ASSORBIMENTO
TRANSIENTE IN
MIOGLOBINA
FOTOLIZZATA
Laureando: Fabrizio Pittorino Relatore: Tullio Scopigno Scopo della dissertazione: studiare la cinetica ultraveloce della mioglobina in seguito alla fotodissociazione del ligando.
Funzione fisiologica della mioglobina: legare reversibilmente
l’ossigeno.
E’ un’emoproteina: il sito attivo è l’eme: Fe coordinato con
i 4 atomi di azoto di una porfirina.
Il Fe può essere 6-coordinato (mioglobina legata)
o 5-coordinato (mioglobina non legata).
LA MIOGLOBINA
Stati eccitati
transienti a vita ultrabreve (fs, ps)
Ricombinazione geminata (reazione in
soluzione acquosa) sulla scala del ns
Fotolisi (impulso
elettromagnetico)
SCHEMA PUMP E PROBE
Gli impulsi di pump e di probe sono focalizzati sul campione. Impulso di pump: ultracorto, utile alla fotolisi.
Impulso di probe: utile allo studio dello spettro di assorbimento transiente del sistema. Quantità di interesse: differenza di assorbanza del probe in presenza e in assenza del pump:
Variando la lunghezza d’onda del probe e il suo ritardo temporale rispetto all’impulso di pump si
ottiene lo spettro di assorbimento transiente del sistema, in cui è funzione del tempo e della
lunghezza d’onda. A ) / ln( ) / ln( ) , ( t I I0 I I0 A ON OFF
PUMP
PROBE
APPARATO SPERIMENTALE
Laser a Ti:Sa centrato a 800 nm e con frequenza di 30 fs.
Impulso di pump ottenuto tramite OPA a 540 nm per massimizzare la fotolisi Impulso di probe tramite dispersione non lineare in cristallo di CaF2
Delay line permette di regolare il ritardo tra pump e probe.
Chopper tarato a 500 Hz permette l’arrivo a intermittenza del pump sul campione.
Monocromatore e CCD raccolgono lo spettro di assorbimento transiente tra 400 e 700 nm Campione di mioglobina nelle forme legata e non legata.
LE IPOTESI: PARALLELA E
SEQUENZIALE
Fotolisi: meno di 50 fs.
Ipotesi per la cinetica dell’eme in seguito alla fotolisi del CO
in termini dell’apparizione di stati eccitati dell’eme non legato: Mb1 e Mb2.
Mb1 è creato istantaneamente, decade contemporaneamente nello stato fondamentale e in Mb2.
Mb2 non è creato istantaneamente!
k10, k12 e k20 frequenze di transizione
Mb1 decade con = 300 fs allo
stato fondamentale della proteina non legata.
Mb2 si rilega con il CO con = 3 ps. Ricombinazione geminata tra Mb e CO sulla scala del nanosecondo.
Canale di formazione di Mb2 inibito nella MbCO. fs 300 1 Mb2 Mb1 MbCO Mb ns g ps 3 2 fs f 50 Q 1 Mb1 Mb2 Mb MbCO ns g 10 k 12 k 20 k Q 1 fs f 50
MODELLO PER L’IPOTESI SEQUENZIALE
Proponiamo un modello per l’ipotesi sequenziale:
Soluzione
Condizioni iniziali
Nonostante tre frequenze di transizione, solo due tempi caratteristici del
sistema!
Autovalori:
ANALISI DATI: PRESENTAZIONE
Spettro di assorbimento transiente della mioglobina non legata: in funzione di e t.
Chirp temporale: dovuto
alla variazione dell’indice di rifrazione con (…e visibile data l’elevata risoluzione temporale)!
Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata
A
A
A
Possibile eliminazione del chirptramite routine scritta su MatLab.
ANALISI DATI: PRESENTAZIONE
Risultato dell’eliminazione del chirp nello spettro della mioglobina non legata. Picchi: “nascita” di:
Mb1 (462 nm) Mb2 (448 nm) Scomparsa dello stato fondamentale (435 nm).
A
Analogamente per la proteina legata con il
CO:
Assenza di picco a 448 nm
(Inibizione di formazione Mb2)
Baseline rappresenta la lenta
ricombinazione geminata.
A
ANALISI DATI: A SINGOLA LUNGHEZZA
D’ONDA (MB)
Un primo approccio può essere eseguire fit a singola lunghezza d’onda sui picchi di
assorbimento delle specie transienti (problema delle code).
In accordo col nostro modello, fit bi-esponenziali.
