In Arabidopsis una serie di ricerche hanno fornito informazioni su alcuni aspetti molecolari dell’embriogenesi zigotica e dello sviluppo del seme. In particolare, grazie all’isolamento e alla caratterizzazione dei geni LEC1 (Lotan et al., 1998), LEC2 (Stone
et al., 2001), L1L (Kwong et al., 2003) e FUS3 (Gazzarini et al., 2004), è stato
dimostrato che le proteine di tipo LEC sono essenziali durante le fasi precoci e tardive dell’embriogenesi zigotica (morfogenesi e maturazione). I risultati relativi allo studio dell’espressione in H. annuus del gene HaL1L sono quindi discussi soprattutto sulla base di quanto accertato in Arabidopsis. HaL1L è trascritto durante lo sviluppo dell’embrione zigotico soprattutto nelle prime fasi mentre il livello di trascrizione tende a decrescere in stadi più avanzati dell’embriogenesi. Ciò è in accordo a quanto osservato in Arabidopsis per i geni che codificano proteine di tipo LEC il cui livello di trascrizione varia in base allo stadio di sviluppo embrionale (Harada, 2001; Lotan et al., 1998; Kwong et al., 2003; Gazzarini et al., 2004; Kagaya
et al., 2005).
L’ibridazione in situ, condotta su sezioni di semi in sviluppo, ha fornito inoltre indicazioni significative sulla trascrizione di HaL1L in tessuti diversi dall’embrione. Analogamente a quanto osservato per il profilo d’espressione di LEC1 e AtL1L in
Arabidopsis (Lotan et al., 1998; Kwong et al., 2003), HaL1L è trascritto a livello
dell’endosperma, ma nel girasole HaL1L è espresso anche nelle cellule del tegumento e del tappeto. In questi domini cellulari, HaL1L è espresso in momenti diversi dello sviluppo del seme, sia a cinque che a dieci giorni dalla data di impollinazione, ed è quindi probabile che tale prodotto genico sia richiesto per un prolungato periodo di tempo. L’osservazione che HaL1L si esprime, in girasole, anche a livello dei tessuti materni può fornire un supporto indiretto all’ipotesi formulata da Harada (2001) che l’accumulo di trascritti per proteine LEC, non strettamente ristretto alle cellule dell’embrione zigotico, sia richiesto per la determinazione di una serie di condizioni molecolari idonee a promuovere l’embriogenesi. Come osservato per il gene L1L di
Phaseolus coccineus (Kwong et al., 2003), un basso livello di trascritti di HaL1L è
invece evidenziabile in ovari e ovuli non fecondati.
L’elevata trascrizione di HaL1L in domini cellulari molto specifici quali le cellule del tappeto e la finestra calazale suggeriscono un coinvolgimento del gene oltre che nella morfogenesi anche nelle varie fasi di maturazione dell’embrione compreso l’accumulo delle sostanza di riserva. Infatti, nel girasole le cellule del tappeto rilasciano nutrienti che attraverso l’endosperma vengono utilizzate nelle prime fasi di sviluppo dell’embrione (Newcomb 1973). Successivamente il disfacimento delle cellule nella regione antipodale (finestra calazale) facilita la diffusione di sostanze dal tessuto vascolare della regione terminale del funicolo alla regione calazale del tegumento (Newcomb, 1973; Forino et al., 2000). Sebbene la distribuzione dei trascritti di AtL1L e HaL1L sia simile sono state osservate alcune differenze nei tempi di accumulo dei messaggeri. Nelle fasi avanzate dell’embriogenesi i trascritti di
HaL1L risultano significativamente ridotte rispetto alle prime fasi di sviluppo mentre,
in Arabidopsis, il massimo accumulo dell’mRNA di AtL1L è evidente nello stadio cotiledonare ad U (Kwong et al., 2003). Questo distinto “pattern” di espressione potrebbe essere la conseguenza di differenze, fra il girasole e Arabidopsis, nello sviluppo embrionale e/o nella sintesi delle sostanze di riserva (Mazhar et al., 1998;
Fujiwara et al., 2002). Per esempio, alcune fasi caratteristiche dello sviluppo
embrionale di Arabidopsis, come la fase di ripiegamento cotiledonare ad U, non sono presenti nell’embriogenesi delle Compositae (Newcomb, 1973). Poiché i geni LEC controllano in maniera gerarchica l’accumulo delle proteine di riserva nel seme (Kagaya et al., 2005), è anche ipotizzabile che un livello di trascrizione elevato di
