SCOPO DEL LAVORO
Obiettivo della nostra ricerca è lo sviluppo di un vaccino antitumorale, basato sulla combinazione di DNA, vettori virali ed immunomodulatori, verso tre antigeni che ricoprono un ruolo importante nella progressione del tumore e che risultano fortemente espressi su vari tipi di cellule tumorali: HER2, CEA e TERT. La strategia di vaccinazione prevede: 1) priming (prima immunizzazione) con il DNA plasmidico esprimente l'antigene, iniettato mediante elettroporazione; 2) boost (richiamo) con un vettore adenovirale replicazione-difettivo e codificante per lo stesso antigene, in grado di indurre una forte risposta immune sia umorale sia cellulo-mediata; 3) una serie di iniezioni, alternate con quelle di DNA ed adenovirus, di un ligando del recettore Toll-like 9 (TLR9 agonist) detto IMO, utilizzato come adiuvante del vaccino nell'induzione di una risposta immune.
La prima parte della nostra ricerca ha riguardato lo sviluppo di un vaccino anti-HER2. Il gene umano HER2 (neu nel ratto) codifica per ErbB2, recettore transmembrana della famiglia dei recettori del fattore di crescita epidermale EGF. Il modello preclinico da noi utilizzato è stato quello dei neuT, un ceppo di topi Balb/c ingegnerizzati per iper-esprimere la forma attivata dell’oncogene ratneu/HER2 posto sotto il controllo del promotore del virus del tumore mammario di topo (MMTV) e quindi prevalentemente espresso nelle ghiandole mammarie96,97. Infatti, alla terza settimana di vita, nei topi BALB/neuT femmina, si sviluppano rapidamente tumori nelle ghiandole mammarie, e questa tumorigenesi spontanea è molto simile allo sviluppo del tumore al seno umano. Inoltre in questi topi, il sistema immunitario riconosce neu come un antigene self quindi la tolleranza verso neu impedisce che si sviluppi una risposta immune. La strategia di immunizzazione ha previsto uno studio profilattico e due studi di tipo terapeutico. Nel primo caso sono state effettuate delle iniezioni di DNA plasmidico codificante per ratneu, in topi femmina alla decima e dodicesima settimana di vita (in cui non c’è ancora traccia evidente del tumore) ed in seguito una serie di iniezioni di adiuvante. Negli studi terapeutici, la combinazione di vaccino (DNA-EP) ed adiuvante è stata somministrata a partire dalla tredicesima settimana, ossia quando i topi presentano tumori misurabili delle ghiandole mammarie, sia in presenza che in assenza di adenovirus.
Nella seconda parte della nostra ricerca, abbiamo cercato di estendere le osservazioni fatte nel modello HER2 ad un vaccino per hCEA. La proteina umana di CEA è un membro della superfamiglia delle immunoglobuline e fa parte di un gruppo di molecole di adesione (famiglia CEA) espresse di norma sulla superficie delle cellule del tratto gastro-intestinale. Questo antigene viene spesso utilizzato come marcatore tumorale a causa della sua maggiore espressione in diversi tipi di tumore (epitelio del tratto gastro-intestinale, polmone, tiroide, seno, prostata e ovaio). Il modello preclinico da noi utilizzato è quello dei topi CEA.tg, ossia topi transgenici ingegnerizzati per esprimere la proteina umana di CEA, che viene quindi riconosciuta come un antigene di tipo self98. La strategia di immunizzazione di questi topi ha previsto una serie di iniezioni di DNA-EP ed adenovirus esprimenti hCEA per un gruppo e la combinazione di vaccino genetico e adiuvante per un altro gruppo. In una seconda serie di esperimenti, sono stati immunizzati con un vaccino peptidico, consistente in un nonamero immunoreattivo di hCEA, topi CEA.Tg e topi doppi transgenici per hCEA e l'HLA umano (HHD/CEA). Inoltre ad alcuni di questi gruppi sono stati somministrati l'adenovirus esprimente hCEA e l’adiuvante, in modo da poter valutare quale protocollo di vaccinazione inducesse la migliore risposta immune.
Nell’ultima parte della nostra ricerca, ci siamo concentrati sullo sviluppo di un vaccino contro TERT. La telomerasi è una ribonucleoproteina costituita da una componente a RNA e da una subunità catalitica, detta Telomerase Reverse Transcriptase, ed ha la funzione di mantenere la lunghezza dei telomeri posti alle estremità dei cromosomi. Ad ogni ciclo cellulare, infatti, la lunghezza dei cromosomi tende ad essere ridotta, e questa è una delle cause di senescenza cellulare. La telomerasi previene l’accorciamento dei telomeri e in questo modo permette alle cellula di sfuggire al processo di normale senescenza e quindi di diventare immortale. Nel tessuto umano e nelle normali colture cellulari, resta inattiva o viene espresso a bassi livelli e in maniera transitoria. Di conseguenza, dato che conferisce capacità replicativa illimitata alla cellula ed è stata rilevata in più dell’85% dei tumori, la telomerasi è un potenziale antigene universale per lo sviluppo di un vaccino tumorale. In una prima serie di esperimenti, è stata misurata la risposta immune e l’effetto antitumorale nel modello dei topi C57BL/6 vaccinati con DNA plasmidico e adenovirus, entrambi esprimenti l’antigene TERT murino, in combinazione con l’immunomodulatore. Al fine di definire al meglio l’attività immunostimolatoria dell’adiuvante in presenza o assenza del vaccino, è stato poi caratterizzato il meccanismo
d’azione del vaccino e dell’immunomodulatore nel modello del melanoma e del carcinoma renale murino.
Infine, dato che l’efficacia delle immunoterapie contro il cancro ad oggi sperimentate dipende fortemente dai modelli preclinici utilizzati, ad oggi per lo più roditori, e soffre della mancanza di animali più grandi quali modelli terapeutici più adatti, ci siamo rivolti al modello del cane per testare il vaccino contro la telomerasi. La scelta di questo modello dipende da vari fattori. In primo luogo, diversi studi hanno dimostrato l’esistenza di notevoli somiglianze tra l’uomo ed il cane per quanto concerne l’evoluzione e le caratteristiche generali tumorali99,100. Inoltre, la telomerasi canina condivide una maggiore omologia di sequenza con la forma umana rispetto a quella murina, e risulta espressa in più del 90% dei tumori di cane101. A tal proposito, è stato testata, sul modello del linfoma canino, l’efficacia del vaccino contro la telomerasi canina, basato su DNA ed Adenovirus, nell’induzione di una forte risposta immune e soprattutto di un effetto antitumorale.
