Derivati N,N-dialchil-2-arilindol-3-ilgliossilamidici: ligandi al TSPO con attività antiinfiammatoria

1

UNIVERSITA’ DI PISA

Facoltà di Farmacia

Corso di laurea specialistica in

Farmacia

Tesi di laurea

:

Derivati N,N-dialchil-2-arilindol-3-ilgliossilamidici:

ligandi al TSPO ad azione antiinfiammatoria

Candidato: Relatori:

Lambertini Ranieri Prof.ssa Taliani S.

Dott.ssa Barresi E.

3

INDICE

PARTE GENERALE pag. 4

recettori attraverso tecniche chimico-fisiche:

ligandi radioattivi

pag.16



pag.17

INTRODUZIONE ALLA

PARTE SPERIMENTALE pag.26

sulla morte cellulare e sulla per ossidazione

lipidica in seguito ad insulto

pag.32

PARTE SPERIMENTALE pag.35

BIBLIOGRAFIA pag.41

4

PARTE

GENERALE

5 Negli ultimi decenni le benzodiazepine (Bz), sostanze usate comunemente come ansiolitici, anticonvulsivanti, ipnotico-sedativi e rilassanti muscolari, sono state oggetto di numerosi studi e approfondimenti nell’ambito terapeutico-antiflogistico, poiché sono emerse discrepanze teoriche riguardo la localizzazione dei suoi recettori, tuttora non del tutto chiarificata. Il recettore centrale delle benzodiazepine (CBR), che media tutte queste azioni, è localizzato esclusivamente nel sistema nervoso centrale (SNC) e fa parte di un complesso recettoriale sovramolecolare dove sono riconoscibili il sito di legame per l’acido γ-aminobutirrico (GABA), il canale per il cloro e distinti centri di modulazione allosterica sensibili a diversi composti quali le Bz, i barbiturici, la picrotossina, ecc.. Un ulteriore sito di legame per le Bz fu localizzato circa 40 anni fa nei tessuti periferici e fu denominato recettore periferico delle benzodiazepine (PBR).[1,2] Recentemente al PBR è stato attribuito il nuovo nome di Proteina Traslocatrice (18 KDa), abbreviato TSPO. Le ragioni che hanno portato a questo cambiamento sono state determinate dalle nuove scoperte riguardo la localizzazione, la struttura e il ruolo fisiologico di questa proteina. Infatti, è stato osservato che il TSPO non interagisce solamente con le Bz, ma con molti altri ligandi; inoltre non è localizzato esclusivamente a livello periferico e non presenta nemmeno una struttura recettoriale nel senso tradizionale del termine. E’ stato quindi pensato di attribuire come nuovo nome TSPO con riferimento alla principale funzione svolta da questa proteina che è appunto quella del trasporto di molecole come ad esempio il colesterolo e gli intermedi per la sintesi delle porfirine.[3] Il TSPO ha una elevata distribuzione in molti tessuti del corpo. Il cervello ed il fegato presentano livelli relativamente bassi di TSPO, mentre i tessuti e le ghiandole coinvolte nella sintesi degli steroidi ne sono particolarmente ricchi; nel cuore, polmone e rene la sua presenza è più moderata. Il TSPO, inoltre, è espresso in concentrazioni significative anche nel sistema immunitario e nelle varie sottopopolazioni dei leucociti. Il TSPO è una proteina evolutivamente conservata, di 18kDa, altamente idrofobica, costituita da 5 domini transmembranali ed espressa principalmente nella membrana esterna mitocondriale. Alcuni studi hanno riportato l’espressione del TSPO sulla membrana plasmatica degli eritrociti e sulle membrane nucleari di cellule cancerose. Nei mitocondri il TSPO è un costituente del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mitochondrial permeability transition pore, MPTP), dove è intimamente associato in un complesso trimerico con il trasportatore

6 dei nucleotidi adenosinici (ANT, 30 kDa) ed il canale anionico voltaggio dipendente (VDAC, 32 kDa) (Figura 1). Questo complesso costituisce un canale localizzato sui siti di contatto tra le membrane mitocondriali esterna ed interna.[3]

Figura 1

Fino ad oggi sono state identificate 4 proteine citoplasmatiche capaci di legarsi al TSPO,[1] anche se la funzionalità di due di queste è ancora sconosciuta:

 PRAX-1 Peripheral Benzodiazepine Receptor-associated Protein 1 (proteina associata al recettore periferico delle benzodiazepine), del peso di 240 kDa, costituita da 1857 aminoacidi;

 p10, una proteina di 10 kDa che co-immunoprecipita con il TSPO;

 Steroidogenic Acute Regulatory Protein (STAR) che lega il colesterolo e ne promuove il trasferimento mitocondriale;

 PAP7, che regola anch’essa la steroidogenesi.

Per quanto riguarda la proteina PRAX-1 è stato ipotizzato un modello per la sua interazione con il TSPO.[1] Dati stechiometrici evidenziano che la PRAX-1, come monomero, è in associazione con più molecole (almeno due) di TSPO (18kDa) che si trovano nelle sue vicinanze. La porzione della proteina TSPO accessibile per il legame con la PRAX-1 è probabilmente quella C-terminale, di 14 aminoacidi, esposta verso il

7 lato citoplasmatico della membrana esterna mitocondriale. Il ruolo della PRAX-1 è ancora sconosciuto, ma si ritiene che questa sia coinvolta nel reclutamento di siti supplementari nelle vicinanze del TSPO in maniera tale da modularne le funzioni. Il TSPO riveste un ruolo chiave nella funzionalità cellulare. Ad esso sono attribuite le funzioni di regolazione della proliferazione cellulare, trasporto di porfirine (protoporfirina IX, mesoporfirina IX, emina), sintesi dell’eme, immunomodulazione, regolazione della steroidogenesi e apoptosi.

TSPO e steroidogenesi. La biosintesi degli steroidi inizia in tutti i tessuti steroidogenici

con la conversione enzimatica del precursore colesterolo in pregnenolone. Il passaggio limitante la velocità di questo processo è il trasporto del colesterolo dai depositi intracellulari, attraverso lo spazio acquoso intermembranale, verso il lato della membrana mitocondriale interna rivolta verso la matrice, a livello della quale è presente il citocromo P-450 che catalizza la reazione (Figura 2).[1

Figura 2

]

Il TSPO riveste un ruolo cruciale nel processo steroidogenico: quando viene attivato da un ligando (es. PK11195) lega il colesterolo e regola il suo trasporto dalla membrana

8 mitocondriale esterna a quella interna, aumentando la produzione di pregnenolone e la sintesi degli steroidi. Il meccanismo ipotizzato si basa su un modello sperimentale di dinamica molecolare: il TSPO accoglierebbe nelle sue 5 eliche la molecola di colesterolo formando un canale tramite il quale il colesterolo verrebbe trasportato attraverso la membrana.

