Riassunto
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RIASSUNTO
La senescenza replicativa è un destino a cui vanno incontro spontaneamente fibroblasti primari di mammifero in coltura perché esposti a stimoli mitogenici prolungati che attivano la trascrizione dei geni p19ARF e p16 del locus INK4A. Un gene che controlla l’espressione di p19ARF è il fattore di trascrizione LRF (leukemia/leucocytosis related factor) Da studi preliminari è stato visto che il 3’ UTR del messaggero del gene LRF possiede molti siti di legame per diverse famiglie di microRNA, piccoli frammenti di RNA non codificante che regolano i livelli dei loro targets attraverso l’inibizione della traduzione del messaggero. Fra questi abbiamo scelto i microRNA miR-100 e miR-125b. Lo scopo di questa tesi è stato quello di verificare se i miR-100 e miR-125b controllano l’espressione di LRF in fibroblasti embrionali di topo (MEF).
Per fare questo s cellule HEK 293T sono state cotrasfettate con il plasmide esprimente miR-100 o miR-125b assieme al plasmide contenente il 3’ UTR di LRF clonato a valle della sequenza che codifica per la eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein). Attraverso questo test di validazione eterologa, si è visto che i due microRNA controllano l’espressione di LRF a livello post-trascizionale.
Il passo successivo è stato quello di trasfettare cellule MEF (Mouse Embryo Fibroblasts) a passaggi precoci con miR-100 o con miR-125b maturi per caratterizzare gli effetti molecolari della sovra-espressione nelle MEF di questi due microRNA. La proteina LRF viene ridotta in risposta alla sovra-espressione dei due microRNA, mentre i livelli del messaggero restano costanti; questo prova che i miRNA suddetti riducono l’espressione di LRF a livello post-trascizionale, e non al livello trascrizionale.
Sono stati inoltre valutati i livelli del messaggero e della proteina p19ARF e di altri marcatori di senescenza quali p21, E2F1 e p16.
In risposta alla riduzione della proteina LRF indotta dalla sovra-espressione di miR-100 o di miR-125b, si osserva un aumento di circa 3 volte dell’attivazione trascrizionale di p19ARF, e conseguente aumento della proteina p19ARF. L’ attivazione dell’espressione di p19ARF correla con
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un aumento della proteina p21, un inibitore delle cicline. Inoltre si osserva una diminuzione dei livelli del fattore E2F1 (fattore centrale nella progressione del ciclo cellulare), mentre i livelli di p16, un altro inibitore delle cicline, restano costanti.Siccome la senescenza dipende dall’attivazione dell’asse p19ARF-p21, le è stata misurata la percentuale di cellule senescenti.
Nonostante l’induzione dell’asse p19ARF-p21 le cellule trasfettate con miR-100 e miR-125b non vanno incontro a senescenza, anzi proliferano più delle MEF di controllo Questi risultati sono almeno in parte in conflitto con quelli ottenuti con il miR-20, la cui sovra-espressione nelle MEF riduce l’espressione di LRF ed anticipa l’insorgenza della senescenza.
In conclusione, l’inibizione dei livelli di LRF con miRNA appartenenti a famiglie diverse non è sufficiente per indirizzare le cellule verso un destino comune. La complessità delle azioni regolatorie mediate dai microRNA sta probabilmente nella diversità dei targets, la cui modulazione porta a risposte cellulari diverse per ogni microRNA preso in considerazione.