HaL1L nelle prime fasi dell’embriogenesi possa essere richiesto nel controllo della
sintesi dell’oleosina che in girasole avviene in embrioni molto giovani (Mazhar et al.,
Gli esperimenti di RT-PCR semiquantitativa hanno dimostrato che HaL1L si esprime a bassi livelli, anche in alcuni organi vegetativi e riproduttivi, in diversi momenti del ciclo vitale della pianta. Tuttavia, in considerazione dell’accumulo molto limitato di trascritti è plausibile supporre che HaL1L non abbia un ruolo primario in altri organi e/o tessuti di H. annuus. Un simile profilo d’espressione è stato ottenuto per il gene AtL1L di Arabidopsis (Kwong et al., 2003). Per quanto riguarda gli altri geni LEC, è stata verificata l’assenza di espressione per LEC1 e LEC2 in tessuti vegetativi di Arabidopsis (Lotan et al., 1998; Stone et al., 2001; Lee et al.,
2003), mentre FUS3 è espresso anche a livello delle silique (Gazzarini et al., 2004).
Nell’interpretazione dei risultati ottenuti mediante RT-PCR semiquantitative e ibridazioni in situ, deve essere tenuto conto del quadro molto articolato in cui agisce il peptide L1L, membro di un complesso trimerico (fattore NF-Y) nel quale rappresenta una subunita di tipo NF-YB (o HAP3). NF-Y è, infatti, un fattore di trascrizione a sua volta soggetto a regolazione nella capacità di legare il pentanucleotide CCAAT, ad esempio in stadi diversi di sviluppo o differenziamento e nella senescenza cellulare (Yun et al., 1999). La regolazione dell’attività di NF-Y s’instaura con meccanismi diversi. Il più evidente di questi agisce sulla disponibilità della subunità NF-YA, operando a livello post-trascrizionale, ma non è chiaro se attraverso la regolazione della traduzione o per degradazione della proteina. La quantità della NF-YA quindi limita la corretta costituzione del trimero, infatti sono stati identificati accumuli di NF-YB, da solo o nella forma dimerica con NF-YC, ma in assenza di NF-YA.
Altri meccanismi governano invece l’interazione del trimero NF-Y con proteine costituenti la cromatina (ad esempio gli istoni), o con fattori implicati nel meccanismo generale di trascrizione (ad esempio il complesso TFDII e TBP). L’interazione tra queste proteine è mediata principalmente dal motivo di ripiegamento istonico (HFM) presente in molte di esse e dalla loro complessiva
somiglianza con gli istoni. Come gli istoni, le subunita NF-YA e NF-YB, quindi potenzialmente anche HaL1L, possono essere modificate, dopo la traduzione, mediante ad esempio acetilazione o fosforilazione di specifici residui aminoacidici. Le modificazioni post-traduzionali cambiano i rapporti con e tra le code istoniche dei nucleosomi vicini, modulando ad esempio l’accesso ad altri fattori trascrizionali. Particolarmente importante per il nostro studio è il fatto che le evidenze sperimentali dimostrano come tutti i meccanismi sopra ricordati agiscano, disciplinando e modulando la funzionalità del trimero NF-Y, anche in situazioni in cui i messaggeri delle tre subunità (NF-YA, NF-YB, NF-YC) rimangono sostanzialmente costanti nelle quantità, (Mantovani, 1999).
Lo studio affrontato ha inoltre permesso l’isolamento, in H. annuus, dell’intero gene HaL1. La regione di DNA genomico dell’H. annuus da noi ottenuta si estende a monte e a valle di HaL1L fino a comprendere parte dei geni contigui. La ricerca eseguita in banca dati per le omologie di sequenza ha permesso di osservare che H.
annuus e A. thaliana condividono la posizione di L1L rispetto a regioni codificanti che
precedono e seguono. Infatti sono stati individuati come omologhi i geni immediatamente adiacenti all’ HaL1L e AtL1L, sia a monte che a valle, suggerendo che il frammento di DNA ottenuto in girasole sia omologo al corrispondente frammento del cromosoma V di A. thaliana.
