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2.5.a Microiniezioni

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Academic year: 2021

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Materiali e Metodi

2.5.a Microiniezioni

Per gli esperimenti di microiniezione sono stati utilizzati embrioni pigmentati, in cui è possibile distinguere, allo stadio di 4-8 cellule, il polo animale da quello vegetativo e i blastomeri dorsali da quelli ventrali. Al momento della microiniezione, gli embrioni degellificati, vengono trasferiti in una piccola piastra Petri, sul fondo della quale è fissata una reticella di plastica, con maglie di circa 1 mm, che ne limita gli spostamenti durante la microiniezione.

Gli embrioni sono immersi in una soluzione di Ficoll al 4 % (peso/volume) sciolto in 0,1 X MMR. Il Ficoll è piuttosto viscoso e permette agli embrioni di mantenere la forma sferica durante la fase di iniezione, limitando, inoltre, la perdita di citoplasma dal sito dell’ iniezione.

Gli embrioni microiniettati sono lasciati sviluppare in 0,1 X MMR-4 % Ficoll nelle prime ore dopo l’iniezione e poi trasferiti in 0,1 X MMR.

Quando gli embrioni di controllo raggiungono lo stadio desiderato, si fissano controlli ed iniettati e si conservano in MtOH oppure in EtOH assoluto a – 20 °C.

Le microiniezioni sono state eseguite con un microiniettore Drummond Nanoject, che consente l’ iniezione di volumi tra 4,6 nl e 73,6 nl ad incrementi discreti di 4,6 nl. L’iniettore è dotato di un micromanipolatore che ne permette lo spostamento macrometrico nelle tre dimensioni e di un movimento micrometrico lungo una direzione predefinita.

Gli aghi sono preparati per tiratura da capillari forniti da Drummond. Prima di essere montato sul microiniettore, l’ ago deve essere riempito di olio minerale. Il caricamento dell’ RNA da microiniettare è eseguito per aspirazione dal microiniettore stesso. In generale, vengono caricati nell’ ago 2,5-3 µl di soluzione.

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