Sintesi di bisamminoacidi di interesse biologico

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PISA

Dipartimento di Chimica e Chimica industriale

Corso di laurea magistrale in Chimica LM-54

Sintesi di bisamminoacidi di interesse biologico

Anno accademico 2019/2020

Candidato: Paola Bica Relatore:

prof.ssa Anna Iuliano prof. Gaetano Angelici Controrelatore:

1

Sommario

1.1.1. Importanza della ricerca di nuovi antibiotici ... 4

1.1.2. Acido diamminopimelico e lisina ... 5

1.2. Verso la sintesi di nuovi inibitori del DapE ... 8

1.2.1. Struttura del DapE ... 8

1.2.2. DapE: un enzima promiscuo ... 12

1.2.3. Meccanismo DapE ... 13

1.2.4. Design e sintesi inibitori ... 15

1.3. I diamminoacidi ... 18

1.3.1. Diamminoacidi come analoghi dei disolfuri ... 18

1.3.2. Acido diamminosuberico come inibitore dei sistemi xCT ... 19

1.4. Letteratura della sintesi ... 21

1.4.1. Sintesi dell’acido 2,6-diamminopimelico ... 21

1.4.2. Sintesi dell’acido diamminosuberico ... 26

1.5. Cross-coupling di Negishi nella sintesi di amminoacidi ... 32

2

1.5.2. Sintesi di amminoacidi eteroaromatici ... 35

1.5.3. Sintesi di amminoacidi complessi ... 38

2. Scopo del lavoro... 41

3. Risultati e discussione ... 44

3.1. Strategia di sintesi ... 44

3.2. Preparazione dei bromuri vinilici ... 44

3.3. Preparazione della Cbz-iodoalanina metilestere ... 51

3.4. Reazione di cross-coupling ... 53 4. Conclusioni ... 65 5. Parte sperimentale ... 67 5.1. Strumentazione ... 67 5.2. Reagenti ... 68 5.3. Metil (S)-2-((tert-butossicarbonil)amino)pent-4-inoato (89) ... 68 5.4. Metil (S)-2-((tert-butossicarbonil)amino)-5-(tributilstannil)pent-4-enoato (91) ... 69 5.5. Metil 5-bromo-2-((tert-butossicarbonil)ammino)pent-4-enoato (92) ... 69 5.6. Benzil (S)-2-(Boc-ammino)pent-4-inoato (93) ... 70 5.7. Benzil (S)-2-((tert-butossicarbonil)ammino)-5-(tributylstannyl)pent-4-enoate (94) ... 71 5.8. Benzil 5-bromo-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)pent-4-enoate (95) ... 72 5.9. Metil (2S)-3-idrossi-2-[(fenilmetossi)carbonilamino]propanoato (99) ... 73 5.10. Metil (S)-2-(((benzilossi)carbonil)amino)-3-iodopropanoato (100) ... 74

3 5.11. metil (S)-2-((tert-butossicarbonil)ammino)-3-iodopropanoato ... 75 5.12. 1-benzil 8-metil 2,7-bis((tert-butossicarbonil)ammino)ot-4-enedioato (103) ... 75 5.13. 1-benzil 8-metil 7-(((benzilossi)carbonil)ammino)-2-((tert-butossicarbonil)ammino)ott-4-enedioato (105) ... 76

4

1. Introduzione

1.1.

Gli antibiotici

1.1.1. Importanza della ricerca di nuovi antibiotici

L’incremento della ricerca di nuovi farmaci antimicrobici si è reso necessario a causa dello sviluppo di resistenza batterica nei confronti degli antibiotici conosciuti. Questo problema è favorito da una serie di fattori. I batteri possono resistere agli antibiotici come risultato di mutazione cromosomica (riguarda solo il 10-15% di tutte le resistenze acquisite) o espressione induttiva di un gene cromosomico latente o mediante scambio di materiale genetico attraverso meccanismi di trasformazione (lo scambio di DNA), trasduzione (batteriofago) o coniugazione da parte di plasmidi (DNA extracromosomico). Le specie Gram-positive possono inoltre trasferire resistenza alle specie Gram-negative, ma il contrario è raro. Gli agenti antimicrobici sono resi inattivi attraverso tre meccanismi principali: (a) inattivazione dell'antibiotico mediante distruzione o modifica, (b) aumentato efflusso (l’antibiotico penetrato nella cellula batterica è allontanato dai sistemi di efflusso) e (c) alterazione del sito di legame dell’antibiotico (il sito di legame è alterato e l’antibiotico non riesce più a riconoscerlo).1 _{Streptococcus pneumoniae,}

Streptococcus pyogenes e stafilococchi, organismi che causano infezioni respiratorie e cutanee, membri delle famiglie Enterobacteiacea e Pseudomonas, organismi che causano diarrea, infezioni urinarie e sepsi, sono ora resistenti a quasi tutti gli antibiotici più vecchi.2 Questi meccanismi di resistenza spesso funzionano contro un'intera classe di composti piuttosto che contro un singolo composto, in questo modo un microrganismo può risultare immune al trattamento di molti singoli composti all'interno di una stessa classe. Da qui l’esigenza di sviluppare nuove molecole antimicrobiche basate su composti non presenti in natura, in modo da aggirare la probabilità di incombere in processi di resistenza.3 Amminoacidi non proteogenici, presenti nei prodotti naturali o come frammenti di molecole complesse, sono stati usati come mattoni per la sintesi di nuove molecole o come analoghi di amminoacidi nativi in strutture peptidiche con particolari funzioni biologiche. La ricerca attuale sta affrontando questi problemi esaminando nuovi bersagli enzimatici da microrganismi, con particolare attenzione al

5 metabolismo dell'acido diamminopimelico (DAP). Anche gli α,β-diamminoacidi e i loro derivati esterei e ammidici hanno attirato l’attenzione dei chimici organici e biochimici, dato il loro ruolo chiave in frammenti strutturali di composti biologicamente attivi.4

1.1.2. Acido diamminopimelico e lisina

La biosintesi dei componenti della parete cellulare batterica è un bersaglio per l'azione antibiotica5. Penicilline, cefalosporine e farmaci glicopeptidici come la vancomicina agiscono tutti inibendo i passaggi chiave nell'assemblaggio dello strato di peptidoglicano delle pareti cellulari batteriche. Altri antibiotici come la D-cicloserina agiscono inibendo gli enzimi coinvolti nella biosintesi degli stessi componenti della parete cellulare (Figura 1.1).

Figura 1.1 Siti d’azione degli antibiotici

Fondamentalmente la maggior parte dei batteri richiede la lisina o il suo precursore biosintetico, diamminopimelato (DAP), come componente dello strato di peptidoglicano della parete cellulare. La biosintesi della L-lisina tramite acido diamminopimelico non sembra essere un bersaglio per

6 gli antibiotici presenti in natura. Poiché i mammiferi non producono DAP e introducono la L-lisina tramite la dieta, non ci si aspetterebbe che gli inibitori della via biosintetica che usa il DAP possano mostrare tossicità per i mammiferi.4

1.1.2.1. Vie biosintetiche lisina e DAP

La maggior parte dei batteri, delle piante e delle alghe sintetizzano la lisina e il meso-diamminopimelato (m-DAP) dall'acido aspartico attraverso tre percorsi correlati che divergono dopo la produzione di L-tetraidrodipicolinato (Schema 1.1). La presenza di diverse vie biosintetiche per la sintesi della lisina e del m-DAP sottolineano la loro importanza per la sopravvivenza delle cellule batteriche. Sono infatti possibili tre vie per la loro sintesi, che differiscono l’una dall’altra dopo la produzione dell’L-tetraidrodipicolinato. La via della succilinasi è la più usata; la via della deidrogenasi forma m-DAP direttamente dal L-tetraidrodipicolinato, ma questa è una trasformazione ad alta energia ed è quindi limitata a poche specie di Bacillus; anche la via dell'acetilasi è un percorso biosintetico poco usato per la produzione di m-DAP ed è anch’esso limitato a poche specie di Bacillus. 6

7

8 La via biosintetica primaria nei batteri che porta alla L-lisina, utilizzata da tutti i Gram-negativi e molti dei batteri Gram-positivi è la via della succinilasi (Schema 1.1). Uno degli enzimi nella via della succinilasi, la desuccinilasi dell'acido L-diamminopimelico (DapE), codificato da dapE N-succinil-L, è una metalloidrolasi contenente Zn (II). È stato dimostrato che l’inattivazione del gene che codifica per DapE è letale in Helicobacter pylori e Mycobacterium smegmatis. Anche in presenza di terreni integrati con lisina, H. pylori non è stato in grado di crescere, suggerendo che la lisina non può essere sintetizzata da altri percorsi o assunta dall’esterno. Dato che non ci sono vie biosintetiche simili nei mammiferi, gli enzimi DapE sembrano essere dei potenziali bersagli per inibitori con attività antimicrobica7. Questi ultimi agiscono catalizzando l'idrolisi dell'acido N-succinil-L, diamminopimelico (L,SDAP), formando così l’acido L, L-diamminopimelico e succinato (Schema 1.2).

