2. Scopo della Tesi
Oggetto di questa tesi é stato lo studio di nuovi aspetti biochimici e funzionali di due enzimi glutatione-dipendenti: la γ-glutamil transferasi (GGT) e le glutatione transferasi omega (GSTO), da tempo studiati nei laboratori presso cui ho svolto la mia attività di ricerca.
In particolare, le nostre ricerche si sono sviluppate secondo le seguenti linee:
1) ruolo della γ-glutamiltransferasi (GGT) nell’uptake cellulare dell’acido ascorbico. 2) la traslocazione nucleare della GSTO1 come marker di progressione tumorale nell’Esofago di Barrett.
3) meccanismi d’espressione delle GSTO in linee cellulari umane.
Daremo di seguito ulteriori dettagli sulle premesse e gli obiettivi delle tre linee di ricerca.
1) Ruolo della γ-glutamiltransferasi (GGT) nell’uptake cellulare dell’acido ascorbico
Premesse:
A) Un uptake rapido ed efficiente di AA é stato descritto in molte linee cellulari tumorali umane. In particolare é stata suggerita la presenza nel compartimento extracellulare dei tumori di attività in grado di ossidare l’AA a DHA, favorendo pertanto l’uptake della vitamina C da parte delle cellule tumorali (vedi Introduzione); nessuna caratterizzazione di tale attività ascorbato-ossidasica é stata però fornita.
B) Un’alta attività di GGT è stata osservata in numerosi tumori maligni umani ed è da tempo considerata come un marker precoce di progressione neoplastica in modelli di carcinogenesi sperimentale. Questo ultimo aspetto ha portato ad ipotizzare che la GGT possa fornire alle cellule tumorali degli importanti vantaggi sia in termini di sopravvivenza che di crescita.
C) Numerose evidenze sperimentali raccolte nel nostro ed in altri laboratori hanno messo in evidenza come la GGT espleti un’importante azione "proossidante" nell’ambiente extracellulare. E' stato infatti osservato che cisteina e cisteinil-glicina, prodotti dell’attività dell’enzima, sono in grado di interagire con gli ioni dei metalli di transizione presenti in tracce nell'ambiente extracellulare promovendone la riduzione e innescando, di conseguenza, un ciclo redox con l’ossigeno con produzione di anione superossido ed acqua ossigenata.
Scopo del lavoro:
Alla luce delle suddette premesse, lo scopo del presente studio é stato quello di valutare se la GGT della plasma membrana possa esercitare un’attività ascorbato-ossidasica, consentendo l’uptake della vitamina C da parte delle cellule tumorali sotto forma di DHA. Dato il noto ruolo antiossidante dell’AA, tale fenomeno darebbe luogo ad un’aumentata resistenza delle cellule tumorali nei confronti di eventi ossidativi, compresi quelli indotti da molti farmaci antineoplastici e dalla radioterapia.
2) La traslocazione nucleare della GSTO1 come marker di progressione nucleare nell’Esofago di Barrett.
Premesse:
A) Gli adenocarcinomi rappresentano la più grave complicanza dell’esofago di Barrett: i pazienti con tale malattia hanno un rischio 30-125 volte più elevato di sviluppare un carcinoma esofageo rispetto alla popolazione generale. L’insorgenza del carcinoma é in genere preceduta da varie forme di displasia nell’epitelio metaplasico. Pertanto é di fondamentale importanza il riconoscimento della displasia nei pazienti con Esofago di Barrett.
B) Recentemente é stata descritta una nuova famiglia di proteine ampiamente diffuse nei mammiferi. A causa della loro omologia con le glutatione transferasi (GST), sono state incluse in una nuova famiglia denominata glutatione transferasi omega (GSTO). Per quanto appartengano alla superfamiglia delle GST, queste proteine non mostrano le tipiche attività delle GST, ma hanno viceversa tutta una serie di caratteristiche che le indicano come “stress response proteins” di piccolo peso molecolare, esercitando funzioni di protezione nei confronti di varie forme di stress ossidativo, chimico e termico.
Scopo del lavoro:
Considerate queste funzioni protettive delle GSTO, scopo del lavoro é stato quello di verificare se un’aumentata espressione delle GSTO o una loro traslocazione nel nucleo costituiscano un meccanismo di resistenza delle cellule all’ambiente ostile e
possano avere un ruolo determinante nella progressione dell’epitelio di Barrett verso la displasia e successivamente il cancro.
3) Meccanismi d’espressione delle GSTO in linee cellulari umane
Premesse:
A) Nonostante le Glutatione Transferasi-Omega siano state identificate da alcuni anni, niente é attualmente noto circa i meccanismi che portano all’espressione di queste proteine.
B) E’ noto che l’espressione di alcune GST è indotta da TNF-α tramite attivazione del fattore trascrizionale NFkB (Pinkus R. & al., 1996; Morceau F. & al., 2004). Inoltre nostri dati preliminari hanno mostrato un’aumentata espressione delle GSTO in linee cellulari in seguito a trattamenti tossici che comportano aumentato stress ossidativo, quali adriamicina e metil mercurio. E’ noto che un’aumentata produzione di specie attive dell’ossigeno può causare attivazione del fattore NFkB (Li N. & Karin M., 1999). E’ noto anche che il trattamento con TNF-α è uno dei modelli sperimentali più usati per indurre attivazione di NFkB (Delhalle S. & al., 2004). C) In studi preliminari abbiamo osservato in molte linee cellulari umane che l’aumentata densità cellulare porta ad una forte sovraespressione delle GSTO. L’espressione densità-dipendente é un meccanismo già noto per molte proteine, quali ad es. la hsp28, la hsp27, la fosfoenolpiruvatossichinasi, ecc. Sono stati trovati implicati, a seconda dei casi, numerosi meccanismi, quali l’instaurarsi delle
connessioni tra cellule o tra cellule e substrato, l’ipossia pericellulare, la produzione di fattori diffusibili come ad es. NO, il ciclo cellulare, ed altri.
Scopo del lavoro:
Lo scopo di questo studio é stato quello di indagare i meccanismi responsabili della espressione delle GSTO umane, in particolare:
a) il ruolo del TNF-α nell’espressione delle GSTO;
b) il ruolo della densità cellulare nell’espressione delle GSTO.