Mb: 435 nm Mb2: 448 nm
ANALISI DATI: A SINGOLA LUNGHEZZA D’ONDA
(MBCO)
Analoghi risultati per la mioglobina legata con il monossido di carbonio. Per rappresentare la ricombinazione geminata bisogna inserire una baseline.
Mb: 435 nm Mb2: 448 nm
ANALISI GLOBALE: SVD
La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende
difficoltosa l’estrazione dell’informazione lontano dai picchi di assorbimento.
Una possibile soluzione è effettuare un’analisi simultanea su tutte le lunghezze
d’onda.
L’analisi globale è condotta usando il pacchetto MatLab Ultrafast Toolbox. Primo passo: SVD. Questo tipo di analisi permette la stima del numero di
processi attivi del sistema decomponendo la matrice dei dati in spettri di base pesati. Quelli con peso maggiore rappresentano il segnale, gli altri sono rumore.
Risultati per la mioglobina
non legata:
Si confermano due processi
dominanti… e un terzo non trascurabile.
ANALISI GLOBALE: GLOBAL FIT
Global fit: fit simultaneo su tutte le lunghezze d’onda, che ha come parametri i
tempi caratteristici corrispondenti ai processi attivi del sistema e a ognuno di essi
associa uno spettro indipendente dal tempo.
I dati possono essere ricostruiti secondo la formula:
Dati caricati:
Un processo in più.
… I tempi caratteristici sono
sovrastimati!
COOLING VIBRAZIONALE
La foto-eccitazione all’origine delle specie elettroniche ha come risultato specie
vibrazionalmente calde. I picchi di assorbimento di queste si spostano quindi nel tempo, “raffreddandosi”.
Fit con combinazione lineare di gaussiane permette di estrarre la posizione dei picchi
Spostamento dei picchi nel caso
della mioglobina non legata.
Spostamento del picco nel caso della
mioglobina legata.
Tempi caratteristici paragonabili a
quelli della foto-cinetica
CONCLUSIONI
Il nostro studio, effettuato sia tramite fit a singola lunghezza d’onda
sia con fit simultanei su tutto lo spettro di assorbimento transiente, conferma l’apparizione di due stati eccitati in seguito alla fotolisi e il loro decadimento sequenziale verso lo stato fondamentale.
Il cooling vibrazionale è un’ulteriore complicazione all’interpretazione dei dati
e ne abbiamo studiato le dinamiche, evidenziando di lavorare con stati dell’eme vibrazionalmente caldi, sia per lo stato fondamentale sia per gli stati eccitati. Ci siamo occupati di studiare nel dettaglio la cinetica ultraveloce
ANALISI DATI: PRESENTAZIONE
Traccia temporale a 435 nm nel caso della proteina non legata:
SVD E GLOBAL FIT
La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende difficoltosa
l’estrazione dell’informazione lontano dai picchi di assorbimento.
Singular value decomposition: decompone i dati vvvvv nel modo seguente:
dove S è una matrice diagonale mxn che contiene le singular values, U le tracce nel dominio del tempo e V quelle nel dominio spettrale.
Decomposizione di una matrice in somma pesata di matrici di base.
Matrici separabili, possono essere scritte come prodotto esterno di due vettori: o in coordinate:
Si ottiene così: dove le rappresentano le singular values.
Base di componenti ortogonali che può riprodurre i dati tramite combinazione lineare (non hanno necessariamente un significato fisico).
Le componenti della base corrispondenti alle SV più alte rappresentano il segnale, le altre il rumore.
SVD E GLOBAL FIT
La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende difficoltosa
l’estrazione dell’informazione lontano dai picchi di assorbimento.
Global fit permette di estrarre costanti di tempo e spettri indipendenti del tempo corrispondenti ai processi attivi presenti nei dati.
Pacchetto Ultrafast Toolbox: algoritmo patternsearch per la ricerca del minimo assoluto della somma dei residui dove è la matrice dei dati aspettata.
Il problema è multidimensionale (su tutte le lunghezze d’onda) minimizzazione su una ipersuperficie.
Nella spettroscopia ultraveloce i dati di assorbimento transiente sono descritti da: dove le sono gli spettri funzione di e
indipendenti dal tempo. I sono le costanti di tempo corrispondenti e sono i parametri di fit.
Lo scopo è dunque trovare questi due parametri.
Tramite SimBiology si può caricare il modello tramite il quale si effettuerà il global fit sui dati (prima profili di concentrazione, poi fit sui dati).
