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Capitolo 2 : Materiali e metodi
2.1 Preparazione degli scaffolds
La prima fase del processo di ingegnerizzare del muscolo scheletrico in vitro ha riguardato la realizzazione di matrici, sia sintetiche che naturali, su cui testare adesione, crescita e differenziamento di linee cellulari di mioblasti murini.
2.1.1 Polimeri sintetici
Sono stati realizzati quattro tipi di polimeri, denominati PLLA 10%, BLEND, PCL 20% e PLGA 20%, sotto forma di film grazie all’utilizzo di uno Spin Coater. Lo Spin Coater è un dispositivo che sfrutta la forza centrifuga per ottenere delle superficie con spessore omogeneo e controllato in funzione della viscosità del materiale. E’ composto da un piatto rotante al centro di un incavo circolare, chiuso da un coperchio trasparente, sul quale viene posizionato un vetrino e colata la soluzione di polimero in quantità opportuna tale da ricoprire tutto il vetrino. Il piatto rotante è dotato di un foro centrale che permette di tenere il vetrino bloccato allo stesso tramite una pompa a vuoto, anche a rotazioni elevate. La velocità e il tempo di rotazione sono imposti in modo tale da ottenere lo spessore desiderato. Trascorso il tempo di lavoro, si stacca la pompa a vuoto e si recupera il vetrino con il film.
Materiali
- Spin Coater (Delta 10,Suiss Microtech,Switzerland) - pompa a vuoto
- Poli (l-acido glicolico) (PLGA) (LACTEL® Polymers)
- Poli (l- acido lattico) (PLLA) (300,00 MW Boehringer,Ingelheim,Germania) - Poli (Ɛ-caprolattone) (PCL) (65,000 MW; Sigma,Milan;Italia)
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- Cappa chimica - Becker
- Magnete
- Bilancia analitica (Mettler AE 240)
- Agitatore magnetico (ARE Heating Magnetic Atirrer, Velp Scientifica) - Pipette Pasteur in vetro
- Vetrini portaoggetti (Deckglaser; Cover Glasses) - Etanolo 70% (Sigma, Milan; Italia)
- Degasatore (Mazzali 20052)
Procedura
Per la preparazione dei polimeri nelle concentrazioni sopracitate sono stati disciolti in 10 ml di cloroformio rispettivamente 1 g di PLLA, 2g di PCL e 2g di PLGA pesati con bilancia analitica. Il blend, costituito da una miscela di PLLA 10% e PCL 20% è stato realizzato pesando separatamente 2 g di PLLA e 4 g di PCL; entrambe le sostanze sono state sciolte in 10 ml di cloroformio e miscelate insieme a temperatura ambiente raggiungendo un volume totale di solvente pari a 20 ml. I polimeri sono stati miscelati in maniera omogenea per mezzo dell’agitatore magnetico, per un tempo variabile da un minimo di 30 minuti (es. PLLA) ad un massimo di 6 ore (es. PCL, Blend). In seguito ad ogni utilizzo tutte le soluzioni sono state conservate ad una temperatura di 4°C per evitare la degradazione dei polimeri.
Per la realizzazione delle matrici sotto forma di film ci si è avvalsi dell’utilizzo dello Spin Coater.Un volume di polimero è stato depositato con pipetta Pasteur su vetrini quadrati puliti dalla polvere con etanolo 70% e poi asciugati, e “spinnato” con i seguenti parametri: per il primo step, adibito alla distribuzione della soluzione polimerica sul vetrino, si è programmata una velocità di 1000 giri per 10 secondi per
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il secondo step, atto ad omogeneizzare lo spessore, è stata selezionata una velocità di 1000 giri per 15 secondi.
I vetrini sono quindi stati messi a degassare per almeno 1 ora in modo tale da eliminare il cloroformio residuo e successivamente staccati dal vetrino tramite veloce bagno in acqua. In seguito i film sono stati tagliati ognuno in quattro e utilizzati per la semina delle cellule o in alternativa per le prove meccaniche.
2.1.2 Polimeri naturali a base di gelatina-genepina
Per questo tipi di tesi come polimeri naturali sono stati realizzati scaffolds a base di gelatina in diverse concentrazioni cross-linkata con genepina.