Per quanto riguarda le regioni intergeniche solo quelle al 3’ sono paragonabili nella lunghezza, 353 bp in HaL1L vs 354 bp in AtL1L, mentre la regione intergenica al 5’ risulta più lunga in H. annuus che in A. thaliana (1601 vs 424).
La regione intergenica a monte è estremamente importante poiché sono qui localizzati gli elementi fondamentali per l’inizio e la regolazione della trascrizione, l’insieme dei quali definisce il promotore. Esso rappresenta una struttura dinamica che, grazie alla selezione delle sequenze regolative, è gene-specifica e quindi capace di generare un pattern di espressione unico per ciascun gene.
Approssimativamente il 30-50% dei promotori in A. thaliana è di tipo TATA per la presenza del così detto TATA-box, posizionato da 45 a 25 bp a monte del TSS. Il TATA-box sembra essere il più conservato dei segnali funzionali dei promotori dei geni eucariotici fortemente espressi, tuttavia non rappresenta un elemento universale. Promotori di ampi gruppi di geni, come geni housekeeping e geni implicati nella fotosintesi, mancano infatti di questo elemento e sono quindi detti TATA-less (Shahmuradov et al., 2003; 2005.)
L’esame della sequenza a monte di HaL1L ha permesso di individuare gli elementi caratteristici di un putativo promotore prossimale di tipo TATA-box. Per la loro identificazione è stato fondamentale conoscere l’intero cDNA, precedentemente ottenuto (Fambrini et al., 2006). Le informazioni ricavate dall’allineamento delle sequenze nucleotidiche del cDNA e del frammento di DNA, insieme alle indicazioni dell’analisi eseguita con il programma TSSP, hanno permesso infatti di individuare il putativo sito d’inizio della trascrizione (TSS). Esso è posizionato cinque nucleotidi a monte rispetto al primo nucleotide del cDNA ed ha costituito il punto di riferimento per la ricerca degli altri elementi tipici del promotore.
Sono risultati quindi presenti Y-Patch, CAAT-box in orientamento revertito, l’elemento CC che nelle piante è posizionato immediatamente a monte del TATA-box, due enhancer della trascrizione e anche due isole CG , Is1 (-700 /-500) e Is2 ( -153 /-52 ), che verranno discusse più avanti in questo paragrafo.
Una particolare attenzione è stata rivolta alla ricerca di indicazioni che suggeriscano possibili interazioni tra HaL1L ed altri fattori di trascrizione deputati alla sua stessa regolazione. Nelle piante, la regolazione della trascrizione è mediata da un grande numero di fattori di trascrizione, oltre 1500 conosciuti, che controllano l’espressione di decine o centinaia di geni bersaglio in varie cascate, talvolta interconnesse. L’interazione tra i fattori di trascrizione e i geni che essi devono regolare avviene mediante il riconoscimento da parte dei primi di sequenze
specifiche, dette motivi regolatori, a cui si legano. Nelle piante e in altri eucarioti superiori i motivi regolatori sono, in genere, localizzati nelle regioni non codificanti a monte dei geni, ma sono stati descritti anche negli introni e nelle regioni 5’/3’UTR, oltre che nelle regioni intergeniche a valle. Inoltre i motivi regolatori possono essere organizzati nei così detti cis-regulatory modules ciascuno dei quali definisce la cooperazione di diversi fattori di trascrizione (Vandepoele et al., 2006; Babu et al.
2004). Non tutti i motivi presenti sono tuttavia elementi funzionali attivi
simultaneamente, l’interazione tra i fattori di trascrizione e i relativi siti di legame dipende dai casi specifici. Solo in questo modo sono determinati i tempi e la localizzazione dell’attività trascrizionale, per assicurare uno specifico pattern spazio-temporale (Vandepoele et al., 2006).
Una ricerca per la presenza di motivi regolatori è stata quindi effettuata, sulle regioni intergeniche a monte e a valle di HaL1L e sull’introne, con diversi programmi disponibili in rete. Sono stati effettivamente individuati diversi motivi in tutte e tre le porzioni, ne vengono qui discussi alcuni che riteniamo essere particolarmente interessanti.