Schema 1.2 Reazione catalizzata dalla desuccinilasi dell'acido L-diamminopimelico (DapE)

1.2.

Verso la sintesi di nuovi inibitori del DapE

Per sintetizzare nuovi inibitori del DapE è quindi necessari partire dallo studio della sua struttura e dalla comprensione del suo meccanismo d’azione.

1.2.1. Struttura del DapE

Tutte le proteine DapE caratterizzate fino ad oggi sono enzimi dimerici (Figura 1.2) di medie dimensioni (41,6 kDa / subunità) che richiedono ioni zinco per la loro attività. È interessante notare che l’enzima DapE nella sua forma isolata contiene solo uno ione Zn (II) strettamente legato e mostra circa il 60% della sua attività totale. Pertanto, sembrano essere fondamentali

9 entrambi gli ioni Zn, seppur con funzioni diverse, affinchè il DapE adempia totalmente al suo ruolo catalitico. Attraverso un’analisi cristallografica ad alta risoluzione del DapE da Haemophilus influenzae, è stato mostrata la presenza di due domini: un dominio deputato alla dimerizzazione e l’altro alla catalisi (sito attivo). Il sito attivo dell’enzima può contenere due ioni o uno ione zinco ma solo uno vi è saldamente legato. I due domini sono legati da una piccola zona cerniera che permette il movimento di un dominio rispetto all’ altro8_.

Figura 1.2 Struttura del DapE de H. influenzae. (a) Il diagramma di Ribbon mostra la sovrastruttura del dimero

DapE, in cui i monomeri sono mostrati in colori diversi (rosso e blu, rosso e verdi). (b) Diagramma del monomero DapE. L’α-elica è raffigurata come cilindro, gli ioni Zn sono in nero (Zn1, zinco catalitico). Il dominio di dimerizzazione è formato da un residuo-114 inserito tra il foglietto β7 e l’elica α7 e comprende i residui 180-192. Il nucleo del dominio catalitico è costituito da un foglio β pieghettato a otto filamenti inserito tra sette α-eliche. Questa inserzione si ripiega in modo da formare due strati a sandwich α + β. Uno strato è formato dai quattro filamenti β disposti in modo tale da formare un foglietto β antiparallelo, in cui i filamenti sono sfalsati di un angolo di circa 45 °; il secondo stratto è formato invece da due eliche.

10 Il nucleo del sito catalitico è formato da 8 filamenti β racchiusi in 7 α eliche. Il foglietto β è formato da due filamenti più piccoli antiparalleli tra loro (β1 e β2), seguiti da quattro filamenti in posizione centrale più grandi e paralleli (β5, β3, β6 e β13), gli ultimi due filamenti invece, oltre ad avere dimensioni minori, sono ruotati di 180° e sono rivolti in direzione opposta rispetto ai fili della posizione centrale. Lo ione o gli ioni di zinco si trovano vicino all'estremità C-terminale dei domini catalitici sulla superficie della proteina. La cavità del sito attivo è posta al centro del sito catalitico al di sopra dei tre filamenti paralleli β3, β6, β13.8 Il sito attivo del ZnZn_DapE somiglia sorprendentemente ai siti attivi dinucleari di AAP (leucina ammminopeptidasi de Aeromonas proteolytica) e CPG2 (carbossipeptidasi de Pseudomonas)

11

Figura 1.3 L’immagine mostra da vicino i siti attivi di ZnZn_DapE (a) e Zn_DapE (b) con una mappa di

densità elettronica e le distanze dei siti attivi in angstroms. In nero gli ioni Zn catalitici (Zn1), in rosso gli ioni Zn2. (c) Siti attivi dei carbossipeptidasi G2 (PDB ID: 1cg2) e (d) sito attivo del batterio leucina

amminopeptidasi (PDB ID: 2DEA).

La distanza tra i due ioni di zinco in ZnZn_DapE è 3,36 Å confrontabile con 3,45 Å per AAP e 3,25 Å per CPG2. Come per AAP e CPG2, ogni ione Zn in ZnZn_DapE adotta una geometria

tetraedrica distorta o TBP (bipiramide triangolare) con azoto Nɛ di His67 per Zn1 e H349 per Zn2, con formazione tra i due ioni di un ponte acqua/ idrossido con l’atomo che occupa la

12 posizione assiale nell’ipotetica geometria a TBP. Cosa simile accade in AAP e CPG2: ogni

ione Zn è coordinato ad un gruppo imidazolico (H67 per Zn1 e H349 per Zn2) e all’ossigeno carbossilico di E163 per Zn1 e E135 per Zn2. I due ioni Zn sono collegati tramite un ponte acqua/idrossido e D100.8

1.2.2. DapE: un enzima promiscuo

Nonostante lo Zn2+ sia il metallo nativo e fisiologicamente rilevante del DapE, l’enzima presenta anche una promiscua attività dipetitasi che dipende dalla presenza di ioni manganese (Mn2+).

Schema 1.3 Attività promiscua della metalloisoforma del DapE.

Dato che l’attività non nativa di dipeptasi si manifesta in vitro solo quando il labile co-catalitico Zn2+ è sostituito dal Mn2+, formando un centro binucleare Zn-Mn, si suppone che l’attività promiscua DapE-dipendente nelle colture batteriche dipenda dalle isoforme Mn2+ del DapE in vivo11.

Da uno studio sull’attività nativa e promiscua le differenti isoforme del DapE, si nota che quando viene selezionata la nativa attività di desuccilinasi nei batteri si nota una simile crescita sia nelle condizioni in cui non è aggiunto nessun metallo e nelle condizioni in cui è aggiunto Zn2+ o Mn2+. Di contro si è visto che la presenza di Zn2+ provoca un rallentamento della crescita batterica quando si seleziona per l’attività di dipeptidasi. Questo suggerisce che la lo Zn2+ è deleterio per l’attività promiscua del DapE, ma non per la sua attività nativa di desuccilinasi12.

Dato che il Mn2+ e Zn2+ hanno raggi simili, il motivo dell’attività promiscua del DapE è probabilmente da ricercare nella geometria della sfera di coordinamento del manganese

13 (Figura 1.4). Infatti il Mn2+ predilige assumere una geometria ottaedrica (numero di coordinazione 6), lo Zn2+ invece può avere un numero di coordinazione che va da 4 (geometria tetraedrica o tetraedrica distorta) a 5, difficilmente assume numero di coordinazione 6 per stabilizzare stati di transizione o intermedi13.

Figura 1.4 Substrato nativo e substrato promiscuo del DapE.

1.2.3. Meccanismo DapE

In accordo con il meccanismo proposto recentemente per AAP14,15, Nocek et al.8 proposero un meccanismo sia per la forma mono-Zn, sia per la forma di-Zn del DapE per la rimozione del gruppo acilico (succinico o acetilico) legato ad uno dei due atomi di azoto della LL-SDAP (Figura 1.5). Il primo passo del processo catalitico che coinvolge il DapE consiste nel riconoscimento della catena laterale di L,L-SDAP da parte della cavità adiacente al sito Zn1. Successivamente, l’ossigeno ammidico di L,L-SDAP si coordina a Zn1, che espande così il suo numero di coordinazione, passando da quattro a cinque e attivando il substrato per

l’attacco nucleofilo.

La deprotonazione della molecola d'acqua legata al metallo da parte di E134 per formare una porzione di idrossido nucleofila è coerente con il pKa postulato dell'acqua legata a una molecola di zinco.16 _{Una volta che l'idrossido legato allo zinco si è formato, può attaccare il}

carbonio carbonilico attivato del substrato, che forma nello stato di transizione un complesso η-1-μ. Dopo che i prodotti vengono rilasciati, viene introdotta una molecola d'acqua che collega i due ioni metallici. In assenza di un secondo ione metallico, il meccanismo catalitico probabilmente non cambia notevolmente poiché H349 riesce ad orientare correttamente il

14 substrato nel sito attivo, attraverso la formazione di un legame a idrogeno con un carbossilato della catena laterale del substrato, stabilizzando così lo stato di transizione. In presenza di sito dinucleare, il secondo ione metallico probabilmente coordina a ponte o l’ossigeno carbonilico del peptide o la porzione carbossilata laterale del substrato.

Figura 1.5 Meccanismo catalitico proposto per DapE dinucleare da Nocek.