Materiali
- Gelatina (Sigma)
- Tampone PBS (costituito da 8,01 g di NaCl, 0,20g KCl, 1,78g Na2HPO4∙2H2O e
0,27 g di KH2PO4 in un litro di acqua deionizzata)
- Collagene purificato da code di ratto [1] (concentrazione in 60mg/ml)
- Genepina (Sfida Bio Co., Ltd)
- Agitatore magnetico (ARE Heating Magnetic Atirrer, Velp Scientifica)
- Bilancia analitica (Mettler AE 240)
- Termometro - Magnete - Becker 100 ml - Becker 50 ml - Multiwell da 6 Procedura
Sono stati preparati scaffolds a diverse concentrazioni di gelatina in PBS ovvero gelatina al 10%, al 7,5%, al 5%, al 4% e al 3%, ottenuti per diluizione di una
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soluzione madre di gelatina al 10% in PBS. Tale soluzione è stata preparata sciogliendo 4 g di gelatina in polvere in 40 ml di tampone fosfato per un ora a 70°C in agitazione. La soluzione di gelatina (a varie concentrazioni) è stata posta in un becker immerso in bagno maria e fatta cross-linkare mediante l'aggiunta di genepina in concentrazioni in peso pari allo 0,1% e/o 0,2%, rispetto al volume totale della soluzione di gelatina. La reazione di cross-linkaggio è stata fatta partire a 40°C e successivamente portata avanti ad una temperatura controllata di 37°c sotto agitazione meccanica. La reazione è stata seguita dal punto di vista colorimetrico. L’inizio della reazione comporta un viraggio iniziale del colore della preparazione dal trasparente al marrone e la reazione è stata considerata terminata al raggiungimento di una colorazione blu-verdastro.
Inoltre, per favorire ulteriormente l’adesione cellulare, è stato realizzato anche un campione a base di gelatina, collagene e genepina. Questo è stato ottenuta miscelando a 37° C la soluzione di gelatina al 5% con pari volume di soluzione di collagene 0,02 N in acido acetico e successivamente aggiungendo 0.1% oppure 0.2% di genepina, rispetto al volume totale della soluzione. In questo caso è stato molto importante il controllo delle temperatura, per evitare la denaturazione del collagene a temperature superiori di 37° C.
Per la caratterizzazione meccanica 6 ml di ciascuna soluzione sono state colate in un pozzetto di una multiwell da 6 e lasciate polimerizzare per 48h a temperatura ambiente.
2.2 Caratterizzazione meccanica degli scaffolds
Uno degli obiettivi dell’ingegneria tissutale è quello di progettare matrici con le stesse caratteristiche fisiche del tessuto da sostituire. In questo contesto gli scaffolds devono favorire l'adesione cellulare e promuovere la colonizzazione su
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tutta la struttura, garantendo una rigidezza in grado pari a quella del tessuto muscolare .
Per misurare le proprietà meccaniche di tali supporti cellulari sono state svolte prove di stress-strain in trazione per i polimeri sintetici e in compressione per i polimeri naturali per mezzo dello strumento Zwick / Roell mod. Z005. Le prove consistono nel sottoporre un oggetto ad una forza esterna (F)per valutare, la sua deformazione rispetto alla lunghezza iniziale del campione (l - l0/l). Il tipo e l'entità
della deformazione dipendono dalla forza applicata, dalle caratteristiche del materiale e dalla forma dell'oggetto. I provini realizzati con gli scaffolds naturali sono stati cilindrici mentre a forma di strisce sottili quelli realizzati con gli scaffolds sintetici. La sollecitazione meccanica si basa sull'applicazione di una forza F che produce una modifica dimensionale L del provino senza modificare essenzialmente la forma. La forza utilizzata in questo lavoro è stata di 2 tipi, di trazione e di
compressione. Nelle prove di compressione si è applicato uno sforzo costante al
provino e si è misurata la deformazione nel tempo. La prova di trazione consiste nell’applicazione istantanea di un carico al provino misurando la deformazione nel tempo e misurazione del carico per mantenere la deformazione nel tempo.
2.2.1 Caratterizzazione meccanica scaffolds sintetici
I dati rappresentano dei risultati ottenuti da altri lavori di tesi.
2.2.2 Caratterizzazione meccanica scaffolds naturali
Materiali
- campioni di gelatina-genepina all’interno di multiwell da 6
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- cilindro metallico di diametro circa 15 mm
- spatola metallica - carta per asciugare
- Zwick / Roell mod. Z005 (Zwick GmbH & Co, Germania)
- calibro
Procedura
Con l’aiuto del cilindro metallico sono stati ritagliati da ciascun pozzetto della multiwell da 6 tre campioni da caratterizzare dal punto di vista meccanico. Il diametro e l’altezza dei campioni sono stati misurati con esattezza usando un calibro a corsoio, successivamente i provini sono stati posti sulla piastra Petri (aiutandoci con la spatola metallica), asciugati dalle goccioline di acqua rilasciate dal campione stesso, e analizzati per compressione per mezzo della macchina Zwick / Roell mod. Z005 (Zwick GmbH & Co, Germania) con i seguenti parametri:
cella di carico da 10 N
velocità di deformazione 0.07 mm / s;
termine della fase di carico: 10% strain (rispetto alla lunghezza iniziale del campione);
I moduli elastici sono stati calcolati dal primo tratto lineare della curva di
stress- strain, considerando un allungamento di circa il 4%.