WUSATA: TTAATGG posizionato sul filamento (+) a -453 e nell’introne sul
filamento (-) a +904. A. thaliana presenta nella regione dell’introne di AGAMOUS un sito di questo tipo.
Il gene WUSCHEL (WUS) svolge un ruolo fondamentale nel meccanismo di omeostasi, che assicura il giusto bilanciamento tra cellule in via di differenziazione e cellule che devono rimanere pluripotenti nel meristema apicale del germoglio, attraverso l'interazione molecolare con i prodotti dei geni CLAVATA (CLV) (Clark et
al., 1993; Mayer et al., 1998; Laux et al., 2004).
Nell’apice caulinare, il dominio cellulare di espressione di WUS, che codifica per un fattore di trascrizione con un ruolo importante nel promuovere l’aumento del numero di cellule del meristema, è ristretto al centro di organizzazione dell'apice
meristematico, una piccola zona centrale situata in stretta prossimità del gruppo di cellule pluripotenti che esprimono CLV3. Sebbene il destino delle cellule pluripotenti dipenda dall'attività di WUS, l'espressione di CLV3 attiva un circuito a feedback negativo che coinvolge i prodotti di CLV1 e CLV2 che ha lo scopo di reprimere l'attività di WUS in corrispondenza del centro di organizzazione.
Il gene WUS svolge un ruolo analogo nei meristemi fiorali attraverso l’interazione con il gene AGAMOUS (AG), un gene MADS BOX (funzione C) che oltre a specificare l’identità dei carpelli e degli stami limita l’attività delle cellule pluripotenti nel fiore (Lohmann et al., 2001). AG è attivato dalla cooperazione di due fattori di trascrizione,
LEAFY e WUS (Parcy et al., 1998; Lohmann et al., 2001). In stadi più avanzati dello
sviluppo AG reprime WUS originando un circuito regolatorio a feedback negativo analogo all’interazione WUS/CLV attivo nei meristemi vegetativi (Lohmann et al.,
2001).
La presenza nel promotore del gene HaL1L di una sequenza “target” per WUS potrebbe suggerire un ruolo di WUS oltre che nei meristemi anche nella complessa rete di regolazione che controlla lo sviluppo dell’embrione zigotico. Non va peraltro dimenticato che la sovraespressione di questo gene induce la formazione, da cellule vegetative differenziate di strutture ectopiche di natura embriogenica (Zou et al.,
2002).
ARFAT, ARF (auxin response factor): TTGTCTC sul filamento (-) a + 13.
La presenza nel promotore di HaL1L di un sito di legame ARF (Auxin Response
Factor) suggerisce che la sua espressione possa essere in qualche modo controllata da
tali geni. Gli ARF sono infatti fattori di trascrizione che si legano a sequenze TGTCTC di promotori di geni che rispondono all’auxina e possono funzionare come repressori od attivatori trascrizionali (Tiwari et al., 2003). Il trasporto dell’auxina e la risposta a segnali auxinici sono eventi fondamentali nei primi stadi di sviluppo dell’embrione, quali la specificazione dell’asse apicale-basale, lo sviluppo della radice primaria e
dell’apice meristematico caulinare e la instaurazione dei domini cellulari da cui si origineranno i cotiledoni (Jürgens 2001; Jenik and Barton 2005; Tanaka et al. 2006). Per quanto riguarda l’interazione dell’auxina con i geni LEC è interessante ricordare come auxine sintetiche siano in grado di aumentare la penetranza fenotipica del mutante turnip di Arabidopsis (Casson e Lindsey, 2006), ma al tempo stesso è necessario sottolineare come l’attività ormonale non sia diretta a livello trascrizionale sul gene LEC1 ma preveda una attivazione di altri regolatori dell’embriogenesi quali
LEC2 e FUS3.
ABRETAEM (ABRE: ABA responsive element): GGACACGTGGCA, sul
filamento (-), a -80.