E’ stato inoltre osservato che i livelli sistemici di steroidi aumentano in seguito ad una lesione, ad un dolore o ad una febbre, in risposta alla stimolazione da parte di alcune citochine della secrezione del fattore di rilascio delle corticotropine. Il coinvolgimento del TSPO nella sintesi di steroidi può quindi contribuire a questo meccanismo difensivo. Inoltre, la relazione presente fra i bassi livelli di steroidi e l’ansia ha indicato il TSPO come un promettente target per il trattamento dei disturbi psichiatrici che sono correlati ad una disfunzione nella sintesi di steroidi.[1] Alcuni composti altamente affini al TSPO come PK11195 e la classe delle N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi, recentemente sintetizzate nel nostro laboratorio, hanno mostrato come effetto un aumento della biosintesi del pregnenolone, e quindi dei neurosteroidi, risultando potenzialmente utili per il trattamento dell’ansia.[4]

TSPO e apoptosi. La cascata apoptotica che porta alla morte cellulare è stata ben

caratterizzata e, in questo processo, l’evento critico iniziale risulta essere la dissipazione del potenziale transmembranale mitocondriale causata dall’apertura dell’MPTP. L’apertura di tale poro, se reversibile e a basso livello di conduttanza, causa un netto influsso di ioni ed acqua dentro la matrice mitocondriale al fine di mantenere il corretto equilibrio ionico dell’organello. L’apertura prolungata del MPTP-poro può al contrario innescare una serie di eventi che hanno importanti conseguenze sulla fisiologia mitocondriale e sull’equilibrio bioenergetico della cellula. In particolare è stata osservata la dissipazione del potenziale transmembrana. Inoltre influenza l’omeostasi degli ioni intracellulari, favorendo il rilascio di calcio dalla matrice, e determina il rigonfiamento colloido-osmotico della matrice mitocondriale e l’efflusso dal mitocondrio di proteine e molecole tra cui il citocromo-c e la flavoproteina AIF (fattore d’induzione dell’apoptosi). Quest’ultima trasloca nel nucleo dove induce condensazione della cromatina e frammentazione del DNA. Nel citosol il citocromo c interagisce con Apaf-1 (fattore attivante dell’apoptosi) innescando le reazioni della

9 caspasi che portano all’attivazione di un complesso di enzimi fondamentale nell’indurre il riarrangiamento strutturale del nucleo, del citoscheletro e della membrana plasmatica, caratteristici dell’apoptosi.[1]

Il TSPO è un modulatore endogeno di questo processo, ma l’esatto meccanismo non è ancora stato definitivamente stabilito. La sua regolazione può avvenire a diversi livelli e il meccanismo proposto include la modulazione dell’MPTP o la diretta interazione con molecole pro- o anti-apoptotiche. E’ stato dimostrato che i suoi ligandi modulano l’MPTP e la risposta apoptotica. PK11195 e FGIN-1-27 sono in grado di diminuire il potenziale di membrana mitocondriale, provocando apoptosi e arresto del ciclo cellulare nella fase G1/G0 in diverse linee cellulari tumorali.[1] Il secondo meccanismo è stato proposto dal momento che, a livello dei siti di contatto tra la membrana esterna e quella interna del mitocondrio, il TSPO è coinvolto nella formazione dell’MPTP poro.

TSPO e immunomodulazione. La presenza del TSPO in un gran numero di cellule

immunomodulatorie come la microglia, i monociti del sangue, i linfociti e i leucociti, ha portato a pensare ad un coinvolgimento del TSPO nella risposta immunitaria; tuttavia, il meccanismo attraverso il quale ciò avviene è ancora sconosciuto. I macrofagi presentano molti siti di legame per il TSPO e, in particolari studi effettuati sui topi, è stato osservato che le Bz inibiscono la capacità dei macrofagi di produrre ROS e alcune citochine infiammatorie come ad esempio IL-1, TNFα e IL-6.

Inoltre, il TSPO è coinvolto nel metabolismo ossidativo ad opera dei fagociti, processo necessario per eliminare definitivamente antigeni esterni. La funzione immunosoppressiva di alcuni ligandi che vanno ad interagire con il TSPO ha dimostrato l’importante ruolo rivestito da questa proteina nella risposta infiammatoria. Nel SNC il TSPO è espresso prevalentemente nelle cellule microgliali. L’attivazione della microglia dà inizio ad una risposta infiammatoria che può esacerbare la perdita neuronale in varie malattie infiammatorie neurodegenerative, come ad esempio l’Alzheimer. Poichè si è osservata una sovraespressione di TSPO nella microglia attivata, si è pensato che l’infiammazione presente a livello cerebrale durante le patologie neurodegenerative coinvolga tale recettore. Si presenta così la possibilità di utilizzare degli specifici ligandi per il TSPO per prevenire o limitare la neuroinfiammazione. Tuttavia il coinvolgimento della microglia attivata in varie patologie del SNC è differente a seconda del suo ruolo

10 nella progressione e nella gravità della patologia. E’ plausibile quindi ipotizzare che, attraverso l’utilizzo del TSPO come marker di tali cellule sia possibile determinare con esattezza quale ruolo la neuroinfiammazione gioca in specifiche condizioni patologiche che coinvolgono il SNC, aprendo così le porte alla cura o all’inibizione della progressione della malattia.[5]

Altre funzioni del TSPO. Numerosi studi sul TSPO hanno dimostrato la modulazione

della sua espressione in stati fisiologici e patologici. L’espressione del TSPO è sotto il controllo del sistema ormonale che colpisce l’interazione del suddetto recettore con VDAC e ANT. Anche altri fattori come le citochine (IL-1 o TNF-α), la vitamina A e le catecolamine

modulano l’espressione del TSPO. L’attività del TSPO sembra comprendere anche la modulazione della risposta cellulare nelle infezioni virali. Una delle strategie adottate dai virus per aggirare i meccanismi protettivi della cellula contro le infezioni, è quella di bloccare il processo di apoptosi. Molteplici studi hanno dimostrato che diversi virus patogeni utilizzano proprio il TSPO come target per mettere in atto il blocco dell’apoptosi. Questa scoperta offre quindi numerose prospettive per nuove strategie antivirali. L’attività del TSPO risulta implicata anche nello stress. Infatti la sua attivazione durante l’esposizione acuta ad agenti stressogeni può essere vista come una predisposizione neuronale e metabolica per un migliore adattamento allo stress.[1] Un’elevata espressione di tale recettore è stata inoltre riscontrata nelle cellule e nei tessuti neoplastici dell’ovario, nell’adenocarcinoma, nel carcinoma del fegato, del colon e nei gliomi. Questo aumento dell’espressione del TSPO è correlabile con il grado di aggressività della forma tumorale. Il monitoraggio dell’espressione di tale recettore, dunque, può essere una procedura rilevante in clinica per diagnosticare e/o seguire la progressione della patologia. Il TSPO è sovraespresso anche nelle cellule microgliali attivate ed in generale nelle aree in cui è in corso una significativa risposta infiammatoria. Una up-regulation della proteina è osservabile anche in vari disturbi neurodegenerativi come ad esempio il morbo di Alzheimer e di Huntington, e nella sclerosi multipla. Una down-regulation di tale recettore è stata al contrario osservata in pazienti affetti da ansia, da stress post traumatico e stress cronico.[1, 3]

11 La comprensione dei meccanismi attraverso i quali il TSPO modula le risposte cellulari, insieme alla descrizione delle variazioni della sua espressione, costituisce la base razionale per un uso terapeutico dei ligandi di tale recettore. Di conseguenza il TSPO ha assunto un notevole interesse come possibile target terapeutico. Una grande varietà di molecole endogene mostra alta affinità per il TSPO. Una delle prime molecole identificate, isolata sia a livello centrale che nei tessuti periferici (ghiandola surrenale, rene e testicoli), è un residuo di neuropeptide di 11 kDa composto da 86 aminoacidi che inibisce il legame del diazepam con il sito recettoriale delle Bz, chiamato “inibitore del legame del diazepam (DBI)”. Oltre a questa molecola e ai suoi metaboliti, sono stati isolati altri ligandi endogeni come le porfirine (protoporfirina IX, mesoporfirina IX ed emina) ed il colesterolo.

Le principali classi di ligandi sintetici descritti in letteratura sono:[1, 5] (Figura 3)  benzodiazepine (4'-clorodiazepam, Ro5-4864)

 isochinolincarbossamidi (PK11195)  imidazopiridine (Alpidem)

 derivati indolacetamidici (FGIN-1, SSR180575)  derivati fenossifenilacetamidici (DAA1097)  pirazolopirimidine (DPA714)

 N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi.

Tutti questi ligandi, che mostrano un’alta affinità di legame per il TSPO, con valori di Ki

nell’ordine del nanomolare, sono stati utilizzati come strumenti farmacologici di ricerca per caratterizzare le proprietà e le funzioni del TSPO.

