Materiali e Metodi
1.1 Protocollo sperimentale.
Lo studio è stato condotto su 58 pazienti di cui 19 maschi e 41 femmine, di età media di 48 anni. I pazienti sono stati divisi in tre gruppi:
Gruppo 1: composto da 37 pazienti che al momento della visita
allergologica non presentano sintomi suggestivi di un pregresso contatto con l’Anisakis e quindi da poter considerare come soggetti sani, ovvero il controllo negativo dello studio;
Gruppo 2: composto da 15 pazienti che al momento della visita
allergologica presentavano sintomi correlabili ad un contatto con Anisakis.
Gruppo 3: composto da 6 pazienti che presentavano sintomi specifici che potevano far supporre ad una Anisakidosi.
I criteri di inclusione dei pazienti erano stati:
Ipereosinofilia;
Orticaria, angioedema, dispnea, dolori gastrointestinali dopo ingestione di pesce;
Positività del Prick test di A. simplex;
Positività delle IgE specifiche nel siero per A. simplex.
raccolta dell’anamnesi sia dell’esecuzione dei prick test, venivano sottoposti ad un prelievo di sangue venoso.
Sul campione, conservato ad una temperatura variabile tra 2°C a 8°C, è stata valutata la concentrazione di IgE specifiche per l’allergene dell’Anisakis (p4) mediante il sistema automatizzato ImmunoCAP 250.
Nel nostro laboratorio il dosaggio viene effettuato il giorno stesso o quello successivo al giorno del prelievo. Se l’allergene non è disponibile, il campione biologico viene conservato a -20°C. Il campione di sangue viene centrifugato a 3500 rpm per 5’ ed il siero, così ottenuto, trasferito in apposite provette da dosaggio (12/75). La quantità di siero necessaria è 40 µl per allergene testato.
1.2 Metodo.
Il primo test realizzato per il dosaggio delle IgE allergene-specifiche fu il Radio- Allergo-Sorbent Test o RAST il quale prevede che l’allergene sia legato ad una fase solida che viene incubata con il siero/plasma in esame. Gli anticorpi IgE presenti nel campione e specifici per quell’allergene si legano all’allergene insolubilizzato ed il grado di reazione viene quindi misurato mediante l’aggiunta di un anticorpo anti-IgE umane radiomarcato.
In seguito sono stati costituiti test similari che evitano l’uso di reagenti radioattivi.
Nel nostro laboratorio, per l’esecuzione del dosaggio delle IgE specifiche, si
sfrutta un sistema diagnostico in vitro che utilizza particolari pozzetti,
contenenti l’estratto allergenico in studio, denominati Immunocap (Fig. 1.2.1).
L’immunocap è formato da una fase solida costituita da un derivato della cellulosa contenuto in una capsula, che presenta una struttura porosa con elevata capacità legante, circa 150 volte più elevata della superficie interna tradizionale coated tube, questo, insieme ad altre peculiari caratteristiche dell’immunoCAP, conferisce al sistema elevata velocità, precisione, riproducibilità che contribuiscono ad una superiore sensibilità e specificità del dosaggio.
Il test è strutturato come un immunodosaggio ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) eterogeneo a “sandwich”.
La tecnica ELISA viene definita eterogenea perché si svolge completamente in fase liquida ma si avvale di antigeni o anticorpi adesi alla fase solida. Il temine
“sandwich”, invece, indica che nell’ELISA l’anticorpo o l’antigene ricercato, vengono intrappolatati rispettivamente tra due antigeni o tra due anticorpi: uno adeso alla fase solida ed un secondo che risulta essere coniugato con l’enzima (Fig. 1.2.2).
La metodica ELISA con cui si esegue il dosaggio per le IgE specifiche prevede la ricerca degli anticorpi.
Figura 1.2.1. Struttura immunocap.
1.3 Immonocap 250.
Lo strumento utilizzato nel nostro laboratorio per il dosaggio delle IgE specifiche, è l’Immucap 250 (Fig 1.3.1) un analizzatore, ad accesso continuo e random, completamente automatizzato che gestisce tutte le fasi dell’analisi, dalla dispensazione dei campioni alla misurazione della fluorescenza.
Figura 1.3.1. Sistema ImmunoCAP 250.
Figura 1.2.2. Immunodosaggio a sandwich.
Il siero del campione in esame viene dispensato nel pozzetto contenente l’allergene di interesse, il quale si legherà in maniera specifica alle IgE del campione eventualmente presenti. I volumi usati per ogni singolo pozzetto sono:
40 µl di siero;
50 µ l di coniugato IgE specifiche;
50 µl di soluzione di sviluppo;
600 µl di soluzione di stop.
Dopo un’incubazione a 37°C viene effettuato un primo lavaggio per rimuovere tutto quello che non si è legato alla fase solida. Successivamente si aggiunge il coniugato, costituito da anticorpi monoclonali di topo anti-IgE coniugati con un enzima, la β-galattosidasi (che ci permetterà di catalizzare la reazione).
Dopo una seconda incubazione a 37°C si effettua un lavaggio per eliminare gli anticorpi marcati non legati, mentre il complesso legato è incubato a 37°C con un agente di sviluppo (4-metilubelliferim-β-D-galattosidase allo 0,01%) che
reagisce con l’enzima sviluppando una reazione fluorescente.
La reazione si arresta mediante l’utilizzo di una soluzione stoppante (soluzione acida). Successivamente a questa fase, viene misurata la fluorescenza dell’eluato automaticamente dallo strumento.
Tanto più elevata è la concentrazione di IgE specifiche presenti nel campione in esame, tanto maggiore sarà la fluorescenza misurata.
Per la valutazione dei risultati, le fluorescenze misurate nei campioni vengono
trasformate in concentrazioni mediante l’uso di una curva di calibrazione (fig.
Quest’ultima è costituita da alcuni standard a concentrazione nota che vanno a costituire un grafico, dove sull’asse delle ascisse sono riportate le concentrazioni dei diversi standard dosati, mentre sull’asse delle ordinate è riportata la fluorescenza rilevata.
La fluorescenza dei campioni in esame viene riportata sul grafico e per confronto si ottengono le relative concentrazioni. Nel test vengono inoltre eseguiti un controllo positivo ed uno negativo.
I risultati vengono espressi in unità anticorpali allergene-specifiche (KUA/l).
Un valore di dosaggio maggiore di 0,100 KUA/l indica la presenza di Fig. 1.3.2. Curva di calibrazione , i valori sono espressi in kU
A