Le variazioni nel livello dell’ABA e il disseccamento dell’embrione prima dell’entrata in dormienza sono due aspetti fondamentali del processo di maturazione del seme. Nel promotore di HaL1L sono presenti sia cis-acting elements come ABRE (ABA-responsive element) sia elementi individuati in regioni promotrici di geni coinvolti nella disidratazione dell’embrione. L’ABA che controlla molti aspetti dello sviluppo di una pianta fra cui l’entrata in dormienza e la germinazione del seme, regola l’espressione genica soprattutto a livello trascrizionale (Busk e Page, 1998). E’ stata dimostrata una stretta relazione tra espressione di geni LEC e tale ormone. In particolare è stato dimostrato che FUS3 influenza la sintesi di GA e ABA e questi ormoni con un effetto a feedback regolano la stabilità della proteina FUS3 (Gazzarini
et al., 2004). In mutanti fus3 si ha infatti una riduzione del rapporto ABA/GA, mentre
l’espressione costitutiva di FUS3 risulta in un incremento di tale rapporto ormonale. Nella regione al 3’ del gene sono stati inoltre individuati siti di terminazione della trascrizione e di taglio per l’aggiunta della coda di poliadenilazione che hanno consentito di circoscrivere una porzione della sequenza genomica corrispondente ad un putativo trascritto. Esso conferma la sequenza del cDNA e rivela una organizzazione introni/esoni analoga a quella dell’A. thaliana. In entrambe le specie
ad interrompere la sequenza codificante l’L1L, è infatti presente un introne di lunghezza tuttavia diversa: 864 bp per HaL1L e 210 bp per AtL1L.
E’ interessante sottolineare che oltre ai segnali di poliadenilazione nucleare, è stato individuato anche un segnale di poliadenilazione citoplasmatica. L’ipotesi che HaL1L possa essere soggetto ad una regolazione post-trascrizionale, che implica l’inattivazione temporanea dell’ mRNA disponibile comunque per la traduzione in fasi successive dell’embriogenesi, può essere interessante anche alla luce dei risultati ottenuti con l’ibridazione in situ, che hanno evidenziato un segnale di marcatura a livello di alcuni tessuti materni nei primi stadi di sviluppo dell’embrione (tegumenti, finestra calazale). Un parallelo è forse ipotizzabile con il meccanismo di immagazzinamento di messaggeri per gli istoni nell’oocita di Xenopus e altre specie che divengono disponibili nelle prime divisioni dello zigote (Anderson et al., 1980;
Woodland, 1980; Graves, 1985; Arnold et al., 2008), visto anche che le sub-unità
NF-YB delle quali fa parte L1L sono da ritenersi in qualche modo correlate con la classe degli istoni con i quali condividono l’histone fold motif. D’altra parte l’importanza di poli(A)polimerasi (PAP) capaci di poliadenilare nel citoplasma gli mRNA, che hanno già subito nel nucleo una prima poliadenilazione, è stata documentata nei primi stadi di sviluppo in molte specie animali, sia vertebrati che invertebrati, ma anche vegetali come ad esempio negli embrioni di grano e vigna (Rothnie, 1996). La maturazione degli oociti negli animali e lo sviluppo degli embrioni delle piante sono ugualmente soggette ad un controllo ormonale e le proteine PAP cadono in una delle cascate di trasduzione del segnale coinvolte. In particolare durante lo sviluppo embrionale l’attività delle PAP è stimolata dalle gibberelline (GA), ma inibita dall’ABA e dalle auxine, (Rothnie, 1996). E’ interessante ricordare come nel promotore di HaL1L siano presenti siti di legame ARF e ABRE, che suggeriscono un coinvolgimento dell’ABA e delle auxine nel controllo trascrizionale di questo gene.
Tra gli elementi identificativi la regione del promotore si ritrovano le cosi dette Isole CpG che sono soprattutto nell’uomo ben identificabili grazie al contenuto relativo in CG superiore al 50%. Sequenze con queste caratteristiche sono particolarmente interessanti perché sono coinvolte in meccanismi di regolazione della trascrizione che si instaura attraverso la metilazione di residui di citosina. Per le piante il quadro è complicato sia per quanto riguarda le percentuali più basse di CG presenti delle isole, sia per il fatto che anche citosine presenti nei siti CNG, CNNG e CH (dove H rappresenta i nucleotidi C, A, T) possono essere sede di metilazioni specifiche.