12 N N N CH3 CH3 O Cl Alpidem ( 1 ) N N N N Cl N CH3 O _CH3 CH3 PK11195 ( 2 ) N N H3C O Cl Cl Ro5-4864 ( 3 ) N X N O R₁ R₃ R2 R FGIN-1 ( 4 ) H N N N O H N O CH3 CH₃ SSR180575 ( 5 ) O Cl N CH₃ O CH3 CH3 O DAA1097 ( 6 ) H₃C O F N _CH 3 CH3 O DPA714 ( 7 )

Figura 3

13 I ligandi FGIN-1-27 e PK11195 hanno mostrato, in vitro, attività antitumorale, inducendo l’apoptosi e l’arresto del ciclo cellulare in linee cellulari di cancro esofageo, colon-rettale e in colture primarie di cancro.

L’ipotesi che il TSPO partecipi allo sviluppo della malattia è supportata dalla sua localizzazione anche a livello nucleare e perinucleare in alcune linee cellulari cancerose: in questa sede il recettore regolerebbe la proliferazione cellulare facilitando il trasporto del colesterolo nel nucleo. Inoltre studi di imaging diagnostico non invasivo, mediante l’utilizzo di ligandi marcati per il TSPO ([3H]PK11195), hanno fornito dati di notevole interesse nella visualizzazione dei tumori in test come la tomografia a emissione di positroni (PET). Ligandi come il Ro5-4864 ed il PK11195 limitano la gravità e la progressione di diversi processi infiammatori. Ciò è stato dimostrato utilizzando questi ligandi in studi sperimentali come il test della carragenina e nella terapia di patologie infiammatorie (infiammazione e iperplasia sinoviale, degenerazione del tessuto osseo e cartilagineo). SSR180575 è risultato efficace nella terapia dell’artrite reumatoide. Ulteriori sperimentazioni hanno dimostrato l’efficacia del SSR180575 e del PK11195 nella terapia del Lupus erythematosus (patologia autoimmune).[1] Recentemente è stata sintetizzata una nuova classe di farmaci, le pirazolopirimidine, affine e selettiva per il TSPO ed in particolare il composto DPA714, in grado di aumentare la steroidogenesi dell’ 80% rispetto ai livelli fisiologici. E’ stato osservato che i livelli sistemici di steroidi risultano significativamente aumentati a seguito di una lesione, di un dolore o di una febbre, a causa della stimolazione da parte di alcune citochine della secrezione del fattore di rilascio delle corticotropine. L’utilizzo di ligandi in grado di interagire con il TSPO e stimolare la sintesi di steroidi può quindi contribuire ad una risposta difensiva e anti-infiammatoria. Altri ligandi in grado di stimolare la sintesi di steroidi sono i derivati fenossifenilacetamidici (DAA1097).[5] Come descritto in precedenza a livello cerebrale il TSPO è localizzato principalmente nelle cellule gliali. E’ stato riscontrato un elevato aumento della sua densità in caso di lesioni o situazioni patologiche a livello del sistema nervoso centrale (SNC), in modo particolare negli stati acuti e cronici di patologie neurodegenerative. Da ciò è nata l’ipotesi che la regolazione delle funzioni del TSPO possa avere un ruolo neurotrofico e neuroprotettivo nelle lesioni neuronali. I risultati sperimentali hanno suggerito che l’espressione del TSPO poteva essere regolata da segnali provenienti da assoni in via di rigenerazione. Un

14 recente studio ha dimostrato come il ligando SSR180575 manifesti proprietà neuroprotettive in diversi modelli di patologie degenerative progressive del sistema nervoso centrale e periferico. Precisamente sia il ligando SSR180575 che il Ro5-4864 promuovono la sopravvivenza del neurone e la riparazione successiva ad assotomia. I meccanismi ipotizzati per tale azione sono: (i) regolazione del processo apoptotico che favorisce la sopravvivenza delle cellule gliali; (ii) produzione di mediatori come neurosteroidi, citochine o altri fattori neurotrofici che supportano la sopravvivenza del nervo. La classe delle N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi (Struttura I) è stata recentemente individuata nel laboratorio di ricerca presso il quale è stato svolto questo lavoro di tesi. Questi nuovi ligandi, che rappresentano una variazione della struttura base dell’Alpidem, sono altamente affini e selettivi nei confronti del TSPO.[6]

N N _R 2 R1 R4 R6 R5 _R3 O O

I

Sono state sintetizzate numerose indolgliossilamidi portanti gruppi sostituenti con diverse proprietà steriche, lipofile ed elettroniche. Moltissimi nuovi derivati sono risultati attivi e selettivi per il TSPO, con valori di Ki di ordine nanomolare. La selettività

verso il recettore periferico è stata accertata con test di binding per il CBR nei quali i composti hanno dimostrato scarsa o nulla affinità (Tabella 1). Per alcune delle indolgliossilamidi I è stata inoltre evidenziata la capacità di stimolare la biosintesi del pregnenolone in cellule C6 di glioma di ratto.[6]

15 Le più importanti considerazioni sulle relazioni struttura-attività (SAR), emerse dall’esame dei dati di affinità riportati nella Tabella 1, sono le seguenti: per quanto riguarda la natura dei sostituenti R1 ed R2 sull’azoto della catena gliossilamidica in posizione 3, ottimi risultati in termini di affinità sono stati ottenuti attraverso la disostituzione con catene alchiliche lineari ed uguali tra loro, di lunghezza compresa tra 3 e 6 atomi di carbonio; si sono inoltre dimostrati altamente affini composti con sostituzione asimmetrica dell’azoto amidico, in particolare etilbenzilamidi e N-metilbutilamidi.

Considerando la posizione para sul fenile in posizione 2, i composti recanti un sostituente elettronattrattore (F, Cl, NO2) si sono dimostrati i più attivi, con valori di Ki

subnanomolari. Tra questi derivati, quelli con catene n-esiliche e con un sostituente in posizione 4' come un alogeno, fluoro (1P) e cloro (1T), o un gruppo nitro (1X), risultano particolarmente potenti con valori di Ki rispettivamente 0.37 nM, 0.55 nM e 0.27 nM.

E’ interessante notare che l’affinità mostrata è simile, se non superiore, a quella dell’alpidem, preso come riferimento (Ki = 0.5-7nm). Al contrario l’inserzione di un

gruppo elettrondonatore come il metile nella posizione 4' non ha determinato un aumento significativo di affinità: infatti questi composti (1dd-1gg) sono equipotenti ai corrispondenti non sostituiti. Infine, per quanto riguarda la posizione 5 del sistema indolico, prodotti recanti un sostituente di tipo elettronattrattore come F, Cl, NO2

(1hh-1ss), hanno mostrato una buona attività, che risulta ulteriormente potenziata se è contemporaneamente presente un secondo sostituente elettronattrattore in posizione 4' (1yy-1jjj, 1www-1zzz). In particolare, il derivato più attivo di tutta la serie delle indolgliossilamidi è rappresentato dal 4',5-dicloro sostituito, portante in posizione 3 una catena N-metilbutilamidica (1xxx, Ki = 0.15 nM).

Le SAR di questa classe di composti sono state razionalizzate sulla base di un modello di farmacofororecettore, secondo il quale i siti di legame sono costituiti da tre tasche lipofile (L1, L3 e L4) e da un sito donatore capace di formare un legame a idrogeno H1.[6] Nella Figura 4 è rappresentato lo schema di interazione delle indolgliossilamidi (Struttura 1) con il recettore, paragonato con le modalità di legame del derivato isochinolinico PK11195.

16 N Cl N Me O _Me Me H1 L1 L3 L4 PK11195 N R4 N R2 R₁ R6 O O R₃ H1 L1 L3 L4 R₅ N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossilamidi

Figura 4

Per le indolgliossililamidi si può ipotizzare che il fenile in posizione 2 sia coinvolto in una interazione con un anello aromatico elettron-ricco presente nell’area lipofila L1 e che questa interazione sia rafforzata da sostituenti elettronattrattori come gli alogeni o il gruppo nitro in posizione 4'. I sostituenti alchilici R1 ed R2 interagirebbero con le aree

lipofile L3 e L4, rispettivamente, mentre il secondo carbonile del ponte ossalilico della catena laterale svolgerebbe il ruolo di accettore nella formazione di un legame a idrogeno con il sito H1 presente sul recettore.