Al momento però non è chiaro se il meccanismo mostrato da Nocek et al.8 basato sulla struttura ai raggi X è corretto. Le strutture cristalline spesso forniscono un immagine insufficiente per la comprensione del meccanismo17.

15 Uda et al.18 alla luce delle caratteristiche promiscue dell’enzima DapE (Capitolo 1.2.2) e in accordo con la struttura cristallina17, suggerirono un meccanismo simile a quello proposto da Nocek et al.8. Anche in questo caso il secondo atomo di Zn non è coinvolto direttamente nel ciclo catalitico, ma è debolmente legato all’acido carbossilico della porzione succinilica del substrato nativo anziché alla porzione carbossilica in α del DAP18 (Figura 1.6).

Figura 1.6 Meccanismo catalitico proposto per DapE dinucleare da Uda.

1.2.4. Design e sintesi inibitori

Visti i precedenti studi sulla struttura e il meccanismo d’azione del DapE, il primo passo per la sintesi di nuovi inibitori del DapE è capire su quali substrati questo enzima può agire.

16 Pertanto, sono stati esaminati come potenziali substrati i quattro isomeri dell'acido N-succinildiamminopimelico (SDAP), nonché un certo numero di aminoacidi acetilati. È stato osservato che il DapE non è in grado di idrolizzare le isoforme D, D, L, D o D, L del SDAP, confermando che L, L-SDAP è l'unico substrato biologico noto per gli enzimi DapE. Inoltre, non è stata osservata alcuna degradazione idrolitica in nessuno degli amminoacidi acetilati testati; ciò mostra che il sito attivo del DapE ha una grande specificità sia per i gruppi funzionali che per la stereochimica del substrato. Queste evidenze mostrano anche che il carbossilato della porzione succinilica interagisce fortemente con il sito attivo del DapE, visto che l’amminoacido acetilato non può essere idrolizzato. 6

1.2.4.1. Potenziali inibitori acetilati

Le versioni acetilate degli SDAP possono introdurre un'interazione sterica repulsiva a causa di gruppi alchilici voluminosi, prevenendo così l’idrolisi. Data la mancanza di attività idrolitica verso le isoforme SDAP, sono stati sintetizzati una serie di potenziali inibitori del DapE basati sul SDAP che differivano gli uni dagli altri per la presenza di diverse catene laterali aciliche legate all’azoto che terminavano o con gruppi carbossilici o con una frazione lipofila ((acetil glutammato; acetil glutammina; acetil arginina; acetil lisine; N-acetil ornitina) (Figura 1.7). Sfortunatamente, nessuno di questi composti ha funzionato come inibitore di DapE.19

Figura 1.7 Amminoacidi acetilati

1.2.4.2. L-captopril

Dato l’insuccesso di questi acidi carbossilici contenenti gruppi tiolici, è stato esaminato L-captopril (Figura 1.8), un inibitore dell'enzima di conversione dell'angiotensina. Il L-captopril si

17 lega allo zinco di ACE tramite il coordinamento di un gruppo sulfidrile. Sembra che L-captopril abbia mostrato caratteristiche inibitorie di H. Influenzae DapE in vitro20. Tuttavia, il DapE non sembra essere l’obiettivo principale dell’attività antimicrobica de L-captopril21_.

Figura 1.8 Struttura de L-captopril e dell’acido N-succinil-L,L-diamminopimelico

È stato osservato che l’aggiunta di L-captopril in vitro inibisce l’attività catalitica delle isoforme mononucleari (Zn) e dinucleari (Zn-Zn) del DapE con IC50 (concentrazione inibiente) di 10 mM 2 28 mM con 20 mM di substrato rispettivamente. Nessuna significativa inibizione è stata osservata per l’isoforma Zn-Mn del DapE12 _{(Figura 1.9).}

Figura 1.9 Inibizione dell’attività di nativa delle metalloisoforme del DapE dal L-captopril.

Questi risultati suggeriscono che lo stato di metallazione in seconda posizione influenza il legame sia tra l'inibitore L-captopril e DapE che tra substrato promiscuo Asp-Leu e DapE (Paragrafo

18 1.2.2), ma non influenza molto il legame con il substrato nativo SDAP12. Da ciò si può dedurre che l’isoforma binucleare Zn-Mn, che è molto probabile che sia presente in vivo, vista la selezione batterica dell’attività promiscua della dipeptidasi del DapE, non è inibita da L-captopril, rendendo così questa molecola inutilizzabile come potenziale antibiotico12.

1.3.

I diamminoacidi

Negli ultimi anni, notevole attenzione è stata rivolta agli acidi α,α′-diammino dicarbossilici a causa della loro versatilità: possono essere usati come analoghi isosterici per migliorare la stabilità chimica di composti biologicamente attivi o essere usati come building blocks che permettono la sintesi di analoghi di ciclotidi, piccole proteine cicliche costituite da circa 28-37 amminoacidi, contenenti sei residui di cisteina22, o ancora possono essere usati come building blocks di composti a potenziale attività antimicrobica23. Sarebbe inoltre molto utile, nella sintesi di peptidi, sviluppare metodi di sintesi ortogonali e adattabili alla preparazione inequivocabile di qualsiasi diastereoisomero desiderato.

1.3.1. Diamminoacidi come analoghi dei disolfuri

I residui di cistina, attraverso la formazione di legami disolfuri, costituiscono un elemento strutturale importante nell’architettura dei peptidi e delle proteine. In alcuni casi in cui la cistina esercita principalmente un’azione scheletrica, sarebbe utile sostituirla con analoghi isosterici non riducibili24 . In alcuni casi strutturalmente semplici, quando il ponte -CH2-S-S-CH2- tra due cistine

è sostituito da un ponte a C4, si forma un nuovo bis-amminoacido: l’acido

(S,S)-2,7-diamminosuberico, un analogo isosterico della cistina (Figura 1.10)25. Questi legami conferiscono maggiore stabilità alla molecola, senza perdita alcuna in attività biologica26_{. La sostituzione della}

cistina con l’acido (S,S)-diamminosuberico è stata usata per aumentare la stabilità metabolica nella vasopressina27_{, ossitocina}28_{, calcitonina}29_{, antagonisti della bradichinina}30 _{e peptidi}

19

Figura 1.10 Strutture di diamminoacidi come possibili analoghi di peptidi contenenti tioli.

Peptidi contenenti gruppi tiolici possono, inoltre, ciclizzare attraverso la formazione di legami disolfuro (Figura 1.11), con conseguente formazione di una sottoclasse unica di peptidi biologicamente attivi: i ciclotidi.22 Questi possiedono più ponti disolfuri interconnessi e sono caratterizzati da resistenza alla decomposizione termica e proteolitica.23

Figura 1.11 Formazione legami disolfuro nei ciclotidi

1.3.2. Acido diamminosuberico come inibitore dei sistemi xCT

Riuscire a sintentizzare bisamminoacidi è una sfida interessante anche per la sintesi di inibitori del trasportatore cisteina-glutammato (xCT). xCT sono trasportatori di amminoacidi: l’importo di cisteina extracellulare è accoppiato con un efflusso intracellulare di glutammato. La cisteina è trasformata in glutatione tramite glicina, che gioca un ruolo cruciale nel metabolismo dei farmaci e rimuove specie di ossigeno attive nella cellula32 (Figura1.12). Studi recenti, che si sono concentrati sul metabolismo del cancro, hanno suggerito che gli xCT sono sovra espressi in molti

20 tipi di cancro, promuovendo la sopravvivenza dei tumori. Per questo motivo gli xCT sono dei possibili target per nuovi farmaci antitumorali.

Figura 1.12 Sistema di scambio cisteina-glutammato.

I modelli di farmacoforo forniscono una strategia per analizzare e visualizzare le relazioni tra struttura e attività biologica che regolano le interazioni del sito di legame del ligando. Per esempio, per la sintesi di inibitori di xCT, è stato prodotto un modello di farmacoforo basato sulla sovrapposizione di L-Glu, L-Cys2, acido quisqualico (QA) e (S)-4-carbossifenilglicina

(4-S-CPG)33 _{(Figura 1.13). In particolare, questi ligandi sono stati allineati in modo tale da sovrapporre}

gli α-C, α-COOH, α-NH2 e i gruppi distali COOH. La sovrapposizione di questa conformazione

di L-Cys2 e L-Glu porta quindi alla probabilità che i gruppi carbossilati distali dei due substrati

possano essere sottodomini differenti all'interno di un sito di legame del substrato più grande34.

21 Sulla base di questi studi l’acido N-benzoil diamminosuberico (DAS) sembra essere un ottimo modello per la sintesi di nuovi inibitori del sistema xCT (Figura 1.14), infatti presenta tutte le caratteristiche teorizzate dal modello di cui sopra (Figura 1.13).

