PROTOCOLLO PER LA PREPARAZIONE DI CILINDRETTI DI ALGINATO AL 2%
CONTENENTI MICROSFERE CARICHE DI RODAMINA
Prepariamo 3 tipologie di cilindretti di Alginato al 2% contenenti diverse concentrazioni di microsfere di PLA cariche di rodamina (Rod4)
1) Alginato 2% + PLA-Rod4 10 mg/ml 2) Alginato 2% + PLA-Rod4 35 mg/ml
3) On/Off Alginato 2% + PLA-Rod4 35mg/ml
PROCEDURA SPERIMENTALE
Risospensione microsfere PLA/PLGA
- Pesare la quantità desiderata di microsfere in Eppendorf (siccome andrò a fare una diluizione 1:1 con l’alginato dovrò pesare il doppio di microsfere rispetto alla concentrazione finale desiderata!)
- Aggiungere 1 ml di HEPES
- Risospendere le microsfere usando il bagnetto ad ultrasuoni (sweep; no temperatura; frq=80; pow=100) con acqua bi-distillata e ghiaccio (aggiungere ghiaccio appena si scioglie, l’acqua non deve riscaldarsi!)
- Vortexare ad intervalli regolari
Procedura di gelazione
- Mettere sulla piastra riscaldante un becker di vetro con H2O bi-distillata e immergere la sonda che controlla la temperatura
- Inserire nel becker la bottiglia con l’Alginato con tappo chiuso - Far riscaldare a 60-65°C in agitazione per qualche minuto - Colare l’Alginato in una siringa (siringa con ago che si avvita) - Prendere una siringa pulita e avvitare l’ago
- Aliquotare nella siringa pulita 1 ml di Alginato al 4% usando la siringa precedentemente caricata
- Aggiungere con la pipetta 1 ml di microsfere risospese (attenzione a non fare bolle) - Inserire un piccolo magnetino nella siringa
- Inserire il pistone ma solo appoggiandolo (attenzione a non far uscire l’aria)
- Mettere la siringa in agitazione sulla piastra magnetica fino a quando Alginato e miscrosfere non formano una miscela omogenea
- Togliere il pistone e rimuovere il magnetino aiutandosi con un altro magnete
- Inserire di nuovo il pistone, capovolgere la siringa e far uscire l’aria (attenzione a non far uscire il campione)
- Bagnare i filtri assorbenti con CaCl2, metterli in una piastra e appoggiare gli stampi
- Colare gocce di campione negli stampi cercando di esercitare con la mano sempre la stessa pressione (attenzione a colare in stampi uguali un uguale numero di gocce)
- Aggiungere CaCl2 nella piastra con il pipettatore automatico fino a sommergere completamente gli stampi
- Attendere qualche minuto che avvenga il crosslinking (15-20 min)
- Usare il fondo arrotondato di una Eppendorf da 1,5 ml per far uscire delicatamente i cilindretti di Alginato dagli stampi
Analisi di microscopia confocale
- Tagliare i cilindretti a fettine sottili con un bisturi, tenendo fermi i cilindretti con una pinzetta - Adagiare le fettine su un vetrino porta-oggetto precedentemente pulito con H2O bi-distillata - Ricoprire le fettine con un vetrino copri-oggetto
- Analizzare i campioni al microscopio confocale
Risultati
Alginato 2% + PLA-Rod4 10 mg/ml
Alginato 2% + PLA-Rod4 35 mg/ml