PROBES MOLECOLARI PER LA CARATTERIZZAZIONE DEI RECETTORI ATTRAVERSO TECNICHE CHIMICO-FISICHE: LIGANDI RADIOATTIVI

Negli ultimi anni il molecular imaging si è dimostrato un utile strumento biomedico che consente la visualizzazione, la caratterizzazione e la quantificazione dei processi biologici che si verificano a livello cellulare e subcellulare applicabile direttamente su

17 organismi viventi, incluso l’uomo. I processi biologici possono così essere studiati nel loro autentico ambiente fisiologico. Il molecular imaging permette di monitorare la progressione di una patologia in uno specifico paziente consentendo un approccio di terapia personalizzata. La risposta ad un trattamento farmacologico è differente da individuo a individuo e dipende da vari fattori (corredo genetico, qualità di vita, dieta). L’utilizzo di una terapia personalizzata risulta quindi utile nella diagnosi, nel trattamento e nella prevenzione di una patologia. Una terapia personalizzata è resa possibile da queste nuove tecniche che consentono il monitoraggio di eventi che avvengono a livello molecolare prima ancora che si verifichino i primi sintomi. Il

molecular imaging è anche un utile strumento non invasivo nella diagnosi e nel

monitoraggio di patologie cardiache, di varie forme tumorali e di alcuni disturbi neurologici. Comprende differenti modalità e tecnologie come ad esempio la medicina nucleare (PET, CT/PET, SPECT), la risonanza magnetica nucleare, gli ultrasuoni. Alcune di queste tecniche prevedono l’utilizzo di probes molecolari.

Con il termine di probes molecolari si indicano ligandi utili per la determinazione o caratterizzazione di un recettore mediante varie tecniche chimico-fisiche. Esempi di probes molecolari sono i ligandi radioattivi e i ligandi fluorescenti, oppure ligandi in grado di formare un legame covalente con opportuni costituenti recettoriali (affinity

labels).

PET e Radioligandi. Lo sviluppo della tomografia ad emissione di positroni (PET),

grazie all’utilizzo dei radioligandi ha facilitato la localizzazione e lo studio dell’espressione del TSPO nei topi, nei primati e anche nell’uomo. La PET è una delle principale tecniche di imaging nel campo della radiologia e della medicina nucleare. Questa tecnica fornisce informazioni solo di tipo fisiologico e si basa sull’emissione di radiazioni gamma dal corpo del paziente a seguito dell’iniezione di opportuni radioligandi. Pur essendo una tecnica efficiente nella determinazione della presenza di tumori, la PET fornisce informazioni solo di tipo qualitativo. Per rendere quantitativa l’indagine PET occorre una precisa mappatura dei coefficienti di assorbimento all’interno del corpo del paziente e ciò è possibile ricorrendo alla fusione dell’immagine CT (Computed Tomography) e di quella PET (CT/PET). Il campo di applicazione della PET è la Medicina Nucleare. La diagnostica PET si basa sulla

18 somministrazione al paziente di un radiofarmaco, che si distribuisce nel corpo a seconda della sua composizione chimica e dell’attività metabolica nei vari organi di quella particolare sostanza. Alcune molecole del farmaco iniettato contengono radioisotopi marcatori nei cui nuclei si ha un’eccessiva presenza di protoni rispetto ai neutroni: ciò causa un decadimento β+, schematizzato nel modo seguente:

Z

X →

X* + e

+ ν

Il nucleo finale può trovarsi in uno stato metastabile (contrassegnato dall’asterisco) con conseguente emissione di un fotone per decadimento. Ogni positrone emesso, dopo aver subito un rafreddamento dovuto a successive interazioni coulombiane nel tessuto, annichilisce con un elettrone emettendo due fotoni con direzione di volo

opposte formando un angolo di 180° a 511 keV secondo la reazione:

e

+ e

→ ɣ +

I due fotoni emessi vengono rivelati da opportune matrici di rivelatori, le quali possono essere arrangiate in modo planare su un supporto rotante, o su anelli. Tramite coincidenza elettronica, è possibile determinare se due fotoni, incidenti su due rivelatori opposti, sono stati emessi nell’annichilazione della medesima coppia elettrone-positrone.

Alcuni dei traccianti radioattivi utilizzati in PET sono 11C (T1/2 = 20 min), 13N (T1/2 = 10

min), 15O (T1/2 = 2 min), 18F (T1/2 = 110 min). La brevità della vita media di questi isotopi

β+ emittenti garantisce un basso livello di dose rilasciata al paziente, ma causa la necessità di un ciclotrone in-loco, o comunque non lontano, per la loro utilizzazione. Per studi che necessitano diversi giorni di osservazione, si usa l’isotopo 124I (T1/2 = 4,1

gg).

Una delle caratteristiche che rende così importante la PET per gli studi fisiologici, è la sua capacità di individuare variazioni metaboliche nanomolari, tipiche degli organismi e delle funzionalità cellulari.

Le maggiori applicazioni dell’imaging PET sono la detezione dei tumori al cervello, seno, cuore e polmoni. In neurologia, la PET è particolarmente indicata per la sua

19 capacità di mostrare l’attività dei neurorecettori, i quali hanno una concentrazione troppo bassa ( mol, o inferiore) per essere investigata con altre tecniche diagnostiche. La PET presenta però anche alcuni limiti. Il range medio percorso dai positroni prima di annichilire è, in acqua (che è il maggior componente dei tessuti biologici), di circa 1-2 mm, e varia a seconda del particolare radionuclide usato. Ciò comporta una degradazione nella risoluzione spaziale dell’immagine, poichè la rivelazione dei fotoni in coincidenza elettronica porta alla determinazione del punto di annichilazione della coppia, e non del punto in cui il positrone viene emesso. Questo è il cosiddetto effetto

range. Inoltre l’emissione dei fotoni di annichilazione non avviene esattamente back-to-back, ma si ha una piccola deviazione angolare. Tenendo conto del solo moto

termico delle particelle si dovrebbe avere emissione dei fotoni a 180° ± 0.25° ma ciò non concorda con i risultati sperimentali. In effetti, la deviazione angolare è maggiore ed è dovuta all’instaurarsi di uno stato legato elettrone-positrone, chiamato

positronio. Tale stato legato può interagire con elettroni esterni, annichilando con essi

(pick-off) e provocando l’aumento della dispersione angolare dei fotoni (Figura 5).

20 Le distorsioni nell’immagine dovute all’effetto range e alla deviazione angolare non sono matematicamente rimovibili, e costituiscono una limitazione fondamentale della PET. Tuttavia, la loro entità è tale da essere trascurata se non si usano tomografi con elevata risoluzione spaziale, o distanze elevate tra rivelatori e paziente. La tecnica PET può essere utilizzata per marcare il TSPO attraverso specifici radioligandi consentendo così il controllo della progressione delle malattie ad esso associate e la determinazione dell’effetto che esercita la terapia in tali patologie (ad esempio patologie neuroinfiammatorie). L’utilizzo di radioligandi specifici per il TSPO e della tecnica PET consente la visualizzazione di una eventuale perdita neuronale e della gravità della neuroinfiammazione e ciò può essere un valido strumento per determinare un differente trattamento per uno specifico paziente. Inoltre grazie alla localizzazione della microglia attivata è possibile anche determinare lo stadio della malattia.[5]

Il PK11195 è stato il primo ligando per il TSPO ad essere radiomarcato ad utilizzato per il diagnostic imaging per evidenziare alcune patologie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, di Hungtinton, il Parkinson e la sclerosi multipla; tuttavia, la visualizzazione del recettore a livello cerebrale nel primate si è dimostrata spesso insoddisfacente in quanto l’uptake del radioligando a questo livello non è sufficiente per un’analisi quantitativa.