Figura 1.14 Acido N-benzoil diamminosuberico (DAS), come farmacoforo per inibizione di xCT.

1.4.

Letteratura della sintesi

Viste quindi le potenzialità dei bis-amminoacidi, come potenziali inibitori della via biosintetica del DAP e lisina o come inibitori del sistema xCT o ancora come analoghi dei disolfuri, nel corso degli anni sono state proposte varie strategie per la sintesi di bisamminoacidi e in particolar modo dell’acido diamminosuberico e dell’acido diamminopimelico. Qui di seguito sono mostrati i differenti approcci usati.

1.4.1. Sintesi dell’acido 2,6-diamminopimelico

Una delle prime sintesi dell’acido 2,6-diamminopimelico risale al 1992 ad opera di Jurgens,35 _ed

impiega come building blocks chirali il derivato ossazolidinico aldeide di Garner36 _{(2), ed il}

22

Schema 1.3 Sintesi dell’acido 2,6-diamminopimelico ad opera di Jurgens.

L’aldeide di Garner (2) è stata soggetta ad omologazione, mediante reazione di Wittig, con (trifenilfosforanilidene) acetaldeide. L’aldeide formatasi, è stata convertita nel corrispondente alcol tramite riduzione con DIBAL e, successivamente, nel bromuro allilico (con stereochimica E) (3). Quest’ultimo è stato utilizzato per alchilare il derivato piperazinico L-val-gly di Schollkopf; il prodotto ottenuto (5) contiene entrambi i frammenti con la stereochimica del meso-DAP (8), che è stato ottenuto in forma protetta dopo idrogenazione del doppio legame, idrolisi del gruppo ossazolidinico e ossidazione finale.

Questo metodo, pur dando il prodotto desiderato, appare costoso e con un numero di stadi elevato. Inoltre, non sembra adattabile alla sintesi di altri analoghi del DAP.

Un’altra via di sintesi delle forme meso di -diamminoacidi è stata pubblicata da Arakawa et al.37 (Schema 1.4). In questo caso sono stati usati come prodotti di partenza gli addotti di etero-Diels-Alder ottenuti dalla reazione di dieni ciclici e azodibenzoili. 38 _{L’ addotto di Diels-Alder}

23 esterificato poi con diazometano o cloruro di tionile in metanolo. Gli esteri dei derivati ciclici a 5 e 6 termini così prodotti subiscono facilmente un’idrolisi con HCl-AcOH a 100 °C. Per il derivato a sette termini invece non può essere usato questo metodo per l’idrolisi, in quanto si forma una miscela di acidi cis- e trans- dicarbossilici che sono difficili da separare. In questo caso i gruppi benzoilici sono stati ridotti a benzilici con borano-dimetilsolfuro in THF. A questo punto è stata effettuata l’idrogenolisi con 20% Pd(OH)2/C e i gruppi esterei del derivato 13 sono stati idrolizzati

con HCl, fornendo l’acido dicarbossilico 12 in forma diastereoisomericamente pura. L’idrogenolisi successiva del legame N-N porta alla formazione dell’acido diamminoglutarico (14a), dell’acido meso-2,5-diamminoadipico (14b) dell’acido meso-2,6-diamminopimelico (14c) con resa del 97%, 97% e 92% rispettivamente.

24 Questo schema di reazione pur apparendo vantaggioso e altamente stereoselettivo in realtà presenta lo svantaggio del fatto che non è possibile proteggere selettivamente la porzione amminica e carbossilica. La protezione ortogonale di tali gruppi è un requisito importante per la sintesi di questi derivati, in quanto consente l’impiego selettivo di uno dei due gruppi, ad esempio per l’ancoraggio a catene peptidiche. Inoltre, il rischio di epimerizzazione con analoghi con n˃3 potrebbe essere più elevato.

Krasnov et al.39 nel 1997 svilupparono un metodo di sintesi dell’acido 2,4-diamminoglutarico e 2,6-diamminopimelico a partire, rispettivamente, dall’acido glutammico e dal 2-amminoadipico (Schema 1.5). I precursori sono stati prima fatti reagire con la metossiftalimmide e poi bromurati. Tramite sostituzione nucleofila di 17 con ftalimmide di potassio in DMF, è stata ottenuta una miscela di diastereoisomeri (treo- e meso-), separati mediante cromatografia su colonna; la successiva idrolisi e rimozione dell’unità ftalimmidica produce i corrispondenti diasteroisomeri degli acidi diamminodicarbossilici (treo-19a, 66%; meso-19a, 63%; meso-19b, 32%).

Schema 1.5 Sintesi di Bis-amminoacidi ad opera di Krasnov et al.

Il tentativo di ottenere la forma treo a partire dall’eritro non ha portato a nessun risultato, dato che la reazione con potassio ftalimmide in DMF procede con racemizzazione.

Questo approccio, sebbene sinteticamente più breve, presenta sia problemi di stereoselettività sia il problema di non poter avere i gruppi amminici e carbossilici protetti in modo ortogonale.

25 Un approccio più recente, ad opera di Hernàndez et al.40, riporta un metodo sintesi stereoselettiva dell’acido 2,6-diamminopimelico selettivamente protetto, che parte da acido glutammico e prevede la formazione stereoselettiva di un epossido e la sua apertura stereospecifica con sodioazide per la creazione del secondo centro stereogenico (Schema 1.6).

Schema 1.6 Sintesi bisamminoacidi ad opera di Hernàndez et al.

Secondo quanto riportato nello schema 1.6 la reazione di Wittig tra la semialdeide (21) (sintetizzabile dall’acido glutammico) e il metil (trifenilfosforanilidene) acetato, fornisce l’estere α, β-insaturo41 _{(22) di configurazione E in buone rese. La successiva riduzione con DIBAL-H a}

basse temperature forma esclusivamente l’alcol allilico (23), lasciando inalterato il gruppo estereo dell’α-amminoacido. Per generare la nuova frazione α-amminoacidica con assoluto controllo stereochimico, è stata eseguita una epossidazione asimmetrica di Katsuki-Sharpless, usando come

26 legante chirale (+) - (R, R) - dietil tartrato, con formazione dei corrispondenti (S,S)-2,3-alcoli epossidici (24) con eccellente diastereoselezione. L’apertura regioselettiva e stereospecifica dell’epossido è stata effettuata con sodio azide ottenendo il prodotto 25 con resa dell’85%. Il diolo è stato quindi protetto come diossolano (26), l’azide è stata poi ridotta e il gruppo amminico protetto come benzil carbammato (Cbz). A questo punto il diossolano è stato idrolizzato e il diolo risultante è stato sottoposto a demolizione ossidativa. In questo modo sono stati ottenuti acidi α, α′-diammino dicarbossilici protetti selettivamente e con stereochimica precisa e controllata. Questa sintesi è vantaggiosa perché permette di proteggere le funzionalità amminiche e carbossiliche in modo differente ma anche perché fornisce i prodotti con la stereochimica desiderata. Un punto a sfavore è però il numero elevato di stadi sintetici che potrebbe ridurre l’applicabilità della sintesi su più ampia scala.

1.4.2. Sintesi dell’acido diamminosuberico

Per la sintesi dell’acido (S,S)-2,7-diamminosuberico O’Leary et al.42 _{nel 1998 usarono una}

reazione di ring closing metathesis (RCM) (Schema 1.7).

27 L’S-allilglicina è stata ancorata al catecolo mediante esterificazione con DCC, con formazione del derivato dienico aciclico (28). La reazione RCM, effettuata impiegando come catalizzatore rutenio benzil alchilidene (31) in DCM, ha portato ad una resa del 96%. L’intermedio è stato poi idrogenato in catalisi di Pd su carbone. L’idrolisi delle funzionalità esteree e la rimozione del gruppo protettore Boc completano la sequenza di sintesi Questo approccio è stato proposto dagli autori in quanto, nonostante in letteratura fossero riportate molte reazioni di metatesi intermolecolari promosse dal Ru,43 la reazione effettuata sull’estere metilico dell’allilglicina BOC-protetta forniva una resa minore del 5% (Schema 1.8).