2.3 Preparazione delle strutture allineate
Da una prospettiva biomimetica, un tessuto muscolare scheletrico ingegnerizzato ideale deve essere in grado di mimare l'architettura del muscolo e quindi essere adeguatamente grande e spesso ed essere, costituito da miofibre dense e con orientamento unidirezionale. Un primo passo per raggiungere questi
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obiettivi è la preparazione di matrici allineate che guidino la giusta formazione e orientazione dei miotubi.
Per la preparazione delle strutture allineate sono state seguite le seguenti tappe:
1. utilizzo della photo-lithography per realizzare wafer in silicio con pattern desiderato
2. ottenimento della maschera di PDMS con stampo “negativo” rispetto al wafer 3. ottenimento dello scaffold con pattern desiderato in gelatina-genipina utilizzando come stampo la maschera di silicone
2.3.1 Preparazione del wafer in silicio con pattern desiderato
La Photo-Lithography è una tecnica di microfabbricazione generalmente adottata nel settore dell'Ingegneria Tessutale che utilizza le radiazioni UV per trasferire un pattern geometrico predefinito da una maschera “photo mask” ad un substrato opportunamente rivestito di un resina epossidica fotosensibile negativa detta “photoresist”. In questo lavoro di tesi, abbiamo realizzato delle corsie parallele di dimensioni diverse (50, 100, 150 um) e alte 40 um per indurre l’allineamento dei miotubi.
Wafer di silicio
Spin-coating del fotoresist
Esposizione agli UV tramite una maschera
Sviluppo del pattern
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Materiali
- Wafer in silicio - Photo mask
- Soluzione piranica, composta da H2SO4 E H2O2 in rapporto 1:3)(Sigma,
Milan, Italia)
- Fotoresist (SU-8-25; NANOTM SU-8)
- Soluzione developer (metossimetacrilato)
- Isopropanolo(Riedel de Haen, Seelze, Germany)
- Acetone (Sprint Chimica, Firenze, Italia) - Acqua deionizzata
- 3 coperchi pirex
- Piastra riscaldante a 70°C (P Selecta®, Plactronic) - Spin Coater
- Forno(P Selecta®, Digitheat)
- Lampada UV(CL 1000 Ultraviolet Crosslinker UVP)
- Cappa chimica
Procedura
La prima fase del protocollo[3] è stata la realizzazione della photo-mask. Il pattern desiderato ovvero canali dello spessore di 100 µm (bianco) e strutture sopraelevate dello spessore di 50 µm, 100 µm e 150 µm (nero) è stato creato con il programma Corel Draw e stampato su foglio lucido. Prima dell’avvio della prova è stata indispensabile la pulizia di della stanza per rimuovere eventuali granelli di polvere che potessero inficiare la corretta realizzazione del pattern, tramite ostruzione dei canali. La realizzazione del pattern desiderato su wafer di silicio è avvenuta seguendo il protocollo di soft-litografia “SU-8 2000 Permanent Epoxy
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bassa viscosità consente la realizzazione di pattern a bassa altezza, e per questo lavoro di tesi di strutture alte 40 um.
In primo luogo il substrato di silicio è stato pulito con lavaggi in soluzione piranica, successivamente risciacquato con acqua deionizzata e asciugato su piastra riscaldata a 70°C per almeno 15 minuti. L’asciugatura e il mantenimento sulla piastra assicurano la completa disidratazione del wafer, allo scopo di favorire l’adesione del
photoresist. A questo punto la soluzione di photoresist SU-8-25 è stata versata al
centro del wafer, fino ad occupare circa 30% della superficie disponibile e distribuita in maniera omogenea con Spin Coater. È stato impostato un primo step, di velocità di 500 rpm per 10 secondi e accelerazione di 100rpm/sec, per distribuire la soluzione di
photoresist sul wafer, ed un secondo step, atto ad omogeneizzare lo spessore, di
velocità di 2000 giri per 30 second. II wafer cosi ottenuti sono stati cotti tramite procedura di soft bake (cottura delicata) sulla piastra riscaldata a 70°C, per 15 minuti e successivamente nel forno a 100°C. Durante questa fase del processo è raccomandato l’uso di una piastra con un buon controllo termico e uniformità del piano. Al fine di ottenere il pattern realizzato sul wafer, la photo-mask è stata appoggiata sul wafer, e il pattern realizzato tramite esposizione alla lampada UV per 3 minuti e mezzo usando una radiazione al di sotto di 350nm. Durante questa fase solo il photoresis esposto agli UV viene impressionato e polimerizzato. A questo punto, il wafer è stato rimesso sulla piastra a 70°C per un minuto e poi per altri 4 minuti nel forno a 100°C.