Nel 1998 è stata sintetizzata una nuova classe di composti acetamidici altamente affini per il TSPO. Fra questi sono stati scelti due ligandi, il DAA1106 e il DAA1197, in grado di oltrepassare la barriera ematoencefalica nel ratto, da radiomarcare con [11C], con lo scopo di indagare sulladistribuzione del recettore a livello cerebrale grazie all’utilizzo della tecnica PET. E’ stato osservato sul ratto che questi [11C]ligandi si distribuiscono soprattutto nel bulbo olfattorio e nel cerebellum, due regioni con un’alta densità di tale recettore. Questo legame si è dimostrato selettivo in quanto la co-somministrazione di composti non radiomarcati affini per il TSPO, riduce il legame dei [11C]ligandi in entrambe le regioni. Attraverso l’utilizzo di questi ligandi radiomarcati e della PET è stato possibile effettuare studi di binding in vivo su cervello di primate e di valutare la percentuale non metabolizzata dei composti presente sia a livello cerebrale che plasmatici.[7]

21 Come già descritto in precedenza i composti pirazolopirimidinici, in particolare DPA713 e DPA714, sono altamente affini al TSPO, in misura maggiore del PK11195. In un recente studio è stato pensato di radiomarcare DPA713 con [11C] per valutare in vivo sul primate la distribuzione del TSPO. Esperimenti su modelli di ratto affetti da neurodegenerazione hanno evidenziato che questo composto possiede delle proprietà di imaging migliori rispetto al [11C]PK11195 esibendo inoltre un signal-to-noise maggiore che consente una quantificazione più precisa del recettore.[8]

N N N H3C O N _CH 3 CH3 O N Cl N CH3 O CH3 11_CH 3 O Cl N CH3 O CH3 CH3 O [11_CH 3] DAA1106 11_CH 3 CH3 [11CH₃] PK11195 [11CH₃] DPA713

Figura 6

22 Negli ultimi anni, le N,N-dialchil-2-fenilindol-3ilgliossilamidi (Fig.4) sono state descritte come una serie di potenti e selettivi ligandi per il TSPO con valori di Ki nell’ordine del

nanomolare. Tali composti da un punto di vista conformazionale sono analoghi derivati dell’indoloacetamide FGIN-1 (Fig.3).

L’alta affinità di tali composti ha recentemente permesso lo sviluppo di nuovi probes

molecolari utili per lo studio della localizzazione e del livello di espressione del TSPO

nei tessuti di interesse, dando luogo ad una linea di sviluppo di nuovi radioligandi per il TSPO a partire da questa classe di precursori.

I dati relativi alle relazioni struttura-attività in accordo con il modello d’interazione farmacoforo-recettore precedentemente descritto, suggeriscono che l’N-H indolico non dovrebbe essere coinvolto nel legame con la proteina recettoriale (Fig.4). A partire da questa ipotesi sono stati, quindi, sviluppati una serie di derivati 2-fenil-indol-3-ilgliossilamidici di formula generale 1, tenendo di conto del valore della costante di dissociazione Ki, più è basso più è alta l’affinità della molecola per la proteina

recettoriale (TSPO). A tal proposito sono stati selezionati 4 composti che una volta sintetizzati sono stati spediti alla dottoressa Meli Rosaria del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Napoli Federico II per essere sperimentati in vitro su cellule di glioma astrocitico C6. Questi test biologici hanno così messo in evidenza come tali composti siano in grado di ridurre il processo infiammatorio aumentando la sintesi di neuroormoni in seguito all’interazione con la Proteina Traslocatrice TSPO.

I nostri composti presi in considerazione, come riporta la Tabella 1, sono:  1P → PIGA 795

 1T → PIGA 796  1III → PIGA 823  1ZZZ → PIGA 1136

23 N N _R 2 R1 R4 R6 R5 Ar O O N R1 R2 Ar R4 R5 R6 PBR Ki (nM) CBR (%) 1a (CH2)2CH3 H C6H5 H H H 815±80 1b (CH2)3CH3 H C6H5 H H H 1167±99 12 1c CH2CH3 CH2CH3 C6H5 H H H 43.0±4 1d (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 C6H5 H H H 12.2±1.0 16 1e (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 C6H5 H H H 7.50±0.7 3 1f (CH2)4CH3 (CH2)4CH3 C6H5 H H H 16.0±2.0 3 1g (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 C6H5 H H H 1.40±0.2 10 1h CH(CH3)2 CH(CH3)2 C6H5 H H H 103±9.0 1i CH2CH(CH3)2 CH2CH(CH3)2 C6H5 H H H 17.0±2.0 5 1j CH2CH3 CH2C6H5 C6H5 H H H 11.0±1.0 1K (CH2) C6H5 H H H 2400±125 4 1l (CH2) C6H5 H H H 665±30 3 1m (CH2) C6H5 H H H 33.0±3.0 3 1n (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 4-F- C6H4 F H H 4.28±0.32 4 1o (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 4-F- C6H4 F H H 2.40±0.81 0 1p (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 4-F- C6H4 F H H 0.37±0.13 0 1q (CH2)2CH3 CH2C6H5 4-F- C6H4 F H H 1.68±0.12 10 1r (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 4-Cl-C6H4 Cl H H 4.65±0.52 14 1s (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 4-Cl-C6H4 Cl H H 1.00±0.27 0 1t (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 4-Cl-C6H4 Cl H H 0.55±0.19 4.2 1u CH2CH3 CH2C6H5 4-Cl-C6H4 Cl H H 1.3±0.15 7.3 1v (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 4-NO2- C6H4 NO2 H H 0.95±0.1 1w (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 4-NO2- C6H4 NO2 H H 0.23±0.07 1x (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 4-NO2- C6H4 NO2 H H 0.27±0.10

24 1y CH2CH3 CH2C6H5 4-NO2- C6H4 NO2 H H 1z (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 4-CF3- C6H4 CF3 H H 1.69±0.2 1aa (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 4-CF3- C6H4 CF3 H H 1.16±0.1 1bb (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 4-CF3- C6H4 CF3 H H 1cc CH2CH3 CH2C6H5 4-CF3- C6H4 CF3 H H 1dd (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 4-CH3- C6H4 CH3 H H 5.50±0.98 1ee (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 4-CH3- C6H4 CH3 H H 3.80±0.91 1ff (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 4-CH3- C6H4 CH3 H H 1.60±0.13 1gg CH2CH3 CH2C6H5 4-CH3- C6H4 CH3 H H 1.33±0.2 1hh (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 C6H5 H H F 2.67±0.48 1ii (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 C6H5 H H F 4.00±0.15 1jj (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 C6H5 H H F 0.37±0.12 1kk CH2CH3 CH2C6H5 C6H5 H H F 1ll (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 C6H5 H H Cl 2.80±0.3 1mm (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 C6H5 H H Cl 4.91±0.4 1nn (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 C6H5 H H Cl 58.4±6 3 1oo CH2CH3 CH2C6H5 C6H5 H H Cl 4.6±0.5 1pp (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 C6H5 H H NO2 20.2±2.02 0 1qq (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 C6H5 H H NO2 21.6±2.15 1 1rr (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 C6H5 H H NO2 30.3±9.15 0 1ss CH2CH3 CH2C6H5 C6H5 H H NO2 18.3±0.15 0 1tt (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 C6H5 H H OCH3 328±45 8.6 1uu (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 C6H5 H H OCH3 65.2±3.4 8.8 1vv (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 C6H5 H H OCH3 35.5±8.7 7.2 1xx CH2CH3 CH2C6H5 C6H5 H H OCH3 69.5±3.6 5.7 1yy (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 4-F- C6H4 F H Cl 2.83±0.80 14 1ww (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 4-F- C6H4 F H Cl 3.05±0.45 17 1zz (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 4-F- C6H4 F H Cl 7.75±1.55 1aaa CH2CH3 CH2C6H5 4-F- C6H4 F H Cl 4.01±0.26 9.7 1bbb (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 4-F- C6H4 F H F 6.73±1.39 1ccc (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 4-F- C6H4 F H F 1ddd (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 4-F- C6H4 F H F 1eee CH2CH3 CH2C6H5 4-F- C6H4 F H F 1.67±0.37 1fff (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 4-Cl-C6H4 Cl H Cl 0.62±0.06 1ggg (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 4-Cl-C6H4 Cl H Cl 1.9±0.2 1hhh (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 4-Cl-C6H4 Cl H Cl 5.8±0.6 1iii CH2CH3 CH2C6H5 4-Cl-C6H4 Cl H Cl 3.3±0.3 1jjj (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 C6H5 H Cl H 14±1.5 0

