riassunto
RIASSUNTO
Questa tesi sperimentale fa parte di un progetto di ricerca finalizzato ad individuare i geni candidati ad essere differenzialmente espressi a livello dell’amigdala e dell’ippocampo di ratti sottoposti al paradigma comportamentale del contextual fear conditioning (CFC).
Molto di ciò che è noto sulla memoria emozionale deriva dall’applicazione del classical fear conditioning. Tale paradigma comportamentale dipende esclusivamente dall’attivazione dell’amigdala; il CFC richiede, invece, l’attivazione sia dell’amigdala che dell’ippocampo. Animali sottoposti al (CFC) mostrano freezing ogni volta che sono inseriti nell’apparato di condizionamento (retrieval test) e tale risposta perdura per 4 settimane.. Inoltre in slices di ippocampo del cervello di ratti condizionati è stato osservato un aumento (fino a sette giorni) dell’eccitabilità ippocampale. Tale effetto duraturo nel tempo ha suggerito l’ipotesi di una sintesi differenziale di mRNA che possa portare alla modulazione o alla neosintesi di proteine nel sistema nervoso di ratti in seguito al condizionamento. A tal fine abbiamo utilizzato la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (suppression subtractive hybridisation, SSH). L’SSH rappresenta un efficiente metodo che, tramite la costruzione di librerie sottrattive di cDNA, permette l’isolamento delle sequenze differenzialmente espresse in seguito al trattamento in esame. In particolare, l’efficenza della SSH consiste nella capacità di isolare anche trascritti più rari, non evidenziabili con altre tecniche che analizzano pattern di espressione genica.
A 48 ore di distanza dal condizionamento i cervelli sia degli animali condizionati che di controllo (animali mai entrati nell’apparato di
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condizionamento, naïve) sono stati estratti e sezionati in tre parti:
anteriore, medio-temporale (comprendente ippocampo e amigdala) e il cervelletto. L’RNA poli(A)+ estratto dalle sezioni medio-temporali sia dei ratti condizionati che naïve è stato utilizzato per la costruzione delle librerie sottrattive di cDNA.
Dopo aver valutato l’efficienza della sottrazione, i cDNA sono stati clonati e sottoposti a screening.
Le sequenze dei cloni differenziali, ottenute con sequenziatore automatico, sono analizzate mediante comparazione con le sequenze depositate nelle banche dati tramite programmi come FASTA, BLASTX e BLASTN.
Da tale studio è emerso che le sequenze dei cloni candidati ad essere modulati dal CFC hanno mostrato una elevata omologia con sequenze di DNA codificante per proteine note, quali la Tripartite motif protein 32, la Proteasome maturation protein e la Type-Iα regulatory subunit of cAMP dependent protein kinase. L’analisi di espressione di questi trascritti è stata valutata con RT-PCR relativa.