Per la fase dello sviluppo sono stati preparati 3 contenitori in vetro pirex: nel primo è stata versata la soluzione di sviluppo o “developer”, costituita da un solvente metossimetacrilato, nel secondo l’isopropanolo e nell’ultimo acetone. I wafer sono stati messi per prima nella soluzione di sviluppo e mantenuti in agitazione lenta per 6 minuti. Questo passaggio detto di “sviluppo” serve a sciogliere il polimero non reticolato, cioè quello non esposto alla luce UV. Trascorso il tempo di sviluppo, i wafer sono stati spostati in isoprapanolo per circa 10 secondi, al fine di controllare
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che il polimero non reticolato sia stato del tutto eliminato. Infatti l’isopropanolo fa risaltare l’eventuale polimero sotto forma di un alone biancastro. Alla fine del processo è stato effettuato un lavaggio prima con acetone e successivamente con acqua e i wafer cosi realizzati sono stati rimessi sulla piastra a 70°C fino a completa asciugatura.
2.3.2 Preparazione dello stampo di PDMS
Per generare gli scaffold allineati si è deciso di utilizzare come stampo un materiale più maneggevole del silicio e si è quindi utilizzato il silicone per ottenere uno stampo con il pattern desiderato negativo. I vantaggi principali nell'utilizzo del PDMS consistono nella sua biocompatibilità, trasparenza e flessibilità.
Materiali
- PDMS monomero (Sylgard ®184)
- Catalizzatore (Sylgard ®184)
- Bicchiere e bacchetta di plastica
- Degasatore (Mazzali 20052)
- Pipetta p1000 (Gilson)
Procedura
Monomero e catalizzatore sono stati miscelati al buio in rapporto 10 a 1 in peso in un bicchiere di plastica con l’aiuto di una bacchetta. Il mescolamento è avvenuto con vigore per circa 5 minuti fino alla formazione di bolle, indice dell’inizio della reazione di polimerizzazione. Successivamente la miscela è stata messa sotto vuoto a degassare e la soluzione così ottenuta è stata versata sul wafer, opportunamente fissato con nastro biadesivo su un piatto di plastica. Per completare la preparazione, il wafer ricoperto di silicone è stato infornato per 6 ore a 70°C.
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2.3.3 Realizzazione dello scaffold di gelatina-genepina con pattern desiderato
L’ultima fase nella preparazione delle strutture allineate è rappresentata dalla realizzazione dello scaffold di gelatina genepina.
Materiali
- Gelatina (Sigma, Milan; Italia)
- Genepina (Sigma, Milan; Italia)
- Teflon spray (CRC, 300ml) - Scotch biadesivo - Piatto in plastica - Stampo di silicone - Becker - Termometro,magnete
- Stirrer (ARE Heating Magnetic Atirrer, Velp Scientifica)
- Bilancia analitica (Mettler AE 240)
Procedura
La soluzione di gelatina-genipina è stata preparata come in § 2.1.2 in due concentrazioni diverse, 3% gelatina e/o 4% gelatina cross-linkata con genipina allo 0,2% in peso rispetto al volume totale della soluzione. Lo stampo di silicone è stato pulito con acetone per eliminare ogni impurezza ed attaccato ad un piatto in plastica con l’aiuto dello scotch bioadesivo. Prima di versare la soluzione di gelatina– genepina e per favorirne il successivo distacco, del teflon spray è stato spruzzato sulla maschera di silicone. Una volta raggiunta la colorazione blu, la soluzione di gelatina è stata versata lentamente sul silicone e lasciata seccare a temperatura ambiente per facilitare il distacco dal silicone. In seguito le strutture sono state ritagliate, posizionate negli opportuni pozzetti delle multiwell e utilizzate per la semina delle cellule.
12 2.4 Preparazione degli scaffolds per la semina 2.4.1 Scaffold polimerici
Una fase importante della preparazione dei campioni ha riguardato la loro sterilizzazione. La sterilizzazione tramite gas plasma è una delle tecniche di
sterilizzazione fra le più avanzate e consiste nell’applicazione di perossido d’idrogeno allo stato gassoso in presenza di un forte campo elettrico. Questa porta il perossido allo stato di plasma strappandone gli elettroni e generando radicali liberi. I radicali hanno un’alta capacità germicida andando a danneggiare notevolmente le
membrane cellulari. Il vantaggio è dovuto al fatto che si può preservare la sterilità fino a dodici mesi. Il gas plasma è molto promettente in quanto: assolutamente non tossico (genera solo acqua e ossigeno); ha una temperatura operativa molto bassa, intorno ai 40-45°C; può essere utilizzato in pratica su ogni materiale, tranne alcune stoffe e composti in grado di assorbire il perossido.