25 1kkk (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 C6H5 H Cl H 3.40 1 1lll (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 C6H5 H Cl H 2.4±0.3 0 1mmm CH2CH3 CH2C6H5 C6H5 H Cl H 5.0±0.4 0 1nnn (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 C6H5 H CH3 H 25±3 1ooo (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 C6H5 H CH3 H 6±0.60 1ppp (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 C6H5 H CH3 H 1.9±0.20 1qqq CH2CH3 CH2C6H5 C6H5 H CH3 H 2.30±0.20 1rrr CH3 CH2CH3 C6H5 H H H 940±120 15 1sss CH3 (CH2)3CH3 C6H5 H H H 53.3±4 1ttt CH3 (CH2)5CH3 C6H5 H H H 12.6±1 1uuu CH2CH3 (CH2)3CH3 C6H5 H H H 12.1±1 1vvv CH3 CH2CH3 4-Cl-C6H4 Cl H Cl 9.54±1.29 15 1www CH3 (CH2)3CH3 4-Cl-C6H4 Cl H Cl 0.20±0.02 1xxx CH3 (CH2)4CH3 4-Cl-C6H4 Cl H Cl 0.18±0.02 1yyy CH2CH3 (CH2)3CH3 4-Cl-C6H4 Cl H Cl 1zzz (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 C10H7 H H H PK 11195 9.3±0.5 Ro 5-4864 23±3.1 Alpidem 0.5 - 7 1-28

Tabella 1 :

[a] La concentrazione dei composti saggiati che inibisce il 50% del legame del [3H]PK1195 nelle membrane mitocondriali delle di rene di ratto (IC50) è stata determinata mediante analisi log-probit

utilizzando 6 concentrazioni diverse del composto. I valori di Ki sono medie ± SEM di 3 determinazioni.

[b] Le percentuali di inibizione del legame specifico del [3H]Ro151788 ad una concentrazione 10 M del composto sono medie ± SEM di 5 determinazioni. I valori di Ki sono medie ± SEM di 3 determinazioni.

26

INTRODUZIONE

ALLA PARTE

27 Negli ultimi anni il gruppo di ricerca presso il quale è stato svolto questo lavoro di tesi ha intrapreso lo studio di ligandi alla Proteina Traslocatrice (TSPO). Il TSPO, come già descritto nell’Introduzione, è stato originariamente identificato quale sito periferico di legame per il Diazepam e nominato Recettore periferico per le benzodiazepine (PBR), per distinguerlo dal recettore centrale per le benzodiazepine (CBR), associato al recettore GABA-A. Il TSPO, grazie alla sua primaria localizzazione mitocondriale, riveste un ruolo importante in numerosi processi fisiologici quali la steroidogenesi, la proliferazione cellulare e l’apoptosi,stati di infiammazione, adattamento allo stress. Il TSPO risulta quindi essere un target promettente per lo sviluppo di nuovi strumenti terapeutici per il trattamento clinico di numerosi disordini quali tumori, malattie neurodegenerative, autoimmuni ed infettive, tutte patologie correlate ad un alterato equilibrio dei processi vita/morte cellulari. In particolare, un incremento della morte cellulare caratterizza patologie acute quali l’infarto, l’AIDS, disturbi epatici, così come le patologie neurodegenerative. Al contrario, una ridotta capacità delle cellule di andare incontro ad apoptosi può portare all’accumulo di cellule anomale, caratteristico sia dei tumori che delle malattie autoimmuni.

Per quanto riguarda invece l’azione steroidogenica, le evidenze di una iperespressione del TSPO e delle proteine steroidogeniche associate, in seguito ad un danno traumatico nel cervello e nel midollo spinale, insieme ad un aumento locale del livello di steroidi, suggerisce che tale recettore possa giocare un ruolo neuroprotettivo mediato dalla neurosteroidogenesi. Tra le patologie che implicano una alterazione dei livelli di alcuni specifici neurosteroidi possiamo ricordare i disturbi correlati allo stress, la depressione e le malattie neurodegenerative.

Attualmente il TSPO è considerato quindi un interessante target terapeutico, come dimostra il fatto che quasi tutti i ligandi del TSPO hanno mostrato di produrre effetti protettivi in diversi modelli di malattie nuerodegenerative/neurologiche, con caratteristiche infiammatorie correlate. Diversi studi hanno dimostrato inoltre che alcuni ligandi del TSPO sono capaci di ridurre in vivo l’attivazione degli astrociti e delle cellule della microglia, provocata da un insulto neurodegenerativo. I loro effetti anti-infiammatori e neuroprotettivi sono stati attribuiti a molteplici funzioni mitocondriali, tra cui la modulazione della sintesi di neurosteroidi. Il TSPO infatti, si lega con alta affinità al colesterolo, e, in un’azione concertata con la proteina StAR (Steroidogenic

28 Acute Regulatory Protein), svolge un ruolo chiave nella traslocazione del colesterolo dalla membrana esterna a quella interna,permettendo così l’ingresso del colesterolo nella matrice mitocondriale e la sua successiva trasformazione a pregnenolone, reazione catalizzata dall’enzima P450scc (P450 side chain cleavage).

Il pregnenolone è di fatto il precursore di tutti gli ormoni steroidei, molti dei quali sono noti per esercitare effetti antiinfiammatori. Infatti,il PK11195, il ligando specifico per il TSPO generalmente usato come standard di riferimento nelle prove biologiche,è risultato capace di inibire la secrezione di citochine pro-infiammatorie e la proliferazione dei monociti; in più riduce la produzione di ossido nitrico (NO), l’espressione della ciclo-ossigenasi di tipo 2 (COX-2) e il fattore di necrosi tumorale (TNF-α), dopo stimolazione da Lipopolisaccaride (LPS) in cellule di ratto e della microglia umana.

Sulla base di tutte queste considerazioni, durante questo lavoro di tesi sono stati sintetizzati composti appartenenti alla classe dei derivati N,N-dialchil-2-arilindolgliossilammidici (PIGA) I, PIGA-795, PIGA-796, PIGA-823 e PIGA-1136, selezionati sulla base della loro affinità di legame per il TSPO (Ki) e della loro attività

steroidogenica (misurata in base alla loro capacità di stimolare la produzione di pregnenolone in cellule C6 di ratto) e ne è stata valutata la capacità di ridurre la 28er ossidazione lipidica e di conseguenza valutarne un eventuale effetto antiinfiammatorio.[4,6] (Figura 7)

La 28er ossidazione lipidica, quale risultato finale dello stress ossidativo, è indotta dalla deplezione del glutatione cellulare tramite la L-butionina-sulfossimina (BSO), un inibitore della γ-glutamilcisteinasintetasi, enzima deputato alla sintesi del glutatione, un tripeptide “spazzino” dei radicali liberi, quindi ad azione antiossidante. Inoltre la capacità di questi composti di sintetizzare neurosteroidi in seguito all’interazione con il TSPO, li rende partecipi di un processo di difesa da stress ossidativo o da insulti infiammatori che è stato valutato utilizzando l’Aminoglutetimmide (AMG), un inibitore noto dell’enzima P450scc.

