Giulia e Simone, che con la loro leggerezza e allegria contagiosa, mi regalano sempre grandi risate.

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Indice:

Premessa 1

Abstract 3

Capitolo 1 - La tiroide e il tumore tiroideo 5

1.1 La tiroide: sito, morfologia esterna e struttura 5

1.2 Il tumore tiroideo 6

1.2.1 Il tumore tiroideo differenziato 6

1.2.2 Carcinoma midollare tiroideo (MTC) 7

1.2.3 Carcinoma tiroideo anaplastico (ATC) 8

1.3 Analisi molecolare del tumore tiroideo 8

1.3.1 BRAF 9

1.3.2 RET/PTC 9

1.3.3 RAS 12

1.3.4 PAX8/PPARγ 13

Capitolo 2 - Le tirosin-chinasi: nuovo target della terapia antitumorale 14

2.1 Classificazione 14

2.2 Struttura RTK 15

2.3 Meccanismo d’azione 18

2.4 Le tirosin-chinasi: target della terapia anti-tumorale 19

2.4.1 Anticorpi monoclonali 20

2.4.2 Inibitori tirosin-chinasici 21

2.5 Angiogenesi tumorale 22

2.5.1 Funzioni biologiche del VEGF e trasduzione del segnale VEGFR-mediata

23

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Capitolo 3 - Trattamento farmacologico del carcinoma tiroideo avanzato 30

3.1 Vandetanib 30

3.2 Cabozantinib 34

Capitolo 4 - Introduzione alla parte sperimentale 38

Capitolo 5 - Parte sperimentale 53

5.1 Materiali e metodi 53

5.2 Procedure di sintesi, caratteristiche chimico-fisiche e dati spettroscopici dei vari intermedi e prodotti finali

54

5.3 Saggi enzimatici 75

5.3.1 Inibizione enzimatica 75

5.4 Conclusioni 76

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Indice delle figure:

Figura 1. Ghiandola tiroide, faccia anteriore 5

Figura 2. Frequenza delle mutazioni nei carcinomi papillare e follicolare 9

Figura 3. Rappresentazione schematica della struttura della RET chinasi 11

Figura 4. Rappresentazione schematica del meccanismo d’azione delle tirosin-chinasi 14

Figura 5. Struttura di un recettore tirosin-chinasico 15

Figura 6. Architettura del dominio chinasico 15

Figura 7. Sito di legame dell’ATP delle tirosin-chinasi 16

Figura 8. Meccanismo d’azione delle tirosin-chinasi 18

Figura 9.Ligandi VEGF e recettori VEGFR 23

Figura 10. Via di trasduzione del segnale mediata dai recettori tirosin-chinasici nell’angiogenesi

26

Figura 11. Struttura chimica del vandetanib 30

Figura 12. Meccanismo d’azione del vandetanib 32

Figura 13. Tollerabilità del trattamento con vandetenib 33

Figura 14. Struttura chimica del cabozantinib 34

Figura 15. Derivati pirazolo[3,4-d]pirimidinici attualmente studiati nel carcinoma tiroideo

38

Figura 16. Nuovi derivati a nucleo pirazolo[3,4-d]pirimidinico 39

Figura 17.Risultati del saggio WST-1 in cellule di DePTC o di controllo, trattate con CLM3 o CLM29 per 24h

40

Figura 18. Inibizione della crescita tumorale da parte del CLM3 (A) senza apprezzabile tossicità (B)

41

Figura 19. Effetti del CLM3 in vitro sulla proliferazione cellulare dopo 72h di Esposizione

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Figura 20. Effetti pro-apoptotici del CLM3 dopo 72h di esposizione 42

Figura 21.Modalità di legame del CLM3 al sito attivo di VEGFR-2 43

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Indice delle tabelle:

Tabella 1. Inibitori tirosin-chinasici già sottoposti a sperimentazione clinica 36

Tabella 2. Attività inibitoria di derivati pirazolopirimidinici 45

Tabella 3. Inibitori tirosin-chinasici sintetizzati 48

Tabella 4. Caratteristiche chimico-fisiche del composto 3 55

Tabella 5. Dati spettroscopici del composto 3 56

Tabella 12. Caratteristiche chimico-fisiche dei composti 1f-1g 65

Tabella 13. Dati spettroscopici del composto 1f 65

Tabella 14. Dati spettroscopici del composto 1g 66

Tabella 16. Dati spettroscopici del composto 2f 68

Tabella 19.Dati spettroscopici del composto 3f 71