Materiali
- gas plasma
- anellini in teflon
Una volta ottenuti i film polimerici, essi sono stati tagliati in quattro parti e sterilizzati mediante gas-plasma. A questo punto, sotto cappa biologica i filmini sono stati posizionati nei pozzetti di una multiwell da 24, tenuti sul fondo del pozzetto per mezzo di anellini di teflon. Si è quindi proceduti alla semina.
2.4.2 Scaffolds naturali
Tale procedura è stata applicata agli scaffold naturali come tali, che con pattern.
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- Polimeri di gelatina-genepina come § 2.1.2 o § 2.3.3
- Tampone PBS - Etanolo 70% - Multiwell da 24 - Vetrini di diametro 6 mm - Anellini in teflon - Pipetta p1000 e p200 (Gilson) - Cappa biologica - Incubatore Procedura
All’interno delle multiwell da 24 sono stati posizionati i vetrini circolari sterilizzati con gas plasma o alternativamente in etanolo 70% e successivamente flambati. Le soluzioni di gelatina-genipina sono state preparate come riportato nel paragrafo § 2.1.2 ma in condizioni sterili, ovvero sotto cappa a flusso laminare sterile. Una volta raggiunta la colorazione blu, 120 μl di soluzione di gelatina-genepina sterile, sono stati depositati in ogni pozzetto al centro del vetrino. I campioni sono stati lasciati polimerizzare per 48 ore in incubatore e successivamente idratati in PBS. Le strutture allineate invece sono state ritagliate e posizionate nei pozzetti della multiwell da 24 con sopra gli anellini in teflon.
A questo punto si è proceduto alla sterilizzazione tramite bagno in etanolo 70% per tutta la notte e successivamente i campioni sono stati risciacquati per tre volte con PBS per eliminare l’eccesso di etanolo. Alla fine le strutture sono state esposte agli UV per 15-30 min e equilibrate per tutta la notte con terreno di coltura (§ 2.5.1) prima della semina.
14 2.5 Metodi di Sperimentazione Cellulare
2.5.1 Propagazione e mantenimento delle colture
Per questo tipo di studio sono state utilizzate cellule C2C12 , linea cellulare di mioblasti murini. Le cellule C2C12 sono state originariamente ottenute da Yaffe e Saxel attraverso il passaggio seriale di mioblasti in coltura dal muscolo della coscia di topi C3H dopo una lesione da schiacciamento[1]. Queste cellule sono in grado di differenziare e sono uno strumento utile per studiare il differenziamento dei mioblasti, la loro espressione proteica e/o per esplorare percorsi meccanicistici.
Materiali
- Terreno completo DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), contenente
glucosio (4.5 g/l) ed addizionato di:
siero fetale bovino (FCS), scomplementato per un’ora a
56°C, per una concentrazione finale del 20% (Sigma-Aldrich, St Louis; USA)
L-glutammina 0.2 M (Lonza; Belgia)
soluzione di penicillina (10.000 U/ml) e streptomicina (10
mg/ml) (Sigma-Aldrich, St Louis; USA)
amminoacidi non essenziali (Sigma-Aldrich, St Louis; USA)
- Tampone PBS sterile, privo di Ca2+ e Mg2+
- Soluzione di tripsina 0.5 % e EDTA 0,2%
- Fiasche per colture cellulari (Falcon)
- Cappa a flusso laminare
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Procedura
Per la propagazione si è proceduto lavando le piastre con PBS, quindi incubando il monostrato cellulare per 1-2 minuti con 1.5 ml di soluzione tripsina-EDTA, allo scopo di permettere il distacco delle cellule dal fondo della fiasca. L’azione dell’enzima è stata bloccata aggiungendo 5 ml di terreno DMEM completo, quindi la sospensione cellulare è stata risospesa energicamente in modo da disaggregare gli eventuali ammassi cellulari. Le cellule sono state piastrate in una nuova fiasca contenente DMEM completo per un volume finale di 10 ml e mantenute in
incubatore a 37 °C e 5% CO2.
2.5.2 Congelamento e scongelamento delle cellule.
Il congelamento permette la conservazione delle cellule per lunghi periodi di tempo e la successiva riespansione della coltura preservandone la vitalità cellulare e le proprietà biologiche.