29 FIGURA 7: struttura generale dei derivati N,N-dialchil-2-arilindol-3-ilgliossilamidici ( I ) e tabella dei valori di Ki e di aumento % di pregnenolone rispettivi dei composti PIGA selezionati e del composto di

riferimento PK11195 N H Ar N R2 R1 R4 O O I

Composto Ar R1 R2 R4 Ki(nM)[a] _PregnenoloneAumento % [b]

PIGA 795c 4-F-C6H4 (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H 0.37±0.13 128 ± 11

PIGA 796c 4-Cl-C6H4 (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 H 0.55±0.19 146 ± 10

PIGA 823d 4-Cl-C6H4 CH2CH3 CH2C6H5 Cl 3.3±0.3 197 ± 5

PIGA 1136e C10H7 (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 H 0.54±0.06 161 ± 12

PK11195 9.3±0.5 114 ± 8

[a] La concentrazione dei composti saggiati che inibisce il 50% del legame del [3H]PK11195 nelle membrane mitocondriali di rene di ratto (IC50) è stata determinata mediante analisi log-probit utilizzando 6 concentrazioni

diverse del composto. I valori di Ki sono medie ± SEM di tre determinazioni. [b] Cellule di glioma C6 sono state incubate per 2 ore a 37 °C in presenza di ogni composto. Il pregnenolone è stato quantificato mediano saggio immunoenzimatico. I valori sono medie ± SEM di tre determinazioni. [c] Dati presi da ref. 6. [d] Dati presi da ref. 4. [e] Dati presi da ref. 12.

Negli Schemi di Sintesi 1 e 2 sono riportare le procedure utilizzate per la sintesi dei derivati PIGA-795, PIGA-796, PIGA-823 e PIGA-1136.

Lo Schema 1 descrive la sintesi degli intermedi chiave di reazione 34–37. L’appropriata

o-metilanilina-p-sostituita viene fatta reagire con l’opportuno cloruro acilico in toluene

anidro, in presenza di trietilamina in quantità equimolare. La miscela è mantenuta a 0°C per un’ora e poi a temperatura ambiente per 48 ore, controllandone l’andamento della reazione con TLC. Al termine, il solido formatosi viene eliminato per filtrazione a pressione ridotta. La soluzione toluenica viene evaporata a p.r., il residuo ripreso con CH3Cl e lavato con H2O. Dopo essiccamento su MgSO4 il solvente viene evaporato a p.r.

ottenendo un residuo semisolido che viene seccato su P2O5. I composti 30–33 sono

ottenuti sufficientemente puri da poter essere utilizzati nello step successivo senza ulteriore purificazione.

30 Ad una soluzione dell’appropriata benzammide così ottenuta (30–33) in tetraidrofurano anidro viene aggiunta goccia a goccia una soluzione di n-BuLi in esano, in circa 15 minuti, a una temperatura compresa tra 0- (-20)°C sotto corrente d’azoto.

Schema 1

La miscela viene quindi riportata a temperatura ambiente e la soluzione risultante rosso-scuro viene lasciata in agitazione per 24-48 orea temperatura ambiente, controllando l’andamento della reazione con TLC; infine, la miscela è raffreddata in un bagno di ghiaccio, acidificata fino a pH 5-6 con soluzione al 18% di HCl, ed estratta con CH2Cl2. Dopo essiccamento su MgSO4, l’eliminazione del solvente a pressione ridotta

fornisce i derivati indolici 34–37, purificati per cromatografia flash o tramite cristallizzazione dall’appropriato solvente.

Lo Schema 2 descrive la procedura per l’ottenimento dei derivati target 42 – 45.

I derivati indolici 34-37 vengono fatti reagire con cloruro di ossalile in etere dietilico anidro. L’aggiunta a 0°C del cloruro di ossalile porta alla formazione dei cloruri ossalilici

31 38–41 desiderati, recuperati per evaporazione del solvete a p.r. ed utilizzati nella reazione successiva senza ulteriore purificazione.

La condensazione dei cloruri ossalilici con le appropriate ammine è stata effettuata in toluene anidro, in presenza di trietilamina in quantità equimolare per neutralizzare l’acido cloridrico che si forma dalla reazione. La miscela di reazione viene lasciata in agitazione per 2-24 ore a temperatura ambiente, controllandone l’andamento con TLC.

Schema 2

Successivamente il solido formatosi viene eliminato per filtrazione a pressione ridotta e lavato con una soluzione al 5% di NaHCO3, filtrato e seccato per recuperare una

prima porzione di prodotto. La soluzione toluenica viene evaporata a p.r., il residuo ripreso con CHCl3, lavato con una soluzione al 5% di NaHCO3, una soluzione al 10% di

32 composti finali 42–45 sono stati purificati tramite cromatografia flash (miscela eluente: PIGA795 = PIGA796 = acetato di etile/etere di petrolio 40°-60° : 3/7; PIGA823 = acetato di etile/diclorometano : 3/7; PIGA1136 = acetato di etile/etere di petrolio 40°-60° : 7/3).

I composti PIGA sono stati quindi sottoposti a valutazione biologica (in vitro su cellule di glioma astrocitico di ratto C6) presso il laboratorio della Professoressa Rosaria Meli del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Napoli Federico II.

EFFETTI PROTETTIVI DEI PIGA E DEL PK11195 SULLA MORTE CELLULARE E SULLA PEROSSIDAZIONE LIPIDICA IN SEGUITO AD INSULTO

Per valutare l'effetto protettivo di tutti i composti nei confronti dello stress ossidativo, le cellule C6 sono state trattate con BSO in presenza o meno dei composti PIGA o del composto di riferimento PK11195. In seguito ne è stata valutata la vitalità cellulare e la produzione di malondialdeide (MDA), utilizzato come marker della perossidazione lipidica. I PIGA e il PK11195 sono stati utilizzati ad una concentrazione fissa (rispettivamente 10 M e 3 M), dosi che non hanno prodotto effetti citotossici in esperimenti preliminari sulla vitalità cellulare (dati non riportati).

Come riportato nella Figura 8A, i composti sono risultati in grado di contrastare l’effetto antiproliferativo generato dall’insulto cellulare con BSO, a differenza del PK11195, utilizzato come ligando di riferimento al TSPO. I composti più attivi in questo saggio sono il PIGA796 e d il PIGA 1136.

Inoltre, i composti PIGA risultano in grado di ridurre in modo significativo la produzione di malondialdeide (MDA) (Figura 8B). Un risultato simile è stato osservato anche con il PK11195 (Figura 8B). In questo caso i composti più attivi sono il PIGA795 ed il PIGA 796.

Il coinvolgimento dei neurosteroidi nell'effetto protettivo dei PIGA è stato indirettamente dimostrato inibendo la loro produzione tramite Aminoglutetimmide(AMG), un noto inibitore dell’enzima P450scc (P450 side chain cleavage), enzima responsabile della conversione del colesterolo a pregnenolone,

33 precursore di tutti i neurosteroidi. Come possiamo osservare nella Figura 8B, l’effetto inibitorio dei PIGA risulta significativamente attenuato dall’inibizione farmacologica della sintesi di neurosteroidi, dimostrando quindi che il loro effetto di riduzione dello stress ossidativo è mediato dalla loro capacità di aumentare i livelli dei neurosteroidi.

Figura 8 A-B: Effetti dei PIGA e del PK11195 sulla citotossicità indotta da BSO e sulla perossidazione lipidica. Gli effetti protettivi dei PIGA 795, 796, 823, 1136 o PK 11195 sui danni da BSO sono mostrati: la vitalità cellulare (A) e la produzione di malondialdeide (B) sono stati determinati 18 ore dopo la stimolazione da BSO; per la valutazione dei livelli di MDA, l’aminoglutetimide (AMG, 50 mM) è stata aggiunta 1 ora prima dei composti PIGA (figura B). I dati sono stati espressi come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. *** P <0.001 vs cellule non trattate; #P <0.05, ##P <0,01 e ###P <0,001 vs BSO; °P <0.05 e °°°P <0.001 vs il rispettivo PIGA da solo.