Schema 1.8 Reazione di RCM dell’estere metilico dell’allilglicina BOC-protetta con catalizzatore di Ru (31)

Nello stesso anno Williams e Liu44 riportarono un approccio molto simile al precedente. Come è mostrato nello schema 1.9, la N-(tert-butilossicarbonil)allilglicina (36) è stata sintetizzata

tramite −alchilazione diastereoselettiva del precursore (34), enantiomericamente puro, e successiva rimozione dell’ausiliario chirale. L’amminoacido è stato quindi sottoposto ad esterificazione con 1,2-benzenedimetanolo dando l’intermedio 37, il cui gruppo ossidrilico è stato convertito nel para-nitrofenil carbonato 38. Quest’ultimo è stato fatto reagire con il sale trifluoroacetico dell’allilglicina fenil estere (39), fornendo il substrato 40 con 86% di resa. Il composto 40 così ottenuto è stato sottoposto a RCM con formazione del macrociclo 41, ottenuto con resa dell’80%. Infine, l’idrogenazione catalitica di 41, produce l’acido

28

Schema 1.9 Sintesi ad opera di Williams e Liu dell’acido diamminosuberico

Gli stessi autori inizialmente provarono ad effettuare una reazione di RCM usando come substrato t-BOC-(S)-allilgly-(S)-allilgly-OPh, senza però osservare nessuna ciclizzazione (Schema 1.10). Il motivo risiede, presumibilmente, nel fatto che l’ammide adotta una conformazione s-trans termodinamicamente, più stabile dell’s-cis, che non consente la formazione del macrociclo.

29

Schema 1.10 Reazioni di ring closing metathesis.

Infatti, il composto 45 ciclizza formando il macrociclo 46 (82%) analogamente a quanto sopra riportato per il composto 40. Neanche il substrato 47 riesce a formare un ciclo (Schema 1.10). Da ciò risulta chiaro che la conformazione del substrato è un aspetto chiave nelle reazioni di ring closing metathesis.

In ogni caso, usando questo metodo, gli autori sono riusciti a sintetizzare in alte rese e con un’elevata purezza ottica l’acido 2,7-diamminosuberico dall’ N-(tert-butilossicarbonil)-(S)- allilglicina.

Callahan et al.45 (2000) ottennero l’acido diamminosuberico sfruttando una reazione di dimerizzazione di un precursore dell’etinilglicina protetta e conseguente idrogenazione delle insaturazioni del prodotto dimerico (Schema 1.11).

30

Schema 1.11 Sintesi dell’acido di amminosuberico di Callahan et al.

Il derivato ossazolidinico di partenza (49) è stato preparato a partire dall’aldeide di Garner (2) usando il metodo di Meffre46. Per la reazione di dimerizzazione è stato usato CuCl e TMEDA in presenza di O2; il dimero isolato (50) è stato ottenuto con l’82% di resa. La successiva reazione

di idrogenazione con Pd/C al 5% come catalizzatore è stata quantitativa. L’idrolisi selettiva della diossazolidina ha portato all’alcol (R,R)-diamminosuberico Boc-protetto (52), la cui ossidazione con il reattivo di Jones ha dato l’acido (R,R)-diamminosuberico (53) con eccesso enantiomerico maggiore del 99%.

Anche in questo caso, nonostante il metodo usato abbia portato al prodotto con un eccesso enantiomerico alto, la strategia non si presta alla sintesi di altri α,ω-diamminoacidi e non è possibile ottenere un prodotto con protezioni ortogonali.

Un approccio più recente (2011) usato da Tadd et al.26 fa uso della chimica dei reagenti organozinco in reazioni di coupling mediate da rame (Schema 1.12). Il substrato di partenza (54) è stato esterificato con tert-butil-2,2,2-tricloroacetimmidato, fornendo l’estere 55

31 quantitativamente. La reazione di 55 con NBS e AgNO3 forma il bromuro 56 con il 78% di resa.

Quest’ultimo viene fatto reagire in presenza di rame con l’organozinco formato da 58 fornendo il prodotto di coupling 59.

Schema 1.12 Sintesi dell’acido di amminosuberico di Tadd et al.

Le rese riportate usando come fonte di rame CuCN sono del 63%. Gli autori hanno osservato che, utilizzando una sorgente alternativa di rame come il CuBr‧DMS o sostituendo la DMF con il THF, le rese diminuiscono sensibilmente, essendo rispettivamente 32% e 10%. Una successiva idrogenazione catalitica su Pd/C, ha portato alla completa riduzione del triplo legame. Questo approccio è effettivamente vantaggioso perché si riesce ad attuare una sintesi ortogonale ed enantioselettiva di diamminoacidi, potenzialmente incorporabili nei peptidi.

Gli stessi autori nello stesso articolo riportano un’altra procedura per una sintesi ortogonale completa dell’alchene 63. Come si vede dallo schema 1.13 la reazione di metatesi del doppio legame è stata effettuata nelle condizioni standard di letteratura e usando il catalizzatore al rutenio

32

Schema 1.13 Reazione di metatesi del doppio legame per la preparazione di 63

Gli autori effettuarono la stessa reazione usando le microonde anziché il riscaldamento termico, osservando una diminuzione di resa al 36%; anche una diminuzione del carico catalitico dal 10mol% al 5mol% provoca un abbassamento della resa (46%), rendendo questo metodo poco vantaggioso.

1.5.

Cross-coupling di Negishi nella sintesi di amminoacidi

Il cross-coupling di Negishi è un metodo molto usato per la formazione di legami C-C in molte aree della sintesi organica. Come catalizzatori vengono usati Pd o Ni e il coupling formerà un nuovo legame C-C tra un organozinco e un alogenuro o triflato47. Un’applicazione molto comune risiede nella sintesi di amminoacidi non naturali, composti interessanti in una moltitudine di aree di ricerca in chimica e biologia. Infatti, possono essere utilizzati in sequenze peptidiche per sondare la struttura e la funzione di proteine in sistemi sia in vitro48 _{che in vivo}49_{. Amminoacidi}

non naturali stati utilizzati anche negli antibiotici per aumentarne la sensibilità, la forza e la stabilità metabolica.50 _{Di seguito riporteremo una serie di composti amminoacidici sintetizzati}

33

1.5.1. Sintesi di amminoacidi aromatici

Gli amminoacidi aromatici sono impiegati nella sintesi di prodotti naturali, nella chimica dei peptidi e nello sviluppo di nuovi farmaci51,52. Quindi è importante trovare un modo semplice per sintetizzarli. Jackson et al.53 nel 1989 furono i primi a sfruttare il coupling di Negishi per la sintesi di amminoacidi. Sono state riportate una gamma di nuove fenilalanine variamene sostituite, sintetizzate tramite cross-coupling tra l’organozinco ioduro ottenuto dalla L-serina e una serie di iodobenzeni para sostituiti (Schema 1.14). Sembra che questo tipo di reazione tolleri il Boc come gruppo protettore e una certa varietà di gruppi elettron-donatori ed elettron-attrattori sullo ioduro arilico. Le nuove fenilalanine sono state isolate con rese tra il 35% e il 65%.

Schema 1.14 Sintesi di amminoacidi aromatici tramite cross-coupling di Negishi di Jackson et al.

Jackson e Dexter vollero adattare il cross-coupling di Negishi per produrre β e γ amminoacidi a partire da derivati dell’acido aspartico e glutammico54 (Schema 1.15). Impiegando zinco attivato e Pd2(dba)3 come catalizzatore, i β e γ amminoacidi sono stati sintetizzati con rese tra il 33% e

89%. Il protocollo adottato garantisce inoltre una buona riproducibilità dei risultati.

Schema 1.15 Sintesi di β e γ amminoacidi tramite reazione di Negishi.

L’evidenza del buon esito della reazione tra l’organozinco ioduro derivato dalla serina e il 4-ammino-1-bromo naftalene pubblicata da Szczepankiewicz et al.55 ha ispirato la successiva ricerca che ha portato a dimostrare come diversi bromuri possono essere usati nel cross-coupling

34 di Negishi (Schema 1.16, Schema 1.17), anche se le rese di reazione sono più basse quando vengono usati i bromuri arilici rispetto ai corrispondentii ioduri56. Tuttavia, i bromuri arilici sono più economici e più facilmente disponibili degli ioduri arilici.

Schema 1.16 Cross-coupling di Negishi per la sintesi di amminoacidi aromatici, usando come partner bromuri

aromatici.

Schema 1.17 Cross-coupling di Negishi per la sintesi di amminoacidi aromatici, usando come partner bromuri

aromatici.

Sfruttando le differenze di reattività nel cross-coupling tra uno ioduro aromatico e un bromuro aromatico, è stato dimostrato che è possibile sintetizzare dei bis-amminoacidi asimmetrici, tramite due cross-coupling di Negishi successivi (Schema 1.18). Per esempio, il bis amminoacido 69 è stato sintetizzato tramite doppio cross-coupling con una resa del 37%. Nonostante sembri un risultato modesto, in realtà è un miglioramento dell’approccio palladio-catalizzato di Suzuki-Miyaura riportato per la sintesi asimmetrica di bifenil bis-amminoacidi che portava ad una miscela racemica57_.