Materiali
- terreno DMEM completo (§ 2.5.1)
- terreno completo DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), contenente glucosio (4.5 g/l) ed addizionato di:
siero fetale bovino (FCS), scomplementato per un’ora a 56°C,
per una concentrazione finale del 20% (Sigma, Milan; Italia)
L-glutammina 0.2 M (Lonza; Belgia)
soluzione di penicillina (10.000 U/ml) e streptomicina (10
mg/ml) (Sigma-Aldrich, St Louis; USA)
amminoacidi non essenziali (Sigma-Aldrich, St Louis; USA)
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- PBS sterile, privo di Ca 2+ e Mg 2+
- siero fetale di bovino (FCS), scomplementato per un’ora a 56°C
- dimetilsolfossido (DMSO)
- provette per congelamento Cryovials (Falcon)
- provette da 15 ml (Falcon)
- pipette pasteur sterili
Procedura
Le cellule sono state lavate con PBS e trattate per 2 minuti con 1.5 ml di soluzione tripsina-EDTA. Dopo aver bloccato l’azione della tripsina aggiungendo 5 ml di terreno DMEM completo, le cellule sono state trasferite in una provetta da 15 ml e centrifugate per 3 minuti a 1000 rpm. Il sedimento cellulare, privato del surnatante, è stato risospeso in 750 ul di terreno DMEM completo addizionato di 400 µl di FCS e 100 µl di DMSO. La sospensione cellulare è stata poi aliquotata nell’apposita cryovial, raffreddata a -20°C per un’ora e successivamente trasferita a -80°C.
Per lo scongelamento, è necessario riscaldare rapidamente la cryovial a 37°C e seminare la sospensione cellulare in una fiasca contenente 10 ml di terreno DMEM completo.
2.5.3 Semina delle cellule, crescita e differenziamento
Una volta arrivate ad una confluenza 80-90%, le cellule sono state staccate con l’aiuto della tripsina,contate mediante camera di Burker e seminate sui diversi campioni.
Materiali
- Cellule a confluenza 80-90% nelle fiasche da 75cm2
- Pipette pasteur sterili
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- Soluzione di tripsina 0.5 % e EDTA 0.2 %
- Terreno DMEM completo (§ 2.5.1)
- Terreno di differenziamento costituito da terreno completo DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle Medium), contenente glucosio (4.5 g/l) ed addizionato di:
siero di cavallo (HS), per una concentrazione finale del 2%
(Sigma-Aldrich, St Louis; USA)
L-glutammina 0.2 M
soluzione di penicillina (10.000 U/ml) e streptomicina (10
mg/ml) (Sigma-Aldrich, St Louis; USA)
amminoacidi non essenziali (Sigma-Aldrich, St Louis; USA)
- Multiwell da 96
- Soluzione Triptan Blue - Camera di Burker
- Multiwell da 24 preparate in precedenza con i polimeri naturali/sintetici (§2.1.1;
§2.1.2, §2.3)
- Pipetta a volume variabile (Gilson)
Procedura
Dalla coltura cellulare (monostrato) giunta a confluenza, è stato eliminato il terreno mediante aspirazione con pasteur. La fiasca è stata lavata con 2-3 ml di PBS per eliminare i residui del terreno di coltura e successivamente è stato introdotto 1 ml di soluzione di tripsina-EDTA e lasciato agire per 5 minuti scuotendo la fiasca per favorire il distacco delle cellule dal fondo passati. Dopo aver bloccato l’azione della tripsina aggiungendo 5 ml di terreno DMEM completo, le cellule sono state trasferite in una provetta da 15 ml e centrifugate per 5 minuti a 900 rpm. Successivamente il sovranatante è stato aspirato e sostituito con 3 ml di terreno nuovo. Le cellule sono state risospese bene in modo da disaggregare eventuali agglomerati cellulari, e si è proceduti alla conta.
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50μl della sospensione cellulare sono stati addizionati a 50 μl di soluzione Triptan Blue all’interno di una pozzetto di una multiwell da 96. Dopo aver spipettatto bene sono stati prelevati 10 μl e contati con camera di Burker. Sulla superficie del vetrino della camera di conta è inciso un reticolo quadrettato di cui è nota l’area di ogni riquadro. Dato che lo spessore tra il reticolo e il vetrino è noto, è possibile conoscere il volume di sospensione cellulare contenuta in ogni riquadro. Il reticolo è costituito da 9 quadrati delimitati da tre righe, ciascuno dei quali è a sua volta suddiviso da 16 riquadri delimitati da due righe. Al microscopio si conta il numero di cellule presenti in almeno tre quadrati delimitati da tre righe, situati in diagonale, escludendo le cellule presenti nella porzione di superficie di due lati di ogni riquadro del reticolo delimitati da tre righe. Si calcola il numero medio di cellule che viene diviso per 4 e moltiplicato per 20000. Si ottiene un numero che corrisponde a milioni di cellule presenti in un millilitro e conoscendo il volume finale della sospensione di cellule da cui si è prelevato il campione di 50 μl si può sapere la quantità totale di cellule presenti.