Lo studio della metilazione di queste regioni è affrontabile con diverse strategie. Per questa tesi si è scelto di utilizzare una tecnica che prevede il trattamento del DNA con sodio bisolfito, per la conversione di citosine non metilate in uracile, in modo da poterle distinguere dalle non metilate.
Ciascuna sequenza genomica richiede l’individuazione di condizioni di trattamento specifiche per cui è stato necessario inizialmente mettere a punto protocolli idonei. Complicazioni derivano dal fatto che non tutti i primer sono idonei a discriminare filamenti modificati dai non modificati inoltre, molti sono gli artefatti che possono crearsi nelle amplificazioni stesse, soprattutto per la mancanza di complementarietà tra i filamenti +/- del DNA dopo il trattamento con sodio bisolfito. (Warnecke et al. 2002; Grunau et al. 2001). Infine la procedura richiesta per valutare la reale efficienza del trattamento e l’idoneità dei primer richiede il clonaggio degli amplificati, la selezione dei cloni e l’analisi dei cloni stessi eseguita manualmente o con i programmi CyMate e BioQ. D’altra parte solo il trattamento con il sodio bisolfito permette di analizzare contemporaneamente un numero elevato di residui di citosina che possono essere coinvolti in pattern specifici di metilazione. Un’analisi di questo tipo dovrà comunque essere confermata con altri approcci sperimentali.
Le indagini condotte mediante RT-PCR semiquantitativa e ISH indicano che la quantità di trascritto del gene HaL1L è massima negli embrioni a cinque giorni dall’impollinazione, mentre sembra essere praticamente nulla nelle foglie. In questo organo, l’HaL1L risulta quindi praticamente silente, condizione che presuppone uno stato di ipermetilazione delle citosine rispetto allo stato embrionale dove il gene è attivo. Un confronto preliminare dello stato di metilazione del DNA degli organi suddetti è stato quindi condotto utilizzando la deaminazione delle citosine non metilate mediante trattamento con sodio bisolfito. I dati ottenuti suggeriscono che effettivamente una regolazione epigenetica di questo tipo può instaurarsi a carico di
HaL1L durante l’embriogenesi poiché sono stati individuati nell’isola IS1 residui di
Conclusioni
Le osservazioni significative derivate dall’elaborazione di questa tesi sono molteplici. E’ stato infatti possibile dimostrare il coinvolgimento di HaL1L nello sviluppo dell’embrione zigotico di girasole. In particolare, l’analisi della trascrizione di HaL1L suggerisce il ruolo chiave di questo gene sia nelle prime fasi dello sviluppo embrionale (stadio globulare) sia in fasi morfogenetiche più avanzate (stadio cotiledonare). Inoltre, l’elevata trascrizione di HaL1L in domini cellulari molto specifici quali le cellule del tappeto e la finestra calazale suggeriscono un coinvolgimento del gene anche nelle varie fasi di maturazione dell’embrione compreso l’accumulo delle sostanza di riserva. Infine, lo studio delle caratteristiche della sequenza nucleotidica del gene HaL1L lasciano ipotizzare sia un meccanismo di controllo trascrizionale, operato dalla metilazione di residui di citosina nella regione del promotore, sia post-trascrizionale mediante la sottrazione del messaggero alla traduzione.
L’analisi dello stato di metilazione dei residui di citosina sarà estesa a tutta la regione intergenica al 5’ dell’ HaL1L, a partire da DNA di stadi embrionali diversi scelti sulla base delle informazioni derivate dagli studi trascrizionali. I risultati ottenuti dovranno inoltre essere confermati da un’ indagine più dettagliata condotta mediante deaminazione delle citosine metilate con sodio bisolfito, ma anche con altre strategie sperimentali. Ad esempio, ove possibile, saranno condotte ibridazioni su
Southern blot di DNA tagliati con enzimi di restrizione che siano sensibili alla
metilazione e specifici per sequenze contenenti i residui di citosina individuati con trattamenti con sodio bisolfito. Gli stessi digeriti potranno più rapidamente essere
taglio e che permettano solo amplificazione di DNA integro. Inoltre sarà iniziato uno studio per l’individuazione e caratterizzazione di proteine PAP che possano essere coinvolte nella regolazione della traduzione dell’mRNA messaggero.