34 Questi risultati indicano che i ligandi al TSPO, essendo capaci di ridurre lo stress ossidativo e il processo infiammatorio in cellule gliali attraverso la sintesi de novo di neurosteroidi, potrebbero rappresentare un nuovo potenziale strumento terapeutico per il trattamento di neuropatologie infiammatorie, con effetti benefici paragonabili agli steroidi, evitando allo stesso tempo gli effetti collaterali di terapie a lungo termine con ormoni steroidei.

35

PARTE

SPERIMENTALE

36

 I punti di fusione sono stati determinati usando l’apparecchiatura

Reichert-Kofler.

 Gli spettri di risonanza magnetica nucleare di routine sono stati

registrati in soluzione DMSOd6 su un Bruker operante a 400MHz.

 L’evaporazione è stata eseguita sotto vuoto (evaporatore rotante).

 L’analisi TLC è stata effettuata in Merck 0,2 millimetri con fogli di

alluminio prerivestiti in gel di silice (60F-254). Per la cromatografia

su colonna è stato utilizzato gel di silice 60 (230-400 mesh).

 Tutti i reagenti usati sono prodotti commerciali e tutti i solventi sono

37 Derivati N-(-2-metilfenil)benzamidici-p-sostituiti (30 – 33)

Procedura Generale

Ad una soluzione contenente 0.0015 moli dell’appropriato cloruro acilico disciolti in ca. 10 ml di toluene anidro, viene aggiunta sotto agitazione, in bagno di ghiaccio, goccia a goccia, 0.0015 moli di una soluzione dell’appropriata o-toluidina in 5 ml dello stesso solvente; successivamente alla miscela di reazione si aggiunge una soluzione di 0.0015 moli di NEt3 in 3-4 ml di toluene anidro. Si forma quasi subito un precipitato colorato;

si scalda la sospensione a riflusso per 4 ore e poi lasciata in agitazione a t.a. overnight, controllandone l’andamento con TLC. Si ottiene una massa biancastra solida che viene filtrata a p.r. ed essiccata su P2O5. Il prodotto viene sospeso in una soluzione al 5% di

NaHCO3; quindi si filtra a p.r. ottenendo un solido colorato. Il prodotto ottenuto viene

cristallizzato da toluene. N-(2-metilfenil)-p-fluorobenzamide (30) resa: 78%; N-(2-metilfenil)-p-clorobenzamide (31) resa: 88%; N-(2-metil-4-clorofenil)-p-clorobenzamide (32) resa: 89%; N-(2-metilfenil)-naftilamide (33) resa: 79%. Derivati 2-arilindolici (34 – 37) Procedura Generale

Ad una soluzione di 0.003 moli dell’opportuno derivato N-(2-metilfenil)benzamidico (30-33)in ca. 10ml di tetraidrofurano anidro, raffreddata a -20°C in bagno di ghiaccio secco/etanolo e sotto corrente d’azoto, si aggiungono, goccia a goccia, 0.009 moli di n-BuLi. La soluzione da trasparente diviene prima rosso-rame e dopo rosso-cupo. La miscela di reazione si mantiene in agitazione a t.a. per 24 ore controllandone l’andamento con TLC, poi si raffredda in bagno di ghiaccio e si tratta con una soluzione di HCl al 10% fino a pH=5-6. Si separa la fase organica dalla fase acquosa e si estrae

38 quest’ultima con CHCl3,aggiungendo alla fase acquosa una soluzione satura di NaCl. Si

riuniscono le frazioni di fase organica ottenute e si essiccano su MgSO4. Il solvente

viene eliminato a p.r.. Il solido ottenuto viene purificato con cromatografia flash (miscela eluente: 34 = acetato di etile/etere di petrolio 40-60° : 5/5; 35 = acetato di etile/etere di petrolio 40-60° : 2/8; 36 = acetato di etile/diclorometano : 7/3; 37 = acetato i etile/etere di petrolio 40-60° = 3/7)

2-(4-fluorofenil)-1H-indolo (34) resa: 75; 2-(4-clorofenil)-1H-indolo (35) resa: 84%; 2-(4-clorofenil)-5-cloro-1H-indolo (36) resa: 81%; 2-naftil-1H-indolo (37) resa: 86%. Derivati 2-arilindol-3-ilgliossilcloruri (38 – 41) Procedura Generale

Ad una soluzione di 0.0004 moli dell’opportuno derivato arilindolico 34 - 37in 20ml di Et2O anidro, vengono aggiunti, goccia a goccia, 0.0008 moli di cloruro di ossalile in 1 ml

di Et2O in bagno di ghiaccio. La reazione è lasciata in agitazione per 2-5 ore.

L’andamento della reazione si controlla tramite TLC (miscela eluente: etere di petrolio 40-60°/acetato di etile nelle dovute proporzioni). Il solvente viene evaporato a p.r. e il prodotto ottenuto lavato più volte con Et2O. I prodotti sono sufficientemente puri da

essere usati come tali nella reazione successiva.

2-(4-fluorofenil)-1H-indol-3-ilgliossilcloruro (38) resa: 83%; p.f. =190-192°C (Lett. rif.

39 2-(4-clorofenil)-1H-indol-3-ilgliossilcloruro (39) resa: 68%; p.f. =182°C (Lett. rif. N°4 p.f.

=179-181°C).

2-(4-clorofenil)-5-cloro-1H-indol-3-ilgliossilcloruro (40) resa:61%; p.f. =167°C (Lett. rif.

N°12 p.f. =163-165°C).

2-naftil-1H-indol-3-ilgliossilcloruro (41) resa: 75%; p.f. =211°C (Lett. rif. N°6 p.f.

=210-212°C).

Derivati N,N-dialchil-2-arilindol-3-ilgliossilamidici (42 – 45)

Procedura Generale

Ad una sospensione contenente 0.005 moli dell’opportuno 2-arilindol-3-ilgliossilcloruro (34 - 37) in ca. 30ml di toluene anidro, tenuta in agitazione e raffreddata in un bagno di ghiaccio, sono addizionati, goccia a goccia, 0.005 moli di NEt3 in 1ml di toluene anidro. Nella miscela di reazione si aggiungono, goccia a goccia,

mantenendo sempre la temperatura intorno a 0°C, 0.005 moli dell’opportuna ammina in 1ml dello stesso solvente. Terminata l’aggiunta, si lascia la miscela di reazione in agitazione a t.a.per 24-36 ore, seguendone l’andamento mediante TLC (miscela eluente: etere di petrolio 40-60°/acetato di etile nelle dovute proporzioni). Al termine, il solido formatosi viene eliminato per filtrazione a p.r. e lavato con una soluzione al 5% di NaHCO3, filtratoe seccato su P2O5 per recuperare eventuale prodotto residuo. La

soluzione toluenica viene evaporata a p.r., il residuo ripreso con CHCl3, lavato prima

con una soluzione 5% di NaHCO3, poi con HCl diluito, e infine con acqua. Dopo

essiccamento su MgSO4, l’eliminazione del solvente a p.r. fornisce un residuo che viene

solidificato all’aria. I composti 42 – 45 vengono purificati mediante cromatografia flash (miscela eluente: 42 = 43 = acetato di etile/etere di petrolio 40°-60° : 3/7; 44 = acetato di etile/diclorometano : 3/7; 45 = acetato di etile/etere di petrolio 40°-60° : 7/3 ).

N,N-diesil-(2-(4-fluorofenil)-1H-indol-3-il-giossil)amide (42) resa: 63%; p.f. =218°C (Lett. rif. N°6 p.f. =219-221°C).

40 N,N-diesil-(2-(4-clorofenil)-1H-indol-3-il-gliossil)amide (43) resa: 54%; p.f. =184°C (Lett. rif. N°4 p.f. =182-184°C).

N-benzil-N-etil-(2-(4-clorofenil)-5-cloro-1H-indol-3-il-gliossil)amide (44) resa: 88%; p.f. = 232°C (Lett. rif. N°12 p.f. =232-233°C).

N,N-dibutil-(2-naftil-1H-indol-3-il-gliossil)amide (45) resa: 71%; p.f. =98°C (Lett. rif. N°6 p.f. =98-100°C).

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