Sono state seminate 10000 cellule/cm2 per i diversi campioni; differentemente
sono state seminate 45000 cellule/cm2 su strutture allineate. Il terreno è stato cambiato ogni 2 giorni. Per gli studi di differenziamento, una volta raggiunta una confluenza dell’80-90%, il terreno di cultura è stato sostituito con quello di differenziamento, cambiato ogni due giorni e per una durata complessiva di 10-14 giorni.
2.6 Test cellulari 2.6.1 Alamar blue test
Il saggio Alamar fornisce un metodo fluorimetrico per stimare il numero di cellule vitali. Esso utilizza il colorante resazurina per misurare la capacità metabolica di cellule, che è un indicatore della loro vitalità cellulare. Cellule vitali mantengono la
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capacità di ridurre resazurina in resorufina, che è altamente fluorescente (emette a
lunghezza d’onda 580-590 EM nm). Cellule non vitali perdono rapidamente la capacità
metabolica, non riducono l’indicatore colorante, e quindi non generano un segnale fluorescente. La fluorescenza prodotta è proporzionale al numero di cellule vitali.
Per questo lavoro di tesi, tale saggio è stato effettuato a 1, 2, 3 e 7 giorni dalla semina per gli scaffold naturali e a 2 giorni per quelli polimerici. Esso fornisce informazioni sulla vitalità cellulare e sulla crescita cellulare, e aiuta a valutare la biocompatibilità con delle strutture utilizzate.
Materiali
- Terreno DMEM completo (§ 2.5.1)
- Soluzione Alamar (The CellTiter-Blue®,Promega,Italia)
- Multiwell da 96
- Pipetta p1000, p100 (Gilson)
- Puntali sterili
- Spettrofluorimetro (Omega)
Nei giorni prestabiliti a partire dalla semina il mezzo è stato rimosso da tutti i campioni (compresi il controllo e il bianco) e sostituito con 500 µl di nuovo terreno completo addizionato della soluzione Alamar in quantità pari al 10% del volume di terreno aggiunto (50µl). La multiwell è stata rimessa nell’incubatore, e a 30 minuti e a 2ore e mezza dall’aggiunta dell’Alamar, con spettrofluorimetro è stata registrata la fluorescenza di 100 µl di terreno prelevato dai singoli campioni.
2.7 Microscopia a fluorescenza
Il microscopio a fluorescenza permette lo studio di preparati naturamente fluorescenti o resi fluorescenti con particolari coloranti, detti fluorocromi, o legati con molecole fluorescenti. Attualmente l’uso più diffuso prevede l’utilizzo di anticorpi specifici legati a fluorocromi, molecole capaci di emettere radiazioni
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elettromagnetiche con una lunghezza d’onda maggiore rispetto a quella di assorbimento, dando origine al fenomeno della fluorescenza. Nell caso dell’immunofluorescenza indiretta, usata in questo lavoro di tesi, l’anticorpo primario non marcato si lega in maniera specifica all’antigene formando l’immunocomplesso. A questo punto la porzione Fc (Fragment costant) dell’anticorpo primario facente parte dell’immunocomplesso viene riconosciuto da un anticorpo secondario marcato. Il riconoscimento dell’antigene dà quindi luogo alla marcatura fluorescente.
2.7.1 Preparazione dei vetrini per la fluorescenza.
Il fissaggio permette di bloccare i processi vitali delle cellule nelle condizioni in cui si trovavano in quel dato momento e garantisce il mantenimento dell’integrità delle loro strutture. I metodi generalmente più usati per fissare prevedono l’utilizzo di paraformaldeide (PFA) 4% o metanolo e acetone in rapporto 1:1. In particolar modo la PFA è in grado di indurre legami covalenti tra il gruppo aldeidico e i gruppi amminici delle proteine, come lisina e arginina.
Materiali - Paraformaldeide (PFA) al 4% - Tampone fosfato - Multiwell da 24 - Cappa chimica Procedura
Al termine dei trattamenti, il terreno è stato opportunamente rimosso e le cellule sono state prima lavate con PBS e successivamente fissate per 15 minuti a temperatura ambiente con PFA 4%. Allo scadere del tempo sono state lavate per due volte con PBS e conservate alla temperatura di 4 °C.
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2.7.2 Analisi dell’andamento di crescita cellulare
Successivamente all’analisi metabolica indiretta effettuata tramite Alamar test, le stesse strutture sono state fissate e marcate nel nucleo per valutare la crescita cellulare nei diversi tempi selezionati. Il marcatore Hoechst si intercala nel DNA, viene eccitato dai raggi UV (350nm) ed emette al massimo nel blu con una lunghezza d’onda pari a 461nm.