35

Schema 1.18 Sintesi di bisamminoacidi aromatici tramite cross-coupling di Negishi

E’ stato inoltre verificato che i leganti biarilfosfinici consentono di ottenere rese più alte nelle razioni catalizzate da palladio. Infatti, sembra che questa classe di leganti stabilizzi non solo il Pd(0) monolegato ma anche i centri Pd(II)58. Ad esempio l’impiego del catalizzatore attivo formato da SPhos e Pd2(dba)3 in rapporto 1:1, consente di ottenere un incremento delle rese fino

all’84% del cross-coupling di Negishi tra derivati fenilalaninici59 _{(Schema 1.19)}

Schema 1.19 Sintesi amminoacidi aromatici tramite cross-coupling di Negishi, usando Pd2(dba)3 ed SPhos.

1.5.2. Sintesi di amminoacidi eteroaromatici

Per lo sviluppo e la scoperta di farmaci spesso si utilizzano nuclei eteoaromatici per veicolare un’intensa attività biologica60 _{e come frammenti basali per la scoperta di nuovi farmaci (FBDD =}

36 frammenti chimici (in genere molecole di piccole dimensioni e a basso peso molecolare) che si legano debolmente con target biologici e sulla loro successiva modifica o accrescimento per produrre molecole con alta affinità per il sistema biologico62.

In questo contesto gli amminoacidi eteroaromatici costituiscono i building block per la sintesi di composti biologicamente attivi63. Il cross-coupling di Negishi è un modo per sintetizzarli in pochi step e in modo controllato.

Sintesi di amminoacidi con gruppi eteroaromatici tramite cross-coupling di Negishi è stata riportata da Göbel e coautori. che hanno impiegato con successo vari bromuri e ioduri arilici ed eteroaromatici su derivati ossazolidinici utilizzati come precursori di amminoacidi64 (Schema 1.20). L’idrolisi del gruppo ossazolidinico, la protezione del gruppo amminico e infine l’ossidazione del gruppo ossidrilico primario completano la sintesi di questi amminoacidi protetti, che sono stati impiegat per la sintesi di peptidi in fase solida (SPPS).

37

Schema 1.20 Sintesi di amminoacidi eteroaromatici tramite cross-coupling di Negishi riportata da Göbel et al.

Nel 2014 Usuki et al.65 riportarono un miglioramento del cross-coupling di Negishi delle alopiridine con organozinco ioduri derivati dall’acido aspartico (Schema 1.21).

Schema 1.21 Sintesi di amminoacidi eteroaromatici tramite cross-coupling tra alopiridine e organozinco ioduri

derivati.

Dopo diverse reazioni di ottimizzazione, il sistema catalitico di Pd2(dba)3 in combinazione con

P(2-furil)3 come legante, sembra essere la migliore soluzione in questo tipo di coupling. La

possibilità di legare gruppi tienilici e furilici ad amminoacidi è stata riportata da Cobb e coautori66 nel 2015 (Schema 1.22). La 2-tienil-alanina è stata ottenuta con una resa del 26%, con un notevole incremento rispetto alle rese del 10% riportate riportate in precedenza67_{. Inoltre, sia il Boc che il}

Fmoc, come gruppi protettori sembrano tollerare le condizioni del coupling.

38

1.5.3. Sintesi di amminoacidi complessi

Oltre agli esempi di molecole eteroaromatiche e aromatiche, il cross-coupling di Negishi è stato usato per preparare una vasta gamma di amminoacidi complessi. La formazione di amminoacidi bifenilici e loro derivati, può essere facilmente realizzata usando questo cross-coupling 68 (Schema 1.23).

Schema 1.23 Sintesi di bisamminoacidi bifenilici tramite cross-couplig di Negishi.

La famiglia di prodotti naturali Kapakahine ha mostrato una promettente attività biologica contro le cellule leucemiche murine P388 e quindi l'accesso a questi composti si è rivelato di notevole interesse. La sintesi di Kapakahine E ed F, usata da Rainier ed Espejio69, si basa su di un cross-coupling di Negishi e dà immediatamente l’intermedio che successivamente, tramite due vie diverse, formerà le due Kapakahine (Schema 1.24).

39

Schema 1.24 Sintesi Kapakahine tramite cross-coupling di Negishi.

Nel cross-coupling di Negishi possono essere usati i triflati al posto degli alogenuri70. Nel campo della chimica dei peptidi è stato riportato un cross-coupling mediato da PdCl2(PPh3)2 tra

organozinco e vari triflati cicloalchenilici, ma le rese ottenute sono state moderate, tra il 41% e il 46%71. Jackson e coautori nel 2012 riportarono lo stesso tipo di cross-coupling, usando però come catalizzatore Pd2(dba)3 e SPhos come legante (Schema 1.25). Le rese di questa reazione sono così

40

Schema 1.25 Sintesi di amminoacidi complessi tramite cross-coupling, usando organozingo ioduri derivati e

cicloalchenil triflati.

Il cross-coupling di Negishi si è mostrato molto versatile per la sintesi di vari amminoacidi non naturali. La capacità di sintetizzare nuovi amminoacidi aromatici, eteroaromatici e complessi, rende questa via interessante per una sintesi ortogonale e stereoselettiva di bis-amminoacidi di interesse biologico.

41

2. Scopo del lavoro

Considerata l’importanza biologica di bis-amminoacidi come precursori per la sintesi di inibitori di enzimi DapE, come inibitori del trasportatore cisteina-glutammato (xCT) o come building blocks di composti a potenziale attività antimicrobica, ed il fatto che ad oggi non sono presenti in letteratura sintesi efficienti che consentano di ottenere sistemi di questo tipo protetti ortogonalmente, in modo da rendere facile la loro derivatizzazione selettiva, l’obiettivo di questo lavoro è stato quello di trovare un metodo di sintesi efficiente, che sia adattabile alla produzione di una rosa diversificata e ampia di bisamminoacidi. A tale scopo è stata indagata la possibilità di ottenerli, con gruppi amminici e carbossilici protetti ortogonalmente, sfruttando come reazione chiave un cross-coupling di Negishi, per la formazione del legame C-C tra due derivati amminoacidici opportuni, secondo lo Schema 2.1, che illustra la via di sintesi proposta per l’acido diamminosuberico protetto.

42

Schema 2.1 Approccio sintetico proposto in questo lavoro di tirocinio.

Il lavoro ha riguardato, in particolare, la messa a punto di un metodo efficiente sia per l’ottenimento del bromuro vinilico che dell’organozinco ioduro, oltre che lo studio della fattibilità della reazione di cross-coupling.

Tuttavia, a causa dell’emergenza CoVid-19, questo progetto iniziale ha subito delle variazioni e lo studio è stato limitato alla sintesi di due precursori dell’acido diamminosuberico, che presentano ancora il doppio legame (figura 2.1), i cui gruppi amminici e carbossilici sono protetti in modo differente, allo scopo di verificare anche l’influenza della natura del gruppo protettore sul decorso della reazione.

43

44

3. Risultati e discussione

3.1.

Strategia di sintesi

La via di sintesi sviluppata prevede la manipolazione indipendente dei due amminoacidi del coupling secondo la seguente scaletta:

• Preparazione del bromuro vinilico: o Protezione dell’amminoacido; o Idrostannazione alchino;

o Conversione dello stannano in bromuro. • Preparazione della iodoalanina protetta:

o Protezione dell’amminoacido;

o Conversione della funzionalità ossidrilica in ioduro. • Reazione di cross-coupling:

o Coupling in catalisi di palladio dei due amminoacidi precedentemente modificati come descritto sopra.

3.2.

Preparazione dei bromuri vinilici

La sintesi del metil 5-bromo-2-(tert-butossicarbonil)amminopent-4-enoato (91) è stata realizzata a partire dalla (S)-N-Boc-propargilglicina (88), che è stata convertita nel corrispondente metilestere per trattamento con DBU e ioduro di metile; la reazione, condotta a temperatura ambiente, ha fornito il prodotto 89 in forma chimicamente pura con resa dell’80%, dopo estrazione con solvente della miscela di reazione, senza bisogno di ulteriore purificazione (Schema 3.1).

45

Schema 3.1 Reazione di protezione della (S)-N-Boc-propargilglicina.

Nello stadio successivo il triplo legame deve essere convertito nel bromuro vinilico con regiochimica anti-Markovnikov. La strategia iniziale prevedeva di effettuare sulla propargilglicina protetta una idroborazione con catecolborano73 e successiva bromurazione dell’acido boronico74_{, come mostrato nello schema 3.2. La reazione di idroborazione è sia}

regioselettiva (anti-Markonicov) che stereoselettiva (sin-selettiva) sebbene nel nostro caso non sia importante che la stereochimica del doppio legame sia definita, in quanto, nel progetto di sintesi quel doppio legame dovrà poi essere idrogenato per ottenere il bisamminoacido desiderato.

Schema 3.2 Reazione di idroborazione con catecolborano del substrato 89

La reazione di idroborazione, effettuata usando un rapporto 1:1 di 89 e catecolborano, però, non ha fornito l’acido boronico desiderato, ma un prodotto diverso. L’analisi dello spettro 1H NMR,

46 in cui si nota la scomparsa del segnale corrispondente alla risonanza dei protoni metilici del raggruppamento Boc, suggerisce che, probabilmente, nelle condizioni di reazione il gruppo amminico è stato deprotetto.

Visto l’esito negativo di questa reazione, è stato deciso di utilizzare un approccio differente per ottenere il bromuro vinilico che ha previsto una idrostannazione75 del triplo legame con tri-n-butilstagno idruro, seguita da bromurazione dello stannano76. Come mostrato dallo schema 3.3, la reazione procede con meccanismo radicalico, dando luogo alla formazione del derivato terminale. Per quanto riguarda la stereoselettività, in presenza del radicale stagno e nelle condizioni di reazioni, il prodotto formato inizialmente dall’addizione syn si equilibra termicamente al più stabile isomero E. In generale, i prodotti osservati nell’idrostannazione radicalica riflettono una selettività di tipo termodinamico piuttosto che cinetico, in ragione dell’equilibrio di isomerizzazione del prodotto attraverso reazioni di addizione-eliminazione77_.

Come detto precedentemente, per i nostri scopi, tuttavia non è importante che la stereochimica del doppio legame sia definita.

47 La reazione è stata effettuata a 60 °C, usando tri-n-butilstagno idruro e 89 in rapporto 1:1 e in presenza di una quantità catalitica di AIBN come iniziatore radicalico.

Schema 3.4 Reazione di idrostannazione

Il prodotto è stato ottenuto, dopo purificazione del grezzo tramite cromatografia flash, con resa dell’80% L’identità del prodotto è stata confermata mediante spettroscopia 1H NMR. Nello spettro protonico (Figura 3.1). Si possono notare infatti tre segnali, integranti complessivamente per 27 protoni, corrispondenti alla risonanza dei protoni delle catene butiliche legate allo Sn nella zona da 0.6 ppm a 1.6 ppm, inoltre a 5.8 ppm e 6.10 ppm sono presenti due segnali, ciascuno integrante per un protone, relativi alla risonanza dei protoni alchenilici.

48

Figura 3.1 Spettro 1_{H NMR (400MHz, CDCl}

3, 25°C)del metil

(S)-2-((tert-butossicarbonil)amino)-5-(tributilstannil)pent-4-enoato.

La successiva bromurazione è stata effettuata per reazione con N-bromosuccinimmide (NBS), tra 0°C e temperatura ambiente (Schema 3), e ha fornito 91 chimicamente puro con resa del 74% dopo purificazione cromatografica, la cui identità è stata confermata mediante spettroscopia 1_H

NMR.

49 Nello spettro protonico (Figura 3.2), si nota la scomparsa dei segnali corrispondenti alla risonanza dei protoni delle catene butiliche legate allo stagno, inoltre si nota lo spostamento del segnale a 5.8 ppm, relativo alla risonanza di uno dei protoni alchenilici, che ora risuona a 6.10 ppm, verosimilmente dovuto alla sostituzione dello stagno con il bromo.

Figura 3.2 Spettro 1_{H NMR (400MHz, CDCl}

3, 25°C) delmetil

5-bromo-2-(tert-butossicarbonil)amminopent-4-enoato

Una volta messa a punto la procedura per la formazione del metil (tert-butossicarbonilammino)pent-4-enoato, allo stesso modo è stato sintetizzato il benzil 5-bromo-2-(tert-butossicarbonil)amminopent-4-enoato, come mostrato nello schema 3.5.

50

Schema 3.5 Sintesi del benzil 5-bromo-2-((tert-butossicarbonil)ammino)pent-4-enoato.

La formazione dell’estere benzilico è stata condotta trattando l’acido con carbonato di potassio e bromuro di benzile in DMF, ottenendo il prodotto 93 con resa del 75%, dopo i consueti trattamenti di idrolisi ed estrazione con solvente, senza ulteriori purificazioni. L’idrostannazione di 93 è risultata meno efficiente della reazione condotta sull’altro substrato amminoacidico, restituendo il prodotto con una resa più bassa. La bromurazione invece è proceduta in modo sostanzialmente analogo fornendo il prodotto 95 con resa del 70%. In figura 3.3 sono riportati a confronto gli spettri protonici di 94 e 95.

Si può notare nello spettro in verde, effettuato dopo purificazione tramite cromatografia flash (SiO2, esano/etilacetato, 85/15), la scomparsa quasi totale dei segnali corrispondenti ai protoni

delle catene butiliche legate allo stagno. Dall’ingrandimento è anche evidente come i segnali a 5.8 ppm e 6.10 ppm, distinguibili nello spettro in rosso, siano invece sovrapposti nello spettro in verde, effetto dovuto probabilmente alla sostituzione dello stagno con il bromo.

51

Figura 3.3 Spettri 1_{H NMR (400MHz, CDCl}

3, 25°C) 94 (traccia rossa) e di 95 (traccia verde).

3.3.

Preparazione della Cbz-iodoalanina metilestere

Per ottenere l’organozinco ioduro, partner nucleofilo del coupling, è stato necessario sintetizzare l’opportuno derivato amminoacidico iodurato. A tale scopo come materiale di partenza è stata usata la L-serina, la cui funzionalità amminica è stata protetta come carbammato mentre la funzionalità carbossilica è stata protetta come metilestere.

52

Schema 3.6Reazioni di protezione della L-serina (96)

Le due reazioni sono state condotte di seguito78_{, senza purificazione dell’intermedio 98, ottenuto}

per reazione dell’amminoacido con il benzilossicarbonil cloruro in condizioni standard, che è stato fatto reagire nelle condizioni di formazione del metilestere. Il prodotto finale è stato ottenuto chimicamente puro dopo purificazione cromatografica con una resa modesta.

La formazione dello ioduro è stata realizzata mediante razione di Appel79 (Schema 3.7) effettuata sciogliendo la trifenilfosfina e l’imidazolo in DCM a 0°C, successivamente è stato aggiunto lo I2

in tre porzioni e la miscela è stata mantenuta in agitazione.

Schema 3.7 Reazione di Appel

Una soluzione di 99 in DCM è stata poi aggiunta lentamente alla miscela iniziale e mantenuta in agitazione a temperatura ambiente. La reazione è stata seguita mediante analisi TLC ed è apparsa completa dopo due ore. I coprodotti (trifenilfosfinossido e ioduro di imidazolio) sono stati rimossi,

53 dopo precipitazione, per filtrazione ed il prodotto 100 è stato ottenuto chimicamente puro dopo cromatografia flash, con rea del 79%; la sua identità è stata confermata mediante spettroscopia NMR. Lo spettro protonico (Figura 3.4) è in accordo con i dati di letteratura. Nello spettro è presente un segnale a 7.4 ppm, integrante per 5 protoni, relativo alla risonanza dei protoni aromatici, il segnale a 3.8 ppm, integrante per 3 protoni, dovuto alla risonanza dei protoni metossilici e il segnale a 4.5 ppm, che integra per un protone, relativo alla risonanza del protone sul centro stereogenico, ed infine il segnale a 5.10 ppm, che integra per 2 protoni, dovuto alla risonanza dei protoni del raggruppamento metilenico.

Figura 3.4 Spettro 1_{H NMR (400MHz, CDCl}

3, 25°C) del metil (S)-2-((benzilossicarbonil)amino-3-iodopropanoato

3.4.

Reazione di cross-coupling

Per la formazione del legame C-C, che porta all’ottenimento del bisamminoacido contenente il doppio legame, è stato impiegato il cross-coupling di Negishi, scelto per il largo uso nelle reazioni

54 di formazione di legame C-C che coinvolgono amminoacidi (vedi cap.2). Come ogni reazione di cross-coupling, impiega un catalizzatore metallico e si svolge in tre stadi: addizione ossidativa, transmetallazione ed eliminazione riduttiva (Schema 3.8).

Schema 3.8 Meccanismo cross-coupling di Negishi Per ottenere i bisamminoacidi

La scelta del catalizzatore impiegato nella maggioranza dei casi ricade sul Pd, un metallo che presenta come stadi di ossidazione stabili solo (0) e (+2), forma complessi non eccessivamente stabili che possono dissociarsi negli stadi successivi. Dato che i complessi di Pd (II) sono più stabili di quelli di Pd (0), vengono usati i primi come precatalizzatori, che nell’ambiente di forniscono il complesso di Pd (0) che entrerà poi nel ciclo catalitico. Nello stadio di addizione ossidativa si forma il primo legame tra Pd-C, il Pd si ossida a Pd (+2) e si ottiene il complesso che parteciperà alla transmetallazione dell’organometallo. Il meccanismo di addizione ossidativa prevede la formazione di un prodotto cis che poi isomerizza dando il più stabile prodotto trans80.

55 Nel caso di leganti bidentati questa isomerizzazione non avviene, contribuendo a rallentare la reazione81. Lo stadio successivo è la transmetallazione, il cui meccanismo di reazione non è completamente conosciuto. Secondo il modello messo a punto da Espinet e coautori82 nello studio della reazione di Stille, il meccanismo è di tipo associativo ciclico. Nel caso di leganti con un elevato ingombro sterico può esserci uno stadio di predissociazione del legante. Nello stadio di eliminazione riduttiva si forma il legame C-C e il palladio si riduce a Pd (0)81.

Un’attenzione particolare in questi tipi di cross-coupling è rivolta ai leganti, che devono avere da un punto di vista elettronico e sterico caratteristiche che favoriscano sia stadi in cui il Pd si comporta come nucleofilo (addizione ossidativa), sia stadi in cui si comporta come elettrofilo (eliminazione riduttiva). Per questo motivo sono impiegate generalmente le fosfine, con una particolare predilezione per le fosfine aromatiche: quelle alchiliche, infatti, sono troppo basiche e potrebbero in alcuni casi favorire solo lo stadio di addizione ossidativa, sfavorendo l’eliminazione riduttiva81_{; inoltre, si ossidano facilmente all’aria, cosa che rende difficile la conservazione e la}

manipolazione di piccole quantità.

L’organozinco ioduro necessario per il coupling si può ottenere per inserzione diretta dello zinco nel legame C-I. Perché ciò sia possibile è necessario utilizzare zinco attivato, che si ottiene “in situ” impiegando ad esempio clorotrimetilsilano83_{. La reazione di formazione della specie}

organometallica può essere seguita mediante analisi GC su un prelievo sottoposto ad idrolisi, osservando la scomparsa del precursore e la comparsa del prodotto di idrolisi. In genere una conferma al fatto che il prodotto idrolizzato derivi effettivamente dal reagente organometallico si ottiene attraverso il trattamento di un secondo prelievo con iodio (iodolisi) e analisi GC della soluzione: la ricomparsa del segnale dello ioduro di partenza conferma l’avvenuta formazione del reagente organozinco ioduro.

La reazione di formazione del reagente organometallico 102 è stata effettuata come descritto nello schema 3.8.

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Schema 3.8 Reazione di inserzione dello zinco.

In ambiente inerte, ad una soluzione di THF anidro e Zn (1.5eq) è stato aggiunto Me3SiCl (0.04eq)

e la miscela è stata mantenuta in agitazione per 10 minuti. Trascorso questo tempo, è stato fatto un prelievo analizzato mediante GC. È stata osservata la scomparsa del segnale corrispondente al precursore 101, che suggeriva l’avvenuta completa inserzione dello Zn. Non è stata però effettuata la iodolisi.

L’organozinco così ottenuto è stato immediatamente usato per la reazione di cross-coupling. A tale scopo in ambiente inerte, è stata preparata una miscela di 91, Pd2(dba)3 e SPhos in THF, che

è stata aggiunta alla soluzione contenente l’organozinco 102 (Schema 2.9). La reazione è stata mantenuta in agitazione a 50°C per 16 ore.

Schema 3.9 Reazione di cross-coupling. 91 (1eq), 101 (1eq), Pd2(dba)3 0.25%, SPhos 0.5%, THF

L’andamento della reazione è stato seguito mediante analisi TLC, che però ha sempre mostrato la presenza di due prodotti allo stesso Rf dei due precursori L’analisi 1H NMR effettuata sul grezzo di reazione, ha confermato la presenza dei precursori, o meglio del bromuro alchenilico e del prodotto di idrolisi dell’organozinco, indicando il fallimento della reazione. Il fallimento è stato attribuito a due possibili fattori: il legante SPhos che potrebbe formare un complesso con il

57 Pd così stabile da sfavorire la reazione dello stesso, il solvente THF, scarsamente coordinante che non stabilizzerebbe la specie organozinco, come fa invece un solvente più polare come la DMF.

Figura 3.1 Interazione composto organozinco con solvente non coordinante e con solvente coordinante

Tenuto conto di queste considerazioni è stato deciso di utilizzare la DMF come solvente e la triortotolilfosfina come legante del palladio. Inoltre è stata modificata anche la procedura di attivazione dello zinco, seguendo una procedura usata per un coupling di Negishi tra un organozinco ioduro simile a quello impiegato in questo lavoro ed il vinilbromuro84_.

L’organozinco ioduro 102 è stato quindi preparato secondo lo schema 3.9.

Schema 3.9 Reazione inserzione dello zinco

In un pallone in ambiente inerte, è stato posto Zn, Br2CH2CH2 e DMF. La miscela è stata scaldata

a 60°C e mantenuta in agitazione per 45 minuti. La soluzione è stata poi portata a temperatura ambiente, aggiunto TMSCl e mantenuta in agitazione per 40 minuti a 35°C. Alla soluzione di Zn attivato è stata aggiunta una soluzione di 101 in DMF. Dopo 10 minuti è stato effettuato un prelievo ed analizzato mediante GC. Si è notata la scomparsa del segnale corrispondente a 101, si è quindi proceduto con l’aggiunta dei reagenti per la reazione di cross-coupling, secondo lo schema 3.10.

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Schema 3.10 Reazione cross-coupling.

E’ stato usato come catalizzatore Pd2(dba)3 con un carico catalitico del 2% in moli e come legante

P(o-tol)3 (0.1eq), effettuato l’aggiunta di 91 a 0°C e poi portato la temperatura fino a 55°C per 14

ore. Il grezzo è stato purificato tramite cromatografia flash (ottenendo il prodotto con resa del 26%., che è stato caratterizzato mediante spettroscopia NMR.

Figura 3.5 Spettro 1_{H NMR (400MHz, CDCl}

59 Nello spettro protonico (figura 3.5) si può notare la presenza di tutti i segnali relativi alle risonanze dei protoni del prodotto 103. A 1.4 ppm è presente un unico segnale relativo alla risonanza dei protoni metilici dei due gruppi Boc che integra correttamente per 18 protoni, nella zona intorno a 7.5 ppm è presente il segnale dovuto alla risonanza dei protoni aromatici, mentre a 3.8 ppm è visibile il segnale relativo alla risonanza dei protoni del gruppo metossilico. Il segnale a 2.45 ppm che integra per 4 protoni è attribuibile alla risonanza dei protoni dei due raggruppamenti metilenici; il complesso sistema di segnali tra 5.0 e 5.5 ppm è attribuibile, sulla base del chemical shift e del valore dell’area integrata, alla risonanza dei protoni alchenilici, dei protoni benzilici e infine dei protoni ammidici. I due segnali a 4.37 e 4.32 ppm sono attribuibili alla risonanza dei protoni legati ai centri stereogenici.

Anche lo spettro 13CNMR conferma la formazione del prodotto di 103. Come si può notare dalla figura 3.6, si nota la presenza di due segnali a 172.5 ppm e a 171.9 ppm, attribuibili alla risonanza degli atomi di carbonio carbonilici esterei, mentre i due carboni carbonilici dei gruppi carbammato danno un unico segnale a 155.3 ppm. A 136 ppm e nella zona a torno a128 ppm si osservano i segnali dovuti alle risonanze degli atomi di carbonio aromatici. Gli altri segnali nella zona dei nuclei alifatici sono consistenti con la struttura del prodotto.

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Figura 3.6 Spettro 13_{CNMR (100 MHz, CDCl}

3, 25°C) di 103

Un’ulteriore conferma è stata ottenuta dall’analisi dello spettro bidimensionale COSY (figura 3.7), in cui si nota che il gruppo metossilico (3.8 ppm) e il Boc (1.4ppm) non presentano evidenti correlazioni; I segnali aromatici a 7.5 ppm correlano debolmente con i segnali tra 5.0 ppm a 5.25 ppm, che sono quindi attribuibili ai protoni benzilici. Gli stessi segnali tra 5.0 ppm e 5.25 ppm correlano con i segnali a 4.32 ppm e 4.37 ppm e, dato che l’area tra 5.0 ppm e 5.25 ppm integra per 4, possono essere attribuiti alla risonanza dei protoni alchenilici, oltre che a quella dei protoni benzilici I protoni tra 5.25 e 5.50, che correlano con i segnali a 4.32 e 4.37, possono essere assegnati ai protoni ammidici. Infine, i segnali a 4.32 e 4.37correlano anche con i segnali a 2.4 ppm che, a loro volta, correlano anche con i protoni alchenilici e quindi sono attribuibili alla risonanza dei protoni metilenici.