Materiali
- Marcatore nucleare Hoechst 33258 (Sigma)
- Glicerolo 50% in PBS
- Tampone PBS
- Cameretta umida
- Timer
- Vetrini portaoggetto per microscopia, 24 mm di diametro (BDH)
- Microscopio a fluorescenza con videocamera Olympus IX
Procedura
Le strutture fissate in precedenza sono state lavate con PBS e incubate in cameretta umida con il marcatore Hoechst 33258 ad una concentrazione 1μg/ml per dieci minuti. I vetrini sono stati dunque lavati velocemente con PBS e montati sui vetrini portaoggetto con 10 µl di glicerolo50%.
Per avere una stima del numero di cellule adese sul materiale è stato valutato il numero di cellule presenti per unità di superficie nei diversi tempi considerati.
2.7.3 Analisi del comportamento dei mioblasti sugli scaffolds
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A cinque giorni dalla semina, è stato valutata l’influenza del pattern sull’orientamento e sulla forma dei singoli nuclei. Ciascun nucleo è stato associato ad un ellisse e per ciascuno è stato calcolato l’angolo di allineamento, definito come l'orientamento dell'asse maggiore rispetto all’asse di orientamento della struttura utilizzando una delle funzioni del software ImageJ. Tutti gli angoli di allineamento nucleare sono stati poi normalizzati rispetto all'orientamento nucleare preferito, definito come la media di orientamento di tutti i nuclei per campione, e raggruppati in incrementi di 10° rispetto all'orientamento nucleare preferito da un valore di 0° ad un valore di 90°. Tutte le cellule con angolo di allineamento entro i 10° sono state ritenute effettivamente allineate.
Inoltre, per valutare l’influenza sulla morfologia, è stato calcolato la circolarità di ogni singolo nucleo, ovvero l'allungamento nucleare (circolarità=4*π*
area/perimetro2) con un indice di forma 1 rappresentante un cerchio.
2.7.3.2 Analisi del differenziamento
Per valutare l’effettivo allineamento dei mioblasti differenziati sulle strutture allineate, ci si è avvalsi dell’utilizzo di marcatori specifici dell’apparato contrattile dei mioblasti, come l’actina e la desmina. Tali analisi sono state svolte sui miotubi a 7-10 giorni di coltura.
Materiali
- Colture cellulari piastrate su vetrino
- Goat serum (GS) 10% in PBS
- Marcatore nucleare Hoechst 1:100 (33258, Sigma)
- Anti phallodin green(Alexa Fluor®488) 1:200
- Anticorpo primario, in 5% GS in PBS
anti-desmina (D1033, Sigma), mouse, 1:500 - Anticorpo secondario, in 5% GS in PBS
23 anti-mouse CY5(C1117,Sigma), 1:1000 - Tampone PBS - Glicerolo 50% in PBS - Vetrini portaoggetto - Coperchio pirex - Carta - Parafilm
- Microscopio a fluorescenza (Olympus IX)
Procedura
Le strutture da analizzare con i miotubi sono state messe all’interno di una cameretta umida, permeabilizzate con triton 0,5% in PBS per cinque minuti e quindi trattate per 30 minuti con la soluzione di blocco per i siti aspecifici di legame, costituita da PBS contenente 10% goat serum GS. Le strutture sono state successivamente incubate con gli anticorpi primari overnight alla temperatura di 4 °C. Per eliminare l’eccesso di anticorpo primario sono stati effettuati tre lavaggi di 5 minuti ognuno con PBS e successivamente la struttura è stata incubata con la soluzione contenente gli anticorpi secondari in 5% GS per un ora a temperatura ambiente e al buio. Sono stati svolti 3 successivi risciacqui con PBS e per ultima è stata aggiunto ’anticorpo anti-phalloidina e incubato per 30 min. Dopo lavaggio con PBS, il campione è stato montato su vetrino porta oggetto con una goccia di glicerolo 50% e fermato con smalto.
Le immagini dei miotubi sono state acquisite al microscopio confocale ed è stato valutato l’angolo di orientamento di ciascun miotubo rispetto alla struttura. La sorgente luminosa del microscopio confocale è costituita da uno o più laser, generalmente a semiconduttore, per ogni diversa frequenza di eccitazione richiesta. Il meccanismo di direzione del fascio luminoso viene gestito da sistemi
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computerizzati. Le immagini ottenute, sincronizzando col fascio di eccitazione il dispositivo di rivelazione, sono particolarmente definite e possono permettere di evidenziare con differenti colori le diverse molecole presenti nel preparato, permettendo di apprezzarne la tridimensionalità.
2.8 Analisi statistiche
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplo. Tutti i dati raccolti sono stati tabulati e analizzati in maniera statistica e per ciascun esperimento è stato calcolato il valore medio, la deviazione standard e l’errore standard. Infine, per valutare la significatività statistica dei risultati, i dati sono stati confrontati mediante il test T di Student; l'aumento dell'incidenza del dato analizzato è stato considerato significativo per valori di p<0,05